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Resumen

En este trabajo presentamos un protocolo para estudiar la función de las fimbrias en la colonización bacteriana.

Resumen

Las fimbrias de tipo 1 son importantes determinantes de virulencia de algunos patógenos gramnegativos, que promueven la colonización bacteriana. La varilla fimbrial se compone principalmente de múltiples copias de la subunidad fimbrial principal FimA. Sin embargo, la adhesina FimH está presente como una estructura de punta fibrilar que impulsa la unión de las bacterias al receptor que contiene manosa celular del huésped. Aquí, proporcionamos protocolos para evaluar y comparar la función de las subunidades fimbriales tipo 1 en F18ab fimbriae+ Shiga toxina productora de toxina Escherichia coli (STEC). Descubrimos que tanto FimA como FimH son necesarios para la adhesión, invasión y formación de biopelículas bacterianas. La eliminación del gen fimA mostró una reducción mucho mayor en la adhesión bacteriana y la invasión a las células epiteliales cilíndricas intestinales porcinas IPEC-J2, que la del mutante fimH . La formación de biopelículas se redujo significativamente en ambos mutantes con un nivel igual. Además, la qPCR demostró que la deleción de fimA o fimH regulaba a la baja la expresión de los flagelos bacterianos y de los genes de las fimbrias F18, mientras que la adhesina regulada al alza estaba implicada en la expresión génica de la adherencia difusa I (AIDA-I), lo que sugiere la corregulación de las adhesinas localizadas en la superficie celular en las fimbrias F18ab + STEC.

Introducción

La adhesión mediada por fimbrias bacterianas facilita la adhesión bacteriana a la superficie de una célula objetivo y establece una infección inicial. Las fimbrias de tipo 1 están ampliamente distribuidas entre Escherichia coli (E. coli) y promueven la unión bacteriana a las células de mamíferos al unirse al receptor que contiene manosa 1,2,3. A diferencia de las cepas patógenas, el 85% de las cepas comensales de E. coli analizadas de origen humano no expresan fimbriasde tipo 1 4, lo que indica su papel crítico en la infección de la enfermedad. Las fimbrias tipo 1 también son factores de virulencia importantes para patógenos extraintestinales, como la E. coli uropatógena (UPEC) y la E. coli causante de meningitis neonatal (NMEC)2,5,6.

Las infecciones causadas por fimbrias F18+ (incluidas dos variantes: ab y ac) Las cepas de E. coli productoras de toxina Shiga (STEC) se asocian con la enfermedad de edema porcino (DE) y la diarrea post-destete (PWD)7. Las fimbrias F18 porcinas + STEC se adhieren a los receptores epiteliales intestinales mediante una variedad de adherencias superficiales, incluidas las fimbrias F18, flagelos, E. coli pilus común (ECP) y la adhesina involucrada en la adherencia difusa (AIDA-I)8,9,10,11. Anteriormente, habíamos investigado la función de las fimbrias tipo 1 en las fimbrias F18ac + ETEC, lo que demostró que las fimbrias tipo 1 facilitan la formación de biopelículas bacterianas y la adhesión a las células huésped12. Sin embargo, dado que la patogenia de las fimbrias F18ab y F18ac + STEC no es totalmente la misma7, el papel de las fimbrias tipo 1 en las fimbrias F18ab + STEC sigue sin estar claro. El bastón fimbrial se compone principalmente de múltiples copias de la subunidad fimbrial principal FimA, y la adhesina FimH se ensambla en una estructura de punta fibrilar que impulsa la unión de las bacterias a la manosa celular del huésped que contiene el receptor13. Utilizando la recombinación λ-Red14, eliminamos con éxito el gen fimA/fimH de una cepa F107/86 de fimbrias F18ab+ STEC (tipo salvaje, O139:H1, Stx2e+), y construimos cepas de complemento para este estudio15.

