마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

요약

여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.

초록

전기 기화는 그들의 기능을 이해하기 위하여 세포로 특정 유전자를 전송하는 중요한 방법으로 그 자체를 설치했습니다. 여기서, 우리는 마우스 organotypic 해마 슬라이스 배양에서 흥분 및 클래스 별 억제 뉴런에서 체외 유전자 의 효율 (~80%)을 최대화하는 단세포 전기 기법을 설명합니다. 대형 유리 전극, 테트로도톡신 함유 인공 뇌척수액 및 가벼운 전기 펄스를 사용하여 배양 된 해마 CA1 피라미드 뉴런 및 억제 인터뉴런에 관심 유전자를 전달했습니다. 더욱이, 전기기화는 다양한 슬라이스 배양 발달 단계에 대한 연구를 가능하게 하는, 형질 효율의 감소없이 시험관내에서 최대 21일까지 배양 된 해마 슬라이스에서 수행될 수 있었다. 다양한 세포 유형에 걸쳐 유전자의 분자 기능을 검사하는 데 관심이 증가함에 따라, 우리의 방법은 기존의 전기 생리 장비 및 기술로 수행 할 수있는 마우스 뇌 조직에서 체외 유전자 트랜스펙트에 대한 신뢰할 수 있고 간단한 접근 방식을 보여줍니다.

서문

분자 생물학에서, 조사자에게 가장 중요한 고려 사항 중 하나는 그것의 기능을 해명하기 위하여 세포의 세포 또는 인구로 관심있는 유전자를 전달하는 방법입니다. 다른 전달 방법은 생물학적(예를 들어, 바이러스 벡터), 화학(예를 들어, 인산칼슘 또는 지질), 또는 물리적(예를 들어, 전기기화, 미세 주입 또는 생물리스트)^1,2로분류될 수 있다. 생물학적 방법은 매우 효율적이며 세포 유형에 특이적일 수 있지만 특정 유전 도구의 개발에 의해 제한됩니다. 화학 적 접근은 시험관 내에서 매우 강력하지만, 형질은 일반적으로 무작위입니다; 추가, 이러한 접근은 주로 기본 셀에 대해서만 예약되어 있습니다. 물리적 접근법 중, 생물학은 기술적 관점에서 가장 간단하고 쉬운 방법이지만, 다시 상대적으로 낮은 효율로 무작위 형질 전환 결과를 생성합니다. 유전적 도구 개발 없이 특정 세포로 전이가 필요한 응용 의 경우, 우리는 단세포 전기기^3,4를향해 바라본다.

전기포기는 전분 전기기분기만을 참조하는 데 사용되는 반면, 지난 20년 동안 여러 시험관 내 및 생체 내 단일 세포 전기기 프로토콜이 개발되어 특이성과 효율을 향상시키기 위해 개발되어^5,6,7,전기포기는 개별 세포로 유전자를 전송하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 매우 정확할 수 있습니다. 그러나 절차는 기술적으로 까다롭고 시간이 많이 걸리며 상대적으로 비효율적입니다. 실제로, 최근 논문은 기계화 전기 기공 장비의 타당성을^{조사했다 8,9,}이는 이러한 로봇 공학을 설치에 관심이 조사관을위한 이러한 장벽의 몇 가지를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 더 간단한 수단을 찾는 사람들을 위해, 전기 화, 즉 세포 죽음, 경질 실패 및 파이펫 막힘에 대한 문제는 여전히 우려사항입니다.

