Одноклеточная электропорация по различным органотипическим культурам срезов возбуждающих и специфических для класса тормозных нейронов гиппокампа мыши

Резюме

Здесь представлен протокол для одноклеточной электропорации, который может доставлять гены как в возбуждающие, так и в тормозные нейроны в диапазоне возрастов культуры среза гиппокампа in vitro. Наш подход обеспечивает точную и эффективную экспрессию генов в отдельных клетках, которая может быть использована для изучения клеточных автономных и межклеточных функций.

Аннотация

Электропорация зарекомендовала себя как критический метод передачи определенных генов в клетки для понимания их функции. Здесь мы описываем метод одноклеточной электропорации, который максимизирует эффективность (~ 80%) трансфекции гена in vitro в возбуждающих и специфических для класса тормозных нейронах в органотипической культуре среза гиппокампа мыши. Используя большие стеклянные электроды, тетродотоксинсодержащую искусственную спинномозговую жидкость и мягкие электрические импульсы, мы доставили ген, представляющий интерес, в культивируемые пирамидные нейроны ГИПпокампа CA1 и тормозные интернейроны. Кроме того, электропорация может проводиться в культивированных срезах гиппокампа до 21 дня in vitro без снижения эффективности трансфекции, что позволяет изучать различные стадии развития культуры срезов. С ростом интереса к изучению молекулярных функций генов в различных типах клеток наш метод демонстрирует надежный и простой подход к трансфекции генов in vitro в ткани мозга мыши, который может быть выполнен с помощью существующего электрофизиологического оборудования и методов.

Введение

В молекулярной биологии одним из наиболее важных соображений для исследователя является то, как доставить ген, представляющий интерес, в клетку или популяцию клеток, чтобы прояснить его функцию. Различные способы доставки могут быть классифицированы как биологические (например, вирусный вектор), химические (например, фосфат кальция или липиды) или физические (например, электропорация, микроинъекция или биолистика)1,^2. Биологические методы очень эффективны и могут быть специфичными для типа клеток, но ограничены разработкой конкретных генетических инструментов. Химические подходы очень сильны in vitro, но трансфекции, как правило, случайны; кроме того, эти подходы в основном зарезервированы только для первичных клеток. Из физических подходов биолистика является самой простой и легкой с технической точки зрения, но опять же дает случайные результаты трансфекции при относительно низкой эффективности. Для применений, которые требуют переноса в конкретные клетки без необходимости разработки генетических инструментов, мы смотрим на одноклеточную электропорацию^3,4.

В то время как электропорация раньше относится только к полевой электропорации, за последние двадцать лет были разработаны множественные протоколы электропорации in vitro и in vivo с одной ячейкой для повышения специфичности и эффективности^5,6,7,демонстрируя, что электропорация может использоваться для переноса генов в отдельные клетки и, следовательно, может быть чрезвычайно точной. Однако процедуры технически сложны, трудоемки и относительно неэффективны. Действительно, более поздние работы исследовали целесообразность механизированных электропорационных установок^8,9,которые могут помочь устранить некоторые из этих барьеров для исследователей, заинтересованных в установке такой робототехники. Но для тех, кто ищет более простые средства, проблемы с электропорацией, а именно гибель клеток, отказ трансфекции и засорение пипетки, остаются проблемой.

Недавно мы разработали метод электропорации, который использует стеклянные пипетки с большим наконечником, более мягкие параметры электрического импульса и уникальный этап циклического давления, который генерировал гораздо более высокую эффективность трансфекции в возбуждающих нейронах, чем предыдущие методы, и позволил нам впервые трансфектировать гены в ингибирующих интернейронах, включая соматостатин-экспрессирующие ингибирующие интернейроны в области гиппокампа CA1 органотипической культуры срезов мыши^10. Однако надежность этого метода электропорации в различных ингибирующих типах интернейронов и стадиях развития нейронов не была рассмотрена. Здесь мы продемонстрировали, что этот метод электропорации способен трансфектировать гены как в возбуждающие нейроны, так и в различные классы интернейронов. Важно отметить, что эффективность трансфекции была высокой независимо от дней in vitro (DIV) среза культуры, проверенных возрастом. Этот установленный и удобный для пользователя метод настоятельно рекомендуется любому исследователю, заинтересованному в использовании одноклеточной электропорации для различных типов клеток в контексте ткани мозга мыши in vitro.