En este trabajo describimos un protocolo para estudiar la función de las fimbrias bacterianas en la colonización. El ensayo de adhesión de bacterias y el ensayo de invasión son métodos importantes para investigar el rendimiento de la unión fimbrial de las bacterias. Es complicado y costoso realizar un modelo de desafío animal o aislar la línea celular primaria para ensayos de infección adicionales16. Por lo general, ninguno de estos resultados es estable con buena repetibilidad, ya que las diferencias individuales están presentes entre los animales probados. En este estudio se utilizan células IPEC-J2. Se trata de células epiteliales cilíndricas intestinales porcinas que se han aislado del yeyuno medio de un lechón neonatal17. Se trata de un modelo celular estable in vitro para examinar las interacciones de diversos patógenos animales y humanos, incluyendo Salmonella enterica y E. coli patógena, con células epiteliales intestinales18, lo que ayuda a explicar el papel de las fimbrias en la infección intestinal de forma cómoda y rápida. Por lo demás, las células IPEC-1 son otra línea de células epiteliales intestinales porcinas ampliamente utilizadas, en cuyo caso la composición de los receptores celulares es diferente a la de IPEC-J219. Para el estudio de las bacterias patógenas mamarias, es mejor utilizar la línea celular epitelial mamaria MAC-T20. Por lo tanto, para diferentes condiciones patógenas bacterianas, es importante la elección de una línea celular adecuada que imite los entornos in vivo.

Además, el biofilm es otra característica esencial para la supervivencia bacteriana durante la colonización21. En los trabajos anteriores, se utilizaron plata y rojo congo para teñir la formación de biofilm en los tubos de vidrio que mostraron visualmente los resultados22,23. Sin embargo, no se puede medir la diferencia de la capacidad de formación de biopelículas entre las diferentes cepas. Aquí, también presentamos un protocolo para la cuantificación de la formación de biopelículas bacterianas in vitro, que podría evaluar fácilmente la capacidad de las fimbrias en la formación de biopelículas.

Los métodos propuestos en este estudio utilizan una forma in vitro rápida y sencilla para determinar la función de las fimbrias bacterianas durante el proceso de infección bacteriana, lo que puede adaptarse ampliamente a otras investigaciones en el estudio del factor de virulencia en el mecanismo patogénico bacteriano.

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Protocolo

1. Cultivo celular

  1. Mantener las células IPEC-J2 en un matraz de 25cm2 que contenga 5 mL de medio mixto F12-RPMI1640 (1:1) libre de antibióticos suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) a 37 °C, en una incubadora con 5% de CO2 .
  2. Un día antes del ensayo de adhesión, utilice 1 mL de solución de tripsina-EDTA al 0,05% para tripsinizar las células IPEC-J2 durante 3 min. Retire suavemente la solución de tripsina-EDTA antes de que las células comiencen a desprenderse del matraz. Agregue 3 mL de medio de crecimiento y suspenda las células.
  3. Use 10 μL de la suspensión celular para contar las células usando un hemocitómetro. Diluir la suspensión celular utilizando medio de cultivo celular hasta una concentración final de 7 x 105 células/mL en un tubo cónico de 15 mL.
  4. Transfiera 100 μL de suspensión celular (~ 7 x 104 celdas) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Asegúrese de que las células se distribuyan uniformemente en los pocillos. Incubar la placa a 37 °C con 5% de CO2 y dejar que las células se adhieran y crezcan durante la noche, que debe tener aproximadamente un 90% de confluencia.