최근에는 더 큰 기울어진 유리 파이펫을 사용하는 전기 포기 방법을 개발했습니다. 온화한 전기 펄스 파라미터, 그리고 종신뉴런에서 훨씬 더 높은 형질전환 효율을 생성한 독특한 압력 순환 단계는 마우스 의 해마 CA1 영역에서 소마토스타틴 발현 억제 억제인터뉴런을 포함하여 억제성 인터뉴런에서 유전자를 처음으로 횡단할 수 있게^하였다. 그러나, 상이한 억제 인터뉴런 유형 및 뉴런 발달 단계에서 이 전기포기 방법의 신뢰성은 해결되지 않았다. 여기서, 우리는 이 전기기 기술이 흥분성 뉴런과 인터뉴런의 다른 종류 둘 다로 유전자를 이식할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 중요한 것은, 시험관내(DIV) 슬라이스 배양 연령에 관계없이 일체내의 전환 효율이 높았다는 것이다. 이 확립 및 사용자 친화적 인 기술은 생체 외 마우스 뇌 조직의 맥락에서 다른 세포 유형에 대한 단일 세포 전기 포레이션을 사용하는 데 관심이있는 모든 조사자에게 매우 권장됩니다.

프로토콜

모든 동물 프로토콜은 매사추세츠 대학교 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 슬라이스 배양 준비, 플라스미드 제제 및 전기화도 이전에 공표된 방법에 상세하며 추가^{정보(10)를}참조할 수 있다.

1. 슬라이스 문화 준비

1. 이전에^설명된바와 같이 마우스 organotypic 해마 슬라이스 배양을 준비하여, 산후 6-7일 된 마우스를 사용하여 어느 성별도 있다.
   1. (mM) 구성 된 organotypic 슬라이스 문화에 대한 해부 미디어를 준비 ( mM): 238 자당, 2.5 KCl, 1 CaCl_2,4 MgCl_2,26 NaHCO_3,1 NaH₂PO_4,및 11 포도당 분수, 다음 가스 5% CO₂/95% O₂ 에 7.4.
   2. ▲78.8%(v/v) 최소 필수매체이글, 말 세럼 20% (v/v) ▲17.9m 나코_3,26.6mMM포도당, 2M CaCl_2,M MgSO_4,30m HEPES, 인슐린(1μg/mL), 인슐린(1μg/mL), 인슐린(1μg/mL), 0.06m+0.06m+0.06m+0.0으로 구성된 조진형 슬라이스 배양 배지 를 준비한다. 진동계를 사용하여 삼투압을 310-330 osmol로 조정합니다.
   3. 두 개의 주걱을 사용 하 여 전체 뇌에서 해 마 를 해 부, 그리고 슬라이스 (400 μm) 조직 헬기를 사용 하 여. 두 개의 집게를 사용하여 슬라이스를 분리하고 삽입 아래에 배양 매체(950 μL)로 채워진 6웰 플레이트에서 30mm 세포 배양 인서트를 분리한다.
2. 조직 배양 인큐베이터(35°C, 5%_CO2)에조직 배양물 컬쳐를 저장하고 2일마다 슬라이스 배양 매체를 변경한다.

2. 플라스미드 준비

1. 관심 유전자에 대한 플라스미드를 준비합니다.
   1. 서브클론은 pCAG 벡터로 녹색 형광 단백질 (EGFP) 유전자를 향상시켰습니다.
   2. 내독소가 없는 정화 키트를 함유한 pCAG-EGFP 플라스미드를 정화하고 140m K-메탄술포네이트, 0.2m MM EGTA, 2m M M MgCl_2,10mM HEPES를 함유한 다이틸 파이로카보네이트 처리수로 구성된 내부 용액에 용해되어 7.3m(KOH7.3)로 조정된다.

3. 유리 파이펫 준비

1. 마이크로피펫 풀러(그림 1A)에보로실리케이트 유리 파이펫 (4.5 - 8 MΩ)을 당깁니다.
   참고: 전세포 패치 클램프 레코딩에 사용되는 유리 파이펫은 전기포공에 이상적입니다.
2. 200°C에서 밤새 유리 파이펫을 구워 멸균합니다.
3. 해부 현미경의 피펫 팁의 크기를 확인하여 전기 저항을 대략화하십시오.
   1. 선택 사항:파이펫을 전기기 전극에 부착하여 파이펫 저항을 확인하고 마이크로 조작기를 사용하여 파이펫 팁을 필터 멸균 된 인공 뇌척수액 (aCSF)으로 기동합니다 (mM에서): 119 NaCl, 2.5KCl, 0.5 CaCl_2,5 MgCl_2,26 NaHCO_3,1 NaH₂PO₄ 및 11 포도당, 5% CO 2/95% O₂ 내지 7.4의 pH. 전기포레이터의 판독을 사용하여 실제 저항을 확인합니다.
      참고: 파이펫 팁이 날카로워지며 전기 저항이 커집니다. 파이펫 저항은 10 MΩ 미만이어야 합니다. 파이펫 저항성이 높은 유리파이펫(도 1B)은반복된 전기기공 시 팁에서 종종 막힘입니다.

