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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Funktion von Fimbrien bei der bakteriellen Besiedlung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Typ-1-Fimbrien sind wichtige Virulenzdeterminanten einiger gramnegativer Erreger, die die bakterielle Besiedlung begünstigen. Der Fimbriastab besteht hauptsächlich aus mehreren Kopien der großen fimbrialen Untereinheit FimA. FimH-Adhäsin liegt jedoch als fibrilläre Spitzenstruktur vor, die die Bindung von Bakterien an den zellulären Mannose-haltigen Rezeptor des Wirts antreibt. In dieser Arbeit stellen wir Protokolle zur Bewertung und zum Vergleich der Funktion von Typ 1 Fimbriae + Shiga-Toxin-produzierenden Escherichia coli (STEC) zur Verfügung. Wir fanden heraus, dass sowohl FimA als auch FimH für die bakterielle Adhäsion, Invasion und Biofilmbildung erforderlich sind. Das Deleting des fimA-Gens zeigte eine viel stärkere Verringerung der bakteriellen Adhäsion und Invasion in die säulenförmigen Epithelzellen des Schweinedarms IPEC-J2 als die der fimH-Mutante . Die Biofilmbildung war bei beiden Mutanten bei gleichem Niveau signifikant reduziert. Darüber hinaus zeigte die qPCR, dass entweder die fimA - oder die fimH-Deletion die Expression der bakteriellen Flagellen und der F18-Fimbrien-Gene herunterregulierte, während das hochregulierte Adhäsin an der Genexpression der diffusen Adhärenz-I (AIDA-I) beteiligt war, was auf die Co-Regulation von zelloberflächenlokalisierten Adhäsinen in F18ab fimbriae+ STEC hindeutet.

Einleitung

Die durch bakterielle Fimbrien vermittelte Adhäsion erleichtert die Anheftung der Bakterien an eine Zielzelloberfläche und führt zu einer Erstinfektion. Typ-1-Fimbrien sind unter Escherichia coli (E. coli) weit verbreitet und fördern die Anheftung von Bakterien an Säugetierzellen, indem sie an den Mannose-haltigen Rezeptorbinden 1,2,3. Im Gegensatz zu pathogenen Stämmen exprimieren 85 % der getesteten kommensalen E. coli-Stämme menschlichen Ursprungs keine Typ-1-Fimbrien4, was auf eine entscheidende Rolle bei der Krankheitsinfektion hinweist. Typ-1-Fimbrien sind auch wichtige Virulenzfaktoren für extraintestinale Krankheitserreger wie uropathogene E. coli (UPEC) und neonatale Meningitis verursachende E. coli (NMEC)2,5,6.