2. Ensayo de adhesión e invasión de bacterias

  1. Dos días antes del ensayo de adhesión, se congelaron las existencias de E. coli F107/86, mutante ΔfimA , mutante ΔfimH , ΔfimA/pfimA y ΔfimH/pfimH en placas de agar LB separadas para producir colonias individuales. Mantenga las placas en una incubadora a 37 ° C para que las colonias crezcan durante la noche.
  2. Un día antes de la infección, elija una sola colonia de la placa de cultivo bacteriano utilizando un asa de inoculación estéril e inocule las bacterias con 4 mL de caldo Luria-Bertani (LB) en un tubo de cultivo de vidrio bacteriano. Tapar los tubos después de inocularlos y ponerlos en un agitador a 180 rpm a 37 °C, durante la noche.
  3. El día de la infección, saque los cultivos bacterianos que hayan estado creciendo durante la noche en la incubadora. Transfiera 30 μL de este cultivo (dilución 1:100) a un tubo que contenga medios recién preparados. Coloque los tubos a 37 °C en una incubadora agitadora durante 4 h (OD600 ~ 2,0, bacterias cultivadas en la fase de registro medio).
  4. Después de 4 h, prepare 1 mL de caldo LB estéril como muestra en blanco. Mezcle 100 μL de subcultivo bacteriano y 900 μL de LB en una cubeta como muestra bacteriana. Prepare los tubos para diferentes muestras bacterianas.
  5. Mida la densidad óptica (DO) de los cultivos bacterianos utilizando un espectrofotómetro. Mida el diámetro exterior a la longitud de onda de 600 nm (diámetro exterior600). Mida la muestra en blanco para obtener la absorbancia de fondo.
  6. Mida los valores de OD para todas las muestras y registre los valores de OD600 . Calcule la concentración teniendo en cuenta el factor de dilución (10 en este ejemplo).
  7. Diluir el cultivo con F12-RPMI1640 fresco (sin FBS) para obtener una OD de aproximadamente 0,1, que corresponde aproximadamente a 1 x 108 ufc/mL. Estas suspensiones bacterianas se utilizarán posteriormente como inóculo.
  8. Saque la placa de 96 pocillos que contiene las células cultivadas durante la noche de la incubadora. En este punto, hay aproximadamente 1 x 105 células/pocillo en la placa. Etiquete la tapa de la placa con la cepa bacteriana que se utilizará para la infección de cada pocillo, y cada infección se realiza por triplicado.
  9. Retire los medios de cada pocillo y lave suavemente cada pocillo con PBS tres veces para eliminar las bacterias no adherentes. Añadir 100 μL del inóculo a los pocillos adecuados. Transfiera las células infectadas en una incubadora mantenida a 37 °C con 5% de CO2.
    1. Para el ensayo de adhesión de bacterias, incubar las células infectadas en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 1 h y pasar directamente al paso 2.12.
    2. Para el ensayo de invasión de bacterias, incube las células infectadas en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 2 h y continúe con el paso 2.10.
  10. Después de 2 h de incubación, extraiga la placa de 96 pocillos y aspire el medio de cultivo con una pipeta. Lave suavemente cada pocillo con PBS tres veces para eliminar las bacterias no adherentes.
  11. Añadir 200 μL de medio celular con 100 μg/mL de gentamicina a cada pocillo, incubar en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 1 h para matar las bacterias extracelulares.
  12. Después de 1 h de incubación, saque la placa de 96 pocillos y retire los medios de cultivo. Lave suavemente cada pocillo con PBS tres veces para eliminar las bacterias no adherentes.
  13. Añadir 200 μL de Triton X-100 al 0,5% a cada pocillo para lisar las células e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
  14. Transfiera 200 μL de célula lisada de cada pocillo a un nuevo tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL. Lave cada pocillo con 300 μL de PBS y añada también el tampón de lavado al tubo de 1,5 mL.
  15. Realizar una dilución en serie de 10 veces de la suspensión lítica recolectada con PBS en tubos.
  16. Placa de 100 μL de las dos diluciones más bajas a la placa de agar LB utilizando un esparcidor de células para obtener colonias individuales. Incubar estas placas durante la noche a 37 °C en una incubadora.
  17. Al día siguiente se cuentan las colonias formando unidades, que representan el número de bacterias adherentes/invasoras. Los datos se presentan en relación con el número de la cepa WT, que se normalizó al 100%. Cada experimento debe repetirse de forma independiente, al menos por triplicado.