4. 전기 기공 장비 설정

1. 전기포레이터를 표준 전세포 전기생리학 장비에 설치하여 미세 조작기와 연동 펌프가 장착된 변속 테이블에 수직 현미경을 장착합니다.
2. 전자포레이터의 헤드스테이지를 미세 조작기에 설치하고 한 쌍의 스피커를 전자포레이터에 연결합니다. 전자포레이터를 풋 페달에 연결하여 준비시 펄스를 보낼 수 있습니다.
   참고: 스피커가 켜져 있을 때 톤을 방출하며, 이는 전극의 전기 저항을 나타내는 지표입니다. 이렇게 하면 절차에서 주의를 끌지 않고 저항의 상대적 변화를 결정할 수 있습니다.

5. 전기 기공 준비

1. 슬라이스 배양 물자를 6개의 웰 플레이트에서 3cm 페트리 접시로 옮기고 900 μL의 배양 매체를 적재하고 전기포기를 수행할 준비가 될 때까지 TABLEtop CO₂ 인큐베이터에 보관합니다.
   1. 3.5cm 페트리 접시에서 3.5cm 페트리 접시에서 30분 이상 슬라이스 배양 매체(1mL)를 곁들인 신선한 배양 물자를 전기기 후 배양 슬라이스로 선적한다.
2. 전기 포이션을 위해 장비를 청소하고 준비하십시오.
   1. 하루에 대한 실험을 시작하기 전에 튜브와 챔버를 살균하기 위해 5 분 동안 10 % 표백제로 라인을 퍼퓨징하십시오.
   2. 탈이온화된 오토클레이브 물로 라인을 30분 이상 분산하여 완전히 헹구는 경우를 대지 않습니다.
   3. 0.001 mM 테트로도톡신(TTX)을 포함하는 필터 멸균 aCSF로 라인을 퍼퓨즈합니다.
      참고: TTX는 인터뉴런^10의과대 흥분으로 인한 세포 독성 및 사망을 최소화합니다.
3. -5 V, 정사각형 펄스, 500ms의 훈련, 50Hz 의 주파수 및 500 μs의 펄스 폭 : 전기 포로이터의 펄스 매개 변수를 설정합니다.
4. 플라스미드 함유 내부 용액5μL로 유리 파이펫을 채웁니다.
   1. 파이펫 끝에서 갇힌 기포를 여러 번 가볍게 두드려 서 제거합니다.
   2. 해부 현미경으로 시각화하거나 파이펫 저항을 확인하기 위해 3.3.1 단계를 반복하여 손상에 대한 팁을 확인하십시오.
      참고: 팁이 손상된 경우 유리 파이펫을 폐기해야 하며 이 단계는 이전에 3단계에서 준비된 새 유리 파이펫으로 반복되어야 합니다.
5. 파이펫 팁을 전극에 단단히 부착하고 스피커를 켭니다. 팁이 aCSF 매체와 접촉했을 때 전기포레이터의 판독(파이펫 저항)을 기록합니다.
6. 날카로운 블레이드를 사용하여 배양 인서트 멤브레인을 자르고 하나의 슬라이스 배양을 분리합니다. 날카로운 각진 포셉을 사용하여 슬라이스 배양을 전자기 챔버로 조심스럽게 옮기고 슬라이스 앵커로 위치를 고정합니다.
   1. 신경 건강이나 기능의 변화와 같은 부작용을 방지하기 위해 한 번에 30 분 이상 인큐베이터 외부의 슬라이스 문화를 유지하지^{마십시오(12)}