Infektionen, die durch F18 fimbriae+ (einschließlich zweier Varianten: ab und ac) Shiga-Toxin-produzierende E. coli (STEC)-Stämme verursacht werden, sind mit der Schweineödemkrankheit (ED) und dem Durchfall nach dem Absetzen (PWD) verbunden7. Schweinefleisch F18 fimbriae+ STEC bindet an intestinale Epithelrezeptoren durch eine Vielzahl von Oberflächenadhäsinen, darunter F18-Fimbrien, Flagellen, E. coli common pilus (ECP) und das Adhäsin, das an der diffusen Adhärenz beteiligt ist (AIDA-I)8,9,10,11. Zuvor hatten wir die Funktion von Typ-1-Fimbrien in F18ac Fimbrien+ ETEC untersucht, was zeigte, dass Typ-1-Fimbrien die Bildung von bakteriellen Biofilmen und die Adhäsion an Wirtszellen erleichtern12. Da die Pathogenese von F18ab und F18ac fimbriae+ STEC jedoch nicht völlig identisch ist7, bleibt die Rolle von Typ 1 Fimbrien bei F18ab fimbriae+ STEC unklar. Der Fimbrialstab besteht hauptsächlich aus mehreren Kopien der Hauptuntereinheit FimA, und das FimH-Adhäsin ist zu einer fibrillären Spitzenstruktur zusammengesetzt, die die Bindung von Bakterien an die zelluläre Mannose des Wirts, die den Rezeptor13 enthält, antreibt. Mit Hilfe der λ-Rot-Rekombination14 hatten wir erfolgreich das fimA/fimH-Gen aus einem F18ab fimbriae+ STEC-Stamm F107/86 (Wildtyp, O139:H1, Stx2e+) ausgeschaltet und Komplementstämme für diese Studiekonstruiert 15.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Funktion bakterieller Fimbrien bei der Besiedlung zu untersuchen. Bakterienadhäsionsassays und Invasionsassays sind wichtige Methoden zur Untersuchung der fimbriaalen Bindungsleistung von Bakterien. Es ist kompliziert und kostspielig, ein tierisches Provokationsmodell durchzuführen oder die primäre Zelllinie für weitere Infektionsassays zu isolieren16. In der Regel ist keines dieser Ergebnisse stabil mit guter Wiederholbarkeit, da die individuellen Unterschiede zwischen den getesteten Tieren vorhanden sind. In dieser Studie werden IPEC-J2-Zellen verwendet. Dabei handelt es sich um säulenare Epithelzellen des Darms von Schweinen, die aus dem mittleren Jejunum eines neonatalen Ferkels isoliert wurden17. Es handelt sich um ein stabiles In-vitro-Zellmodell zur Untersuchung der Wechselwirkungen verschiedener tierischer und menschlicher Krankheitserreger, einschließlich Salmonella enterica und pathogener E. coli, mit Darmepithelzellen18, das dazu beiträgt, die Rolle von Fimbrien bei Darminfektionen bequem und schnell zu erklären. Ansonsten sind IPEC-1-Zellen eine weitere weit verbreitete intestinale Epithelzelllinie von Schweinen, wobei sich in diesem Fall die Zusammensetzung der zellulären Rezeptoren von IPEC-J219 unterscheidet. Für die Untersuchung von pathogenen Brustbakterien ist es besser, die BrustepithelzelllinieMAC-T 20 zu verwenden. Daher ist für verschiedene bakterielle pathogene Erkrankungen die Wahl einer geeigneten Zelllinie, die in vivo-Umgebungen nachahmt, wichtig.

Darüber hinaus ist der Biofilm ein weiteres wesentliches Merkmal für das Überleben der Bakterien während der Besiedlung21. In den vorangegangenen Arbeiten wurden Silber und Kongorot verwendet, um die Biofilmbildung in den Glasröhren zu färben, die die Ergebnisse visuell zeigten22,23. Der Unterschied in der Fähigkeit zur Biofilmbildung zwischen verschiedenen Stämmen kann jedoch nicht gemessen werden. In dieser Arbeit stellen wir auch ein Protokoll zur Quantifizierung der bakteriellen Biofilmbildung in vitro vor, das die Fähigkeit von Fimbrien bei der Biofilmbildung leicht bewerten könnte.

Die in dieser Studie vorgeschlagenen Methoden verwenden eine schnelle und einfache In-vitro-Methode, um die Funktion bakterieller Fimbrien während des bakteriellen Infektionsprozesses zu bestimmen, die weitgehend an andere Forschungen zur Untersuchung des Virulenzfaktors im bakteriellen pathogenen Mechanismus angepasst werden kann.