3. Ensayo de cuantificación de la formación de biopelículas

  1. Dos días antes del ensayo de formación de biopelícula, prepare las cepas de bacterias como en el paso 2.1. Las placas de cultivo bacterianas se incubaron a 37 °C durante la noche.
  2. Un día antes del ensayo, agregue 4 mL de medio inductor de biopelícula (para la composición del medio, consulte la ref.10) a los tubos de cultivo bacteriano estériles. Elija una sola colonia de cultivos bacterianos veteados utilizando un circuito de inoculación estéril y transfiera la colonia al medio inductor de biopelícula. Tapar los tubos después de inocularlos y ponerlos en un agitador a 120 rpm a 30 °C, durante la noche.
  3. El día del ensayo, prepare la placa de 96 pocillos con un fondo redondo. Etiquete la tapa de la placa de acuerdo con la cepa incubada que se utilizará para cada pocillo, y cada cepa se hará por triplicado.
  4. Transfiera 10 μL de cada cultivo bacteriano durante la noche (dilución de 1 en 100) a 990 μL de medios inductores de biopelícula frescos en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Estas suspensiones bacterianas se utilizarán posteriormente como inóculo.
  5. Añadir 200 μL de inóculo diferente a los pocillos apropiados de la placa por triplicado. Transfiera la placa de 96 pocillos a una incubadora a 37 °C durante 24 h.
  6. Después de 24 h de incubación, saque la placa de 96 pocillos y retire los medios culturales. Lave suavemente cada pocillo con agua destilada doble (ddH2O) tres veces para eliminar las bacterias no combinadas.
  7. Añadir 250 μL de solución violeta cristalina al 2%10 a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 15 min para teñir el biofilm.
  8. Retire la solución de violeta cristalino al 2% de la placa de 96 pocillos. Lave suavemente cada pocillo con ddH2O tres veces para eliminar el tinte redundante. Luego, transfiera la placa a una incubadora a 37 °C durante 15 minutos para secar los pocillos.
  9. Agregue 300 μL de etanol al 95% a cada pocillo; Solubilizar el cristal violeta teñido en la biopelícula bacteriana.
  10. Encienda el espectrofotómetro de 96 pocillos; Establezca la absorbancia de detección en 600 nm. Coloque la placa de 96 pocillos en la carga e inicie la detección.
  11. Compare el valor medio de varias muestras. Se presentan datos relativos a la absorbancia de la cepa WT, que se normalizó al 100%. Cada experimento debe repetirse, de forma independiente, al menos tres veces.

4. Aislamiento de ARN y transcripción inversa

  1. Dos días antes del ensayo de qPCR, se congelaron las existencias de E. coli F107/86, mutante ΔfimA , mutante ΔfimH , ΔfimA/pfimA y ΔfimH/pfimH en las placas de agar LB para producir colonias individuales, respectivamente. Transfiera las placas a una incubadora configurada a 37 °C y permita el crecimiento durante la noche.
  2. Un día antes del ensayo, agregue 4 mL de medio inductor de biopelícula a los tubos de cultivo bacteriano estériles. Elija una sola colonia de cultivos bacterianos veteados utilizando un circuito de inoculación estéril y toque el bucle con el medio inductor de biopelícula. Tapar los tubos después de inocularlos y ponerlos en un agitador a 180 rpm a 37 °C, durante la noche.
  3. Transfiera 30 μl del cultivo bacteriano durante la noche a 3 mL de medio LB fresco en los tubos de vidrio el día del ensayo. Coloque los tubos en una incubadora agitadora a 37 °C a 180 rpm.
  4. Después de un cultivo de 4 h (OD600 ~ 2,0, bacterias cultivadas en la fase de registro medio), se recolectó 1 mL de cultivo de bacterias por centrifugación (12.000 x g, 2 min) en un tubo de microcentrífuga estéril sin ARNasa de 2 mL.
  5. Añadir 200 μL de solución de lisozima (1 mg/mL) en el tubo de 2 mL e incubar a 37 °C durante 10 min.
  6. Agregue 800 μL de reactivo de clorhidrato de guanidio disponible comercialmente al tubo; Luego, transfiera el tubo a hielo.
  7. Añada 200 μl de cloroformo a cada tubo de muestra. Luego, tape con cuidado el tubo y el vórtice durante 15 s. Por último, incuba el tubo a temperatura ambiente durante 10 min.
  8. La centrífuga de sobremesa se ajusta a una temperatura de 4 °C y se preenfría antes de su uso.
  9. Realizar la centrifugación a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  10. Prepare y etiquete los nuevos tubos sin RNasa de 1,5 mL. Transfiera la fase acuosa superior al nuevo tubo, teniendo cuidado de no alterar las capas medias o inferiores.
  11. Agregue un volumen igual de isopropanol en el tubo; La mezcla de capa acuosa e isopropanol y dejar reposar las muestras a temperatura ambiente durante 10 min.
  12. Realizar la centrifugación a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  13. Observe la parte inferior del tubo para ver si hay una bolita blanca (ARN). Vierta con cuidado el sobrenadante del tubo en un contenedor de desechos.
  14. Agregue 500 μL de etanol al 75% y vórtice, para lavar el pellet de ARN.
  15. Realice la centrifugación una vez más, a 12.000 x g durante 5 min a 4 °C.
  16. Aspire cuidadosamente para eliminar el sobrenadante tanto como sea posible.
  17. Seque al aire los gránulos de ARN blanco en la mesa de trabajo hasta que se vuelvan transparentes.
  18. Transfiera 30 μL de ddH2O libre de ARNasa prefría para disolver el ARN. Pase la solución unas cuantas veces para ayudar a disolverla. Mantenga las muestras en hielo todo el tiempo.
  19. Detecte la concentración de ARN de cada muestra utilizando un microespectrofotómetro con 1 μL de la muestra. Registre la concentración de todas las muestras.
  20. Para realizar la transcripción inversa, prepare la siguiente mezcla en un tubo de centrífuga sin ARNasa: 4 μL de mezcla maestra 4x, 1 μg de ARN molde y ddH2O sin ARNasa hasta 16 μL.
  21. Mezclar suavemente con una pipeta. Tape bien las muestras y etiquete los tubos de PCR en el lateral.
  22. Centrifugar los tubos de PCR brevemente (centrifugado corto) para recoger las muestras en la parte inferior del tubo.
  23. Coloque los tubos de PCR en un termociclador y procese las muestras con los siguientes ajustes: 42 °C durante 2 min y luego manténgalos a 4 °C.
  24. Agregue 4 μL de 5x Enzyme Mix a la mezcla del paso anterior; Mezclar suavemente con una pipeta.
  25. Centrifugar brevemente los tubos de PCR para recoger muestras hasta el fondo del tubo.
  26. Coloque los tubos de PCR en un termociclador y procese las muestras con los siguientes ajustes: 37 °C durante 15 min, 85 °C durante 5 s y, a continuación, manténgalos a 4 °C.
  27. Diluir en serie el producto 1:5 con ddH2O en los tubos, que puede utilizarse directamente en las reacciones de qPCR, o almacenarse a -20 °C para su uso posterior.