6. 관심있는 전극 세포

1. 입으로 파이펫에 양압을 적용하거나 튜브에 부착된 1mL 주사기(0.2 ~0.5mL 압력)를 사용하여 양압을 적용한다.
2. 마이크로 조작기의 3차원 노브 컨트롤을 사용하여 슬라이스 배양 표면 근처에서 파이펫 팁을 기동합니다.
3. 표적 세포를 선택하고 접근하여 현미경에서 볼 수 있는 세포 표면에 보조개가 형성될 때까지 양압이 가해지는 것을 유지합니다.
4. 압력 주기를 수행합니다.
   1. 입에 의해 가벼운 음압을 빠르게 적용하여 파이펫 팁과 플라즈마 멤브레인 사이에 느슨한 씰이 형성되도록 하며, 피펫 팁으로 올라가는 멤브레인에 의해 시각적으로 표시됩니다. 스피커에서 나오는 음색의 증가를 청취하여 파이펫 저항의 증가(~2.5배 초기 저항)를 관찰한다. 보조가 다시 형성되도록 양압을 신속하게 다시 적용합니다.
   2. 즉시 일시 중지하지 않고 적어도 두 번 더 압력 주기를 완료한 다음 1 s에 대한 음의 압력을 유지합니다.
      참고: 주기 사이 를 일시 중지, 너무 많은 압력을 적용, 또는 너무 오래 대 한 부정적인 압력을 유지 상당한 세포 손상을 일으킬 수 있습니다 그리고 아마도 전기 기 공 동안 죽을 세포 원인.
5. 스피커의 톤이 피치의 안정적인 정점에 도달하면 발 페달을 사용하여 전자 포레이터를 빠르게 펄스하여 피크 전기 저항을 나타냅니다. 펄스를 보내기 전에 1 s 이상 피크 저항에서 기다리지 마십시오.
   참고: 이^{프로토콜(10)을}사용할 때 오프 타겟 전기기화를 관찰하지 않았습니다. 압력 주기 동안 유리 파이펫과 접촉하는 세포만 은 형감염되었습니다. 다른 뉴런 근처에 파이펫을 배치하면 유전자 이식이 발생하지 않습니다.
6. 압력을 가하지 않고 셀에서 약 100 μm 의 파이펫을 부드럽게 철회합니다.
7. 양압을 다시 적용하여 저항이 5.5단계에서 기록된 판독값과 유사하다는 것을 확인한 다음 다음 셀에 접근합니다.
   1. 양압을 적용하여 전기기 후 피펫 저항을 시각적으로 또는 현저하게 증가(>15% 더 높음)에 의해 표시된 잠재적 나막신을 제거합니다.
      참고: 눈에 보이는 나막신이 없고 저항성이 여전히 상당히 높으면 파이펫을 버리고 새 것을 사용합니다. 사용자가 주의 할 경우 평균적으로, 파이펫은 최대 20 개의 전기 기화 이벤트에 사용할 수^{있습니다.}
8. 전기기화 후, 슬라이스 배양을 신선한 배양 인서트로 옮기고 인큐베이터에서 35°C에서 최대 3일 동안 배양한다.