Protokoll

1. Zellkultur

  1. IPEC-J2-Zellen werden in einem 25 cm2 Kolben mit 5 ml antibiotikafreiem F12-RPMI1640 (1:1) Mischmedium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), bei 37 °C in einem 5 % CO2 -Inkubator aufbewahrt.
  2. Einen Tag vor dem Adhäsionsassay verwenden Sie 1 ml 0,05%ige Trypsin-EDTA-Lösung, um IPEC-J2-Zellen 3 Minuten lang zu trypsinisieren. Entfernen Sie vorsichtig die Trypsin-EDTA-Lösung, bevor sich die Zellen aus dem Kolben abzulösen beginnen. Fügen Sie 3 ml Wachstumsmedium hinzu und suspendieren Sie die Zellen.
  3. Verwenden Sie 10 μl der Zellsuspension, um die Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit Zellkulturmedium auf eine Endkonzentration von 7 x 105 Zellen/ml in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
  4. Übertragen Sie 100 μl Zellsuspension (~7 x 104 Zellen) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Achten Sie darauf, dass sich die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen verteilen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C mit 5 % CO2 und lassen Sie die Zellen über Nacht anhaften und wachsen, was bei etwa 90 % Konfluenz sein sollte.

2. Adhäsions- und Invasionstest von Bakterien

  1. Zwei Tage vor dem Adhäsionstest sind gefrorene Bestände von E. coli F107/86, ΔfimA-Mutante , ΔfimH-Mutante , ΔfimA/pfimA und ΔfimH/pfimH auf separate LB-Agarplatten zu streichen, um Einzelkolonien zu erzeugen. Bewahren Sie die Platten in einem auf 37 °C eingestellten Inkubator auf, damit die Völker über Nacht wachsen können.
  2. Einen Tag vor der Infektion nehmen Sie eine einzelne Kolonie mit einer sterilen Impfschlaufe aus der Bakterienkulturplatte und inokulieren Sie die Bakterien mit 4 ml Luria-Bertani (LB) Brühe in einem Bakterienglaskulturröhrchen. Verschließen Sie die Röhrchen nach dem Impfen und geben Sie sie über Nacht in einen Shaker mit 180 U/min bei 37 °C.
  3. Entnehmen Sie am Tag der Infektion Bakterienkulturen, die über Nacht im Brutkasten gewachsen sind. 30 μl dieser Kultur (1:100 Verdünnung) werden in ein Röhrchen mit frisch zubereitetem Medium überführt. Stellen Sie die Röhrchen bei 37 °C für 4 h in einen Schüttelinkubator (OD600 ~ 2,0, Bakterien, die in der Mitte der logarithmischen Phase gezüchtet wurden).
  4. Bereiten Sie nach 4 h 1 ml sterile LB-Bouillon als Blindprobe vor. Mischen Sie 100 μl bakterielle Subkultur und 900 μl LB in eine Küvette als Bakterienprobe. Bereiten Sie die Röhrchen für verschiedene Bakterienproben vor.
  5. Messen Sie die optische Dichte (OD) der Bakterienkulturen mit einem Spektralphotometer. Messen Sie OD bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD600). Messen Sie die leere Probe, um die Hintergrundabsorption zu erhalten.
  6. Messen Sie die OD-Werte für alle Proben und notieren Sie die OD600-Werte . Berechnen Sie die Konzentration unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors (in diesem Beispiel 10).