протокол

Все протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинской школе Массачусетского университета. Подготовка культуры среза, плазмидная подготовка и электропорация также подробно описаны в наших ранее опубликованных способах и могут быть упомянуты для получения дополнительной информации^10.

1. Приготовление культуры нарезок

1. Подготовьте органотипические культуры срезов гиппокампа мышей, как^{описано ранее 11,}используя постнатальных 6-7-дневных мышей любого пола.
   1. Готовят рассеченную жиму для олово-лепетровых культур, состоящих из (в мМ): 238 сахарозы, 2,5 ККл,_{1 CaCl2,}4 MgCl2, 26 NaHCO_3,1 NaH2 PO₄и 11 глюкозы в деионизированной воде, затем газ с 5% CO_2/95%O₂ до рН 7,4.
   2. Готовят органотипическую культурную среду, состоящую из: 78,8% (v/v) минимальной основной среды Eagle, 20% (v/v) конской сыворотки, 17,9 мМ NaHCO_3,26,6 мМ глюкозы, 2 M CaCl_2,2 M MgSO_4,30 мМ HEPES, инсулина (1 мкг/мл) и 0,06 мМ аскорбиновой кислоты, рН с поправкой на 7,3. Отрегулируйте осмолярность до 310-330 осмоль с помощью осмометра.
   3. Рассеките гиппокампы из всего мозга с помощью двух шпательных ран и нарежьте (400 мкм) с помощью измельчителя тканей. Отделяют срезы с помощью двух щипцов и переносят на 30 мм ячеек культуры в 6-ю скважинную пластину, заполненную культуральная среда (950 мкл) под вставками.
2. Храните олово-ломоорганические культуры в инкубаторе тканевых культур (35°C, 5% CO₂₎и меняйте питательную муть среза каждые два дня.

2. Плазмидный препарат

1. Подготовьте плазмиду для интересуящая гена.
   1. Субклон усиленный ген зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в вектор pCAG.
   2. Очистите плазмиду pCAG-EGFP с помощью набора для очистки без эндотоксинов и растворите во внутреннем растворе, который состоит из воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, содержащей 140 мМ K-метансульфоната, 0,2 мМ EGTA, 2 мМ MgCl₂и 10 мМ HEPES, скорректированную до рН 7,3 с KOH (концентрация плазмиды: 0,1 мкг/мкл).

3. Подготовка стеклянной пипетки

1. Вытягиваем боросиликатные стеклянные пипетки (4,5 – 8 МОм) на съемник микропипетки(рисунок 1А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные пипетки, используемые для записи зажимов для целых ячеек, идеально подходят для электропорации.
2. Выпекайте стеклянные пипетки на ночь при 200°C для стерилизации.
3. Проверьте размер наконечника пипетки под рассеченным микроскопом, чтобы приблизиться к электрическому сопротивлению.
   1. Опционально: Проверьте сопротивление пипетки, присоединив пипетку к электроду электрода электрода и используйте микроманипулятор для маневрирования наконечником пипетки в стерилизованную фильтром искусственную спинномозговую жидкость (aCSF), содержащую (в мМ): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl_2,5 MgCl_2,26 NaHCO_3,1₂PO₄ и 11 глюкозу в деионизированной воде, отравленную газом 5% CO₂/95% O₂ до рН 7,4. Подтвердите фактическое сопротивление с помощью считывания на электропораторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чем острее наконечник пипетки, тем больше электрическое сопротивление. Сопротивление пипетки должно быть ниже 10 МОм. Стеклянные пипетки с высоким сопротивлением пипетки(рисунок 1B)часто засоряются на наконечнике во время повторной электропорации.

4. Установка электропорационной установки

1. Установите электропоратор на стандартную цельноячечную электрофизиологическую установку, оснащенную вертикальным микроскопом, установленным на повязочном столе с микроманипулятором и перистальтическим насосом.
2. Установите головную часть электропоратора на микроманипулятор и подключите пару динамиков к электропоратору. Подключите электропоратор к ножной педали, которую можно использовать для отправки импульса, когда она будет готова.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Динамики издают тон при включении, который является индикатором электрического сопротивления на электроде. Это дает возможность определить относительные изменения сопротивления, не оттягивая внимания от процедуры.