5. Análisis qPCR

  1. Planifique la configuración de la placa qPCR de 96 pocillos para el análisis de muestras.
  2. Descongele los cebadores (para ver la secuencia, consulte la Tabla 1), las mezclas maestras y el ADNc en hielo.
  3. Prepare la mezcla de la siguiente manera para cada reacción del pocillo: 10 μL de 2x SYBR qPCR Master Mix, 0,4 μL de cebador directo y cebador reverso, y ddH2O hasta 18 μL.
    NOTA: Los principales fragmentos de genes de fimbrias bacterianas/adhesinas, incluidos fedF (que codifica la adhesina de las fimbrias F18), fliC (que codifica la flagelina), ecpA (que codifica la subunidad principal de E. coli common pilus) y AIDA-I (que codifica la adhesina involucrada en la adherencia difusa) se amplifican como genes diana. El gapA (que codifica el gliceraldehído 3-fosfato) se utiliza como gen de referencia.
  4. Agite la mezcla y centrifugue a 500 x g durante 1 min. Con una pipeta repetidora, transfiera con cuidado 18 μL de la mezcla a cada pocillo de la placa de 96 pocillos.
  5. Transfiera 2 μL de ADNc diluido (del paso 3.8) a pocillos triplicados para cada juego de cebadores.
  6. Utilice una película adhesiva para sellar la superficie de la placa, asegurándose de que todos los pocillos estén cubiertos. Use un rodillo para sellar firmemente.
  7. Centrifugar la placa a 500 x g durante 1 min. Una placa vacía se utiliza como contrapeso.
  8. Encienda el sistema de PCR en tiempo real; siga las instrucciones del reactivo qPCR para establecer los parámetros. Asegúrese de que la curva de fusión esté incluida en el programa.
  9. Coloque la placa de 96 pocillos en el termociclador e inicie el análisis.
  10. Compare el valor de las distintas muestras y analice los datos con el método 2-ΔΔCT 24.