  7. Verdünnen Sie die Kultur mit frischem F12-RPMI1640 (ohne FBS), um einen OD von ca. 0,1 zu erhalten, was in etwa 1 x 108 KBE/ml entspricht. Diese bakteriellen Suspensionen werden später als Inokulum verwendet.
  8. Nehmen Sie die 96-Well-Platte mit den über Nacht kultivierten Zellen aus dem Inkubator. Zu diesem Zeitpunkt befinden sich ca. 1 x 105 Zellen/Well in der Platte. Beschriften Sie den Deckel der Platte mit dem Bakterienstamm, der für die Infektion jeder Vertiefung verwendet werden soll, wobei jede Infektion in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wird.
  9. Entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung und waschen Sie jede Vertiefung dreimal vorsichtig mit PBS, um die nicht anhaftenden Bakterien zu entfernen. Geben Sie 100 μl des Inokulums in die entsprechenden Vertiefungen. Die infizierten Zellen werden in einen bei 37 °C gehaltenen Inkubator mit 5 % CO2 überführt.
    1. Für den Bakterienadhäsionstest werden infizierte Zellen in einem 5 % CO2 -Inkubator bei 37 °C für 1 h inkubiert und direkt zu Schritt 2.12 übergegangen.
    2. Für den Bakterieninvasions-Assay inkubieren Sie infizierte Zellen in einem 5 %CO 2 - Inkubator bei 37 °C für 2 Stunden und fahren Sie mit Schritt 2.10 fort.
  10. Nach 2 Stunden Inkubation nehmen Sie die 96-Well-Platte heraus und aspirieren Sie das Nährmedium mit einer Pipette. Waschen Sie jede Mulde dreimal vorsichtig mit PBS, um die nicht anhaftenden Bakterien zu entfernen.
  11. 200 μl Zellmedien mit 100 μg/ml Gentamicin in jede Vertiefung geben und in einem 5 % CO2 -Inkubator bei 37 °C für 1 h inkubieren, um extrazelluläre Bakterien abzutöten.
  12. Nehmen Sie nach 1 Stunde Inkubation die 96-Well-Platte heraus und entfernen Sie das Nährmedium. Waschen Sie jede Mulde dreimal vorsichtig mit PBS, um die nicht anhaftenden Bakterien zu entfernen.
  13. Geben Sie 200 μl 0,5 % Triton X-100 in jede Vertiefung, um die Zellen zu lysieren, und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  14. Übertragen Sie 200 μl lysierte Zellen aus jeder Vertiefung in ein neues steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie jede Vertiefung mit 300 μl PBS und geben Sie den Waschpuffer ebenfalls in das 1,5 ml-Röhrchen.
  15. Führen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung der gesammelten lytischen Suspension mit PBS in Röhrchen durch.
  16. Platte 100 μl der beiden niedrigsten Verdünnungen auf die LB-Agarplatte mit einem Zellspreizer auffüllen, um Einzelkolonien zu erhalten. Inkubieren Sie diese Platten über Nacht bei 37 °C in einem Inkubator.
  17. Am nächsten Tag werden die Kolonien gezählt, die Einheiten bilden, die die Anzahl der adhärenten / invasiven Bakterien darstellen. Die Daten werden relativ zur Anzahl des WEA-Stammes dargestellt, die auf 100% normiert wurde. Jedes Experiment muss unabhängig voneinander, mindestens dreifach, wiederholt werden.