7. organotypic 해마 슬라이스 배양의 고정, 염색 및 이미징

1. 전극된 organotypic 슬라이스 배양 2 -3 일 0.01 M 인산염 완충식 식염수 (1 x PBS)로 4 % 파라 포름알데히드 및 4 % 자당으로 실온에서 1.5 h로 전환 후 2 - 3 일.
2. 2h00m 인산염 버퍼(1x PB)에서 30% 자당에서 고정 및 배양 슬라이스를 제거합니다.
3. 슬라이스를 슬라이드 유리에 놓고 슬라이드 유리를 분쇄 된 드라이 아이스 위에 올려 놓아 얼립니다. 실온에서 슬라이스를 해동하고 1x PBS로 채워진 6 개의 웰 플레이트로 옮기습니다.
4. GDB 버퍼(0.1% 젤라틴, 0.3% 트리톤 X-100, 450mM NaCl, 32% 1x PB, pH 7.4)에서 마우스 안티-GFP 및 토끼 안티-RFP 항체로 슬라이스를 실온에서 2시간 동안 염색한다.
5. 실온에서 1x PBS로 3회 세척하여 매 세척할 때마다 10분 동안 세척합니다.
6. 항마우스 알렉사 488-컨쥬게이드 이차 항체 및 항토끼 알렉사 594-공주 보조 항체를 실온에서 1시간 동안 GDB 버퍼로 배양한다. 실온에서 10분 동안 1x PBS에서 DAPI(4 μg/mL)로 슬라이스를 배양합니다.
7. 실온에서 3분 동안 1x PBS로 슬라이스를 3분 씩 씻는다.
8. 마운팅 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 슬라이스를 마운트하고 형광 이미징을 수행합니다.

결과

우리의 단세포 전기기는 시각적으로 확인된 흥분성 및 억제 신경으로 유전자를 정확하게 전달할 수 있습니다. 우리는 세 가지 다른 시점에서 세 가지 다른 신경 세포 유형을 전기화. 파브알부민(Pv) 또는 셀란 글루타민3 타입(VGT3)은 각각 Pv/TdTomato 및 VGT3/TdTomato 라인으로 명명된 TdTomato(적색 형광 단백질의 변형) 리포터 라인(Jax #007905)을 통해 Pv^cre(JAX #008069) 또는 VGT3^cre(JAX #018147) 라인?...

토론

우리는 여기에서 높은 효율성과 정밀도로 흥분성 및 억제 뉴런을 모두 횡단하는 전기 포기 법을 설명합니다. 당사의 최적화된 전기기화 프로토콜에는 매우 효율적인 유전자 이식을 달성하기 위한 세 가지 혁신적인 혁신이 있습니다. 우리의 첫 번째 수정은 이전에 게시 된^{프로토콜에}비해 파이펫 크기를 증가하는 것이었습니다^3,5,6<...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid preparation
Plasmid Purification Kit	Qiagen	12362
Organotypic slice culture preparation
6 Well Plates	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 Forceps	FST	#5/45	Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation
Flask Filter Unit	Millipore	SCHVU02RE	Filtration and storage of culture media
Incubator	Binder	BD C150-UL
McIlwain Tissue Chopper	TED PELLA, INC.	10180	Tissue chopper for organotypic slice culture preparation
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm	Millipore	PIHP03050	Organotypic slice culture inserts
Osmometer	Precision Systems	OSMETTE II
PTFE coated spatulas	Cole-Parmer	SK-06369-11
Scissors	FST	14958-09
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	SCGPT01RE	Filtration and storage of aCSF
Electrode preparation
Capillary Glasses	Warner Instruments	640796
Micropipetter Puller	Sutter Instrument	P-1000	Puller
Oven	Binder	BD (E2)
Puller Filament	Sutter Instrument	FB330B	Puller
Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1
3.5 mm Falcon Petri Dishes	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
CCD camera	Q Imaging	Retiga-2000DC	Camera
Electroporation System	Molecular Devices	Axoporator 800A	Electroporator
Fluorescence Illumination System	Prior	Lumen 200
Manipulator	Sutter Instrument	MPC-385	Manipulator
Metamorph software	Molecular Devices		Image acquisition
Peristaltic Pump	Rainin	Dynamax, RP-2	Perfusion pump
Shifting Table	Luigs & Neuman	240 XY
Speaker	Unknown		Speakers connected to the electroporator
Stereo Microscope	Olympus	SZ30
Table Top Incubator	Thermo Scientific	MIDI 40
Upright Microscope	Olympus	BX61WI
Fluorescence imaging #2
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X710