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Resultados

FimA es más importante que FimH en la adhesión e invasión de fimbrias F18ab+ STEC a las células IPEC-J2. En comparación con la cepa WT, la eliminación de fimA redujo la adhesión de F18ab fimbrias+ STEC a las células IPEC-J2 en aproximadamente un 86% (p < 0,01), mientras que la eliminación de fimH redujo la adhesión de STEC en aproximadamente un 71% (p < 0,01) (Figura 1A). El bloqueo de la ad...

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Discusión

Los métodos proporcionados aquí ayudan a determinar de manera eficiente la función de las fimbrias en la colonización bacteriana. Curiosamente, en este estudio, la deleción de fimA mostró un 15% menos de adherencia que el mutante fimH, lo que sugiere que la adhesina de la punta puede no ser el único factor necesario para la adhesión de F18ab fimbriae + STEC y que la subunidad de bastones fimbriales, FimA, también funciona en la adhesión bacteriana (...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31672579).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well microplateCorning3599adhesion and invasion assay
96-well microplate(Round bottom)Corning3799biofilm formation
crystal violetSinopharm Chemical Reagent71012314Biofilm staining
dextroseSangon BiotechA610219Culture broth
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
F12 mediumGibco11765062Cell culture
FeSO4Sangon BiotechA501386Culture broth
K2HPO4Sinopharm Chemical Reagent20032116Culture broth
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent10017608Culture broth
L-ArabinoseSangon BiotechA610071λ-Red recombination
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent20025117Culture broth
NaClSinopharm Chemical Reagent10019308Culture broth
(NH4)2SO4Sinopharm Chemical Reagent10002917Culture broth
Micro spectrophotometerThermo FisherNano Drop oneNucleic acid concentration detection
New-born calf serumGibco16010159Cell culture
PeptoneSangon BiotechA505247Culture broth
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA EraserTaKaRaRR047qPCR
Real-Time PCRApplied Biosystems7500 systemqPCR
RPMI1640 mediumGibco11875500Cell culture
SpectrophotometerEppendorfBioSpectrometerAbsorbance detection
Spectrophotometer (96-well microplate)BioTekEpochAbsorbance detection
SYBR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qPCR
Tabletop centrifugeThermo FisherMicro 17(R)Centrifugation
thiamine hydrochlorideSangon BiotechA500986Culture broth
Triton X-100Sangon BiotechA110694adhesion and invasion assay
TRIzolInvitrogen15596018RNA isolation
TryptoneOxoidLP0042Culture broth
Yeast extractOxoidLP0021Culture broth