5. Электропорационный препарат

1. Переложите срезовые вставки с 6 пластин скважины на 3 см чашки Петри, загруженные 900 мкл культурального носителя, и храните в настольном инкубаторе CO₂ до готовности к выполнению электропорации.
   1. Вставки для предварительной культуры с ломтикой (1 мл) в течение не менее 30 мин в чашке Петри 3,5 см для культивирования ломтиков после электропорации.
2. Очистите и подготовьте установку к электропорации.
   1. Перфьируйте линии 10% отбеливателем в течение 5 мин, чтобы стерилизовать трубку и камеру перед началом эксперимента в течение дня.
   2. Прополняйте линии деионизированной автоклавной водой не менее 30 минут, чтобы полностью промыть.
   3. Перфьюзируйте линии фильтруемо-стерилизованным aCSF, содержащим 0,001 мМ тетродотоксина (TTX).
      ПРИМЕЧАНИЕ: TTX минимизирует клеточную токсичность и смерть из-за перевозбуждения интернейронов^10.
3. Задайте параметры импульса электропоратора: амплитуда –5 В, квадратный импульс, поезд 500 мс, частота 50 Гц и ширина импульса 500 мкс.
4. Наполните стеклянную пипетку 5 мкл плазмидсодержащего внутреннего раствора.
   1. Удалите все захваченные пузырьки воздуха с наконечника пипетки, щелкнув и осторожно постукивая по наконечнику несколько раз.
   2. Проверьте наконечник на наличие повреждений, визуализируя его под рассеченным микроскопом или повторив шаг 3.3.1, чтобы проверить сопротивление пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если наконечник поврежден, стеклянная пипетка должна быть выброшена, и этот шаг должен быть повторен с новой стеклянной пипеткой, предварительно подготовленной на этапе 3.
5. Надежно прикрепите наконечник пипетки к электроду и включите динамики. Запишите показания (сопротивление пипетки) электропоратора, когда наконечник соприкоснется со средой aCSF.
6. Нарежьте мембрану вставки культуры острым лезвием и изолируйте один срез культуры. Аккуратно перенесите культуру среза в электропорационную камеру с помощью остроугольных щипцов и зафиксируйте ее положение с помощью срезового анкера.
   1. Не храните культуру срезов вне инкубатора более 30 минут за один раз, чтобы предотвратить побочные эффекты, такие как изменения в здоровье нейронов или функции^12.

6. Электропоратные ячейки, представляющие интерес

1. Нанесите положительное давление на пипетку с помощью рта или с помощью шприца 1 мл (давление 0,2 - 0,5 мл), прикрепленного к трубке.
2. Используйте 3-мерные ручек управления микроманипулятора для маневрирования наконечником пипетки вблизи поверхности культуры среза.
3. Выберите клетку-мишень и подойдите к ней, сохраняя приложенное положительное давление до тех пор, пока на поверхности клетки не образуется ямочка, видимая на микроскопе.
4. Выполняйте циклы давления.
   1. Быстро применяйте мягкое отрицательное давление через рот, чтобы между кончиком пипетки и плазматической мембраной образовывалась рыхлое уплотнение, визуально обозначенное мембраной, несколько подойдя в кончик пипетки. Наблюдайте за увеличением (~ 2,5x начального сопротивления) сопротивления пипетки, прислушиваясь к увеличению тона, исходящего от динамиков. Быстро повторно применяйте положительное давление, чтобы ямочка вновь сформировываться.
   2. Немедленно завершите, по крайней мере, еще два цикла давления без паузы, затем удерживайте отрицательное давление в течение 1 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пауза между циклами, применение слишком большого давления или слишком долгое удержание отрицательного давления может привести к значительному повреждению клеток и, возможно, привести к гибели клетки во время электропорации.
5. Быстро набирайте электропоратор один раз, используя ножную педаль, когда тон от динамиков достигает стабильной вершины в тангажу, указывая на пиковое электрическое сопротивление. Не ждите на пике сопротивления более 1 с перед отправкой импульса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не наблюдали нецелевой электропорации при использовании этого протокола^10. Трансфицировались только клетки, контактии с стеклянной пипеткой во время циклов давления. Позиционирование пипетки рядом с другими нейронами не приводит к трансфекции генов.
6. Осторожно втяни пипетку примерно на 100 мкм от ячейки без давления.
7. Повторно примените положительное давление, убедившись, что сопротивление аналогично записанного показаниям на шаге 5.5, затем подойдите к следующей ячейке.
   1. Удалите потенциальные засоры, обозначенные визуально или значительно повышенным (>15% выше) сопротивлением пипетки после электропорации, путем применения положительного давления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если видимого засора нет и сопротивление все еще значительно выше, выбросьте пипетку и используйте новую. В среднем, пипетка может использоваться для 20 событий электропорации, если пользователь осторожен^10.
8. После электропорации переложите культуру ломтика на свежую культурную вставку и инкубируют при 35°C в инкубаторе в течение 3 дней.