Referencias

  1. Ofek, I., Beachey, E. H. Mannose binding and epithelial cell adherence of Escherichia coli. Infection and Immunity. 22 (1), 247-254 (1978).
  2. Khan, N. A., Kim, Y., Shin, S., Kim, K. S. FimH-mediated Escherichia coli K1 invasion of human brain microvascular endothelial cells. Cellular Microbiology. 9 (1), 169-178 (2007).
  3. Ashkar, A. A., et al. FimH adhesin of type 1 fimbriae is a potent inducer of innate antimicrobial responses which requires TLR4 and type 1 interferon signalling. PLoS Pathogens. 4 (12), (2008).
  4. Pusz, P., Bok, E., Mazurek, J., Stosik, M., Baldy-Chudzik, K. Type 1 fimbriae in commensal Escherichia coli derived from healthy humans. Acta Biochimica Polonica. 61 (2), 389-392 (2014).
  5. Gunther, N. W., Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In Vivo Dynamics of Type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infection and Immunity. 69 (5), 2838-2846 (2001).
  6. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).
  7. Imberechts, H., et al. Characterization of F18 fimbrial genes fedE and fedF involved in adhesion and length of enterotoxemic Escherichia coli strain 107/86. Microbial Pathogenesis. 21 (3), 183-192 (1996).
  8. Nagy, B., et al. Biological relationship between F18ab and F18ac fimbriae of enterotoxigenic and verotoxigenic Escherichia coli from weaned pigs with oedema disease or diarrhoea. Microbial Pathogenesis. 22 (1), 1-11 (1997).
  9. Ravi, M., et al. Contribution of AIDA-I to the pathogenicity of a porcine diarrheagenic Escherichia coli and to intestinal colonization through biofilm formation in pigs. Veterinary Microbiology. 120 (3-4), 308-319 (2007).
  10. Duan, Q., et al. The flagella of F18ab Escherichia coli is a virulence factor that contributes to infection in a IPEC-J2 cell model in vitro. Veterinary Microbiology. 160 (1-2), 132-140 (2012).
  11. Rendón, M. A., et al. Commensal and pathogenic Escherichia coli use a common pilus adherence factor for epithelial cell colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (25), 10637-10642 (2007).
  12. Duan, Q., Nandre, R., Zhou, M., Zhu, G. Type I fimbriae mediate in vitro adherence of porcine F18ac+ enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Annals of Microbiology. 44 (1), (2017).
  13. Zeiner, S. A., Dwyer, B. E., Clegg, S. FimA, FimF, and FimH are necessary for assembly of type 1 fimbriae on Salmonella enterica Serovar Typhimurium. Infection and Immunity. 80 (9), 3289-3296 (2012).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Guo, Z. Study on FimA mediated F18ab+ Escherichi coli pathogenicity. Yangzhou University. , MA dissertation [in Chinese] (2014).
  16. Kudva, I. T., Dean-Nystrom, E. A. Bovine recto-anal junction squamous epithelial (RSE) cell adhesion assay for studying Escherichia coli O157 adherence. Journal of Applied Microbiology. 111, 1283-1294 (2011).
  17. Berschneider, H. Development of normal cultured small intestinal epithelial cell lines which transport Na and Cl. Gastroenterology. 96, 41(1989).
  18. Brosnahan, A. J., Brown, D. R. Porcine IPEC-J2 intestinal epithelial cells in microbiological investigations. Veterinary Microbiology. 156, 229-237 (2012).
  19. Koh, S. Y., et al. Porcine intestinal epithelial cell lines as a new in vitro model for studying adherence and pathogenesis of enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 130, 191-197 (2008).
  20. Dogan, B., et al. Phylogroup and lpfA influence epithelial invasion by mastitis associated Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 159, 163-170 (2012).
  21. Hossain, M. M., Tsuyumu, S. Flagella-mediated motility is required for biofilm formation by Erwinia carotovora subsp. carotovora. Journal of General Plant Pathology. 72 (1), 34-39 (2006).
  22. Wang, Y., Chen, H., Zhu, X. Observation on Pseudomonas aeruginosa biofilm with sliver staining method. Chinese Journal of Microecology. 12 (1), (2012).
  23. Ambalam, P., Kondepudi, K. K., Nilsson, I., Wadström, T., Ljungh, Å Bile stimulates cell surface hydrophobicity, congo red binding and biofilm formation of lactobacillus strains. FEMS Microbiology Letters. 333 (1), 10-19 (2012).
  24. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), (2008).
  25. Kisiela, D. I., et al. Evolutionary analysis points to divergent physiological roles of type 1 fimbriae in Salmonella and Escherichia coli. mBio. 4 (2), (2013).
  26. Forero, M., Yakovenko, O., Sokurenko, E. V., Thomas, W. E., Vogel, V. Uncoiling mechanics of Escherichia coli type I fimbriae are optimized for catch bonds. PLoS Biology. 4 (9), 298(2006).
  27. Di Martino, P., Cafferini, N., Joly, B., Darfeuille-Michaud, A. Klebsiella pneumoniae type 3 pili facilitate adherence and biofilm formation on abiotic surfaces. Research in Microbiology. 154 (1), 9-16 (2003).
  28. Fazli, M., et al. The exopolysaccharide gene cluster Bcam1330-Bcam1341 is involved in Burkholderia cenocepacia biofilm formation, and its expression is regulated by c-di-GMP and Bcam1349. MicrobiologyOpen. 2 (1), 105-122 (2013).
  29. Zamani, H., Salehzadeh, A. Biofilm formation in uropathogenic Escherichia coli: association with adhesion factor genes. Turkish Journal of Medical Sciences. 48 (1), 162-167 (2018).
  30. Duan, Q., et al. Contribution of flagellin subunit FliC to piglet epithelial cells invasion by F18ab E. coli. Veterinary Microbiology. 166 (1-2), 220-224 (2013).

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