7. Фиксация, окрашивание и визуализация оловоорганических культур срезов гиппокампа

1. Фиксируют электропорированные оловоорганические культуры срезов через 2 – 3 дня после трансфекции 4% параформальдегидом и 4% сахарозой в 0,01 М фосфатного буферного физиологического раствора (1x PBS) в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
2. Удаляют фиксаторные и инкубационные ломтики в 30% сахарозе в 0,1 М фосфатного буфера (1x PB) в течение 2 ч.
3. Поместите ломтики на стакан для слайдов и заморозьте их, положив стакан на измельченный сухой лед. Разморозьте ломтики при комнатной температуре и переложите их на плиту из 6 скважин, заполненную 1x PBS.
4. Окрашивайте срезы антителами против GFP мыши и анти-RFP кролика в буфер GDB (0,1% желатина, 0,3% тритона X-100, 450 мМ NaCl и 32% 1x PB, рН 7,4) в течение 2 ч при комнатной температуре.
5. Трижды стирайте ломтики с 1x PBS при комнатной температуре в течение 10 минут каждую стирку.
6. Инкубировать срезы с антимышечным Alexa 488-конъюгированным вторичным антителом и анти-кроликом Alexa 594-конъюгированным вторичным антителом в буфере GDB в течение 1 ч при комнатной температуре. Инкубировать ломтики с DAPI (4 мкг/мл) в 1x PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
7. Трижды вымывайте ломтики с 1x PBS при комнатной температуре в течение 3 минут каждую стирку.
8. Монтирование срезов на стеклянные слайды с помощью монтажного носителя и выполнение флуоресцентной визуализации.

Результаты

Наша одноклеточная электропорация способна точно доставлять гены в визуально идентифицированные возбуждающие и тормозные нейроны. Мы электропорировали три различных типа нейронных клеток в трех разных временных точках. Парвалбумин (Pv) или везикулярный глутамат типа 3 (VGT3), экспрессир...

Обсуждение

Здесь мы описываем метод электропорации, который трансфектирует как возбуждающие, так и тормозные нейроны с высокой эффективностью и точностью. Наш оптимизированный протокол электропорации имеет три инновационных прорыва для достижения высокоэффективной трансфекции генов. Наша пер...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid preparation
Plasmid Purification Kit	Qiagen	12362
Organotypic slice culture preparation
6 Well Plates	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 Forceps	FST	#5/45	Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation
Flask Filter Unit	Millipore	SCHVU02RE	Filtration and storage of culture media
Incubator	Binder	BD C150-UL
McIlwain Tissue Chopper	TED PELLA, INC.	10180	Tissue chopper for organotypic slice culture preparation
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm	Millipore	PIHP03050	Organotypic slice culture inserts
Osmometer	Precision Systems	OSMETTE II
PTFE coated spatulas	Cole-Parmer	SK-06369-11
Scissors	FST	14958-09
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	SCGPT01RE	Filtration and storage of aCSF
Electrode preparation
Capillary Glasses	Warner Instruments	640796
Micropipetter Puller	Sutter Instrument	P-1000	Puller
Oven	Binder	BD (E2)
Puller Filament	Sutter Instrument	FB330B	Puller
Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1
3.5 mm Falcon Petri Dishes	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
CCD camera	Q Imaging	Retiga-2000DC	Camera
Electroporation System	Molecular Devices	Axoporator 800A	Electroporator
Fluorescence Illumination System	Prior	Lumen 200
Manipulator	Sutter Instrument	MPC-385	Manipulator
Metamorph software	Molecular Devices		Image acquisition
Peristaltic Pump	Rainin	Dynamax, RP-2	Perfusion pump
Shifting Table	Luigs & Neuman	240 XY
Speaker	Unknown		Speakers connected to the electroporator
Stereo Microscope	Olympus	SZ30
Table Top Incubator	Thermo Scientific	MIDI 40
Upright Microscope	Olympus	BX61WI
Fluorescence imaging #2
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X710