3. Assay zur Quantifizierung der Biofilmbildung

  1. Zwei Tage vor dem Biofilmbildungstest sind die Bakterienstämme wie in Schritt 2.1 vorzubereiten. Bakterielle Kulturplatten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert.
  2. Einen Tag vor dem Assay geben Sie 4 ml Biofilm-induzierendes Medium (zur Medienzusammensetzung siehe Ref. 10) in sterile Bakterienkulturröhrchen. Entnehmen Sie eine einzelne Kolonie aus gestreiften Bakterienkulturen mit einer sterilen Impfschlaufe und übertragen Sie die Kolonie auf das Biofilm-induzierende Medium. Verschließen Sie die Röhrchen nach dem Impfen und geben Sie sie über Nacht in einen Shaker mit 120 U/min bei 30 °C.
  3. Bereiten Sie am Tag des Assays die 96-Well-Platte mit rundem Boden vor. Beschriften Sie den Deckel der Platte entsprechend dem inkubierten Stamm, der für jede Vertiefung verwendet wird, wobei jeder Stamm in dreifacher Ausfertigung erfolgt.
  4. Übertragen Sie 10 μl jeder Bakterienkultur über Nacht (1 zu 100 Verdünnung) auf 990 μl frisches Biofilm-induzierendes Medium in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Diese bakteriellen Suspensionen werden später als Inokulum verwendet.
  5. Geben Sie 200 μl unterschiedliches Inokulum in dreifacher Ausfertigung in die entsprechenden Vertiefungen der Platte. Die 96-Well-Platte für 24 Stunden bei 37 °C in einen Inkubator umfüllen.
  6. Nehmen Sie nach 24 Stunden Inkubation die 96-Well-Platte heraus und entfernen Sie das Kulturmedium. Waschen Sie jede Vertiefung dreimal vorsichtig mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O), um die unkombinierten Bakterien zu entfernen.
  7. 250 μl 2%ige kristallviolette Lösung10 in jede Vertiefung geben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um den Biofilm zu färben.
  8. Entfernen Sie die 2%ige kristallviolette Lösung von der 96-Well-Platte. Waschen Sie jede Mulde vorsichtig dreimal vorsichtig mit ddH2O, um den überflüssigen Farbstoff zu entfernen. Stellen Sie die Platte dann für 15 Minuten bei 37 °C in einen Inkubator, um die Vertiefungen zu trocknen.
  9. Geben Sie 300 μl 95%iges Ethanol in jede Vertiefung; Lösen Sie das auf dem bakteriellen Biofilm gefärbte Kristallviolett auf.
  10. Schalten Sie das 96-Well-Spektralphotometer ein. Stellen Sie die Detektion auf 600 nm ein. Setzen Sie die 96-Well-Platte auf die Last und starten Sie die Detektion.
  11. Vergleichen Sie den Mittelwert verschiedener Proben. Die Daten beziehen sich auf die Absorption des WT-Stammes, die auf 100% normiert wurde. Jedes Experiment muss unabhängig voneinander mindestens dreimal wiederholt werden.

4. RNA-Isolierung und reverse Transkription

  1. Zwei Tage vor dem qPCR-Assay werden gefrorene Bestände von E. coli F107/86, ΔfimA-Mutante , ΔfimH-Mutante , ΔfimA/pfimA und ΔfimH/pfimH auf die LB-Agarplatten gestreift, um jeweils Einzelkolonien zu erzeugen. Übertragen Sie die Platten in einen auf 37 °C eingestellten Inkubator und lassen Sie sie über Nacht wachsen.
  2. Einen Tag vor dem Assay geben Sie 4 ml Biofilm-induzierendes Medium in sterile Bakterienkulturröhrchen. Entnehmen Sie eine einzelne Kolonie aus gestreiften Bakterienkulturen mit einer sterilen Impfschlaufe und berühren Sie die Schlaufe mit dem Biofilm-induzierenden Medium. Verschließen Sie die Röhrchen nach dem Impfen und geben Sie sie über Nacht in einen Shaker mit 180 U/min bei 37 °C.
  3. Übertragen Sie am Tag des Assays 30 μl der Bakterienkultur über Nacht auf 3 mL frisches LB-Medium in den Glasröhrchen. Stellen Sie die Röhrchen in einen Schüttelinkubator bei 37 °C und 180 U/min.
  4. Nach einer 4-stündigen Kultur (OD600 ~ 2,0, Bakterien, die in der Mid-Log-Phase gezüchtet wurden) wurde 1 ml Bakterienkultur durch Zentrifugation (12.000 x g, 2 min) in einem sterilen 2 mL RNase-freien Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt.
  5. 200 μl Lysozymlösung (1 mg/ml) in das 2-ml-Röhrchen geben und 10 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
  6. Geben Sie 800 μl handelsübliches Guanidiumhydrochlorid-Reagenz in das Röhrchen; Übertragen Sie dann das Rohr auf Eis.
  7. Geben Sie 200 μl Chloroform in jedes Probenröhrchen. Verschließen Sie dann vorsichtig das Rohr und wirbeln Sie es 15 s lang ein. Zum Schluss inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  8. Die Tischzentrifuge wird auf eine Temperatur von 4 °C eingestellt und vor dem Gebrauch vorgekühlt.
  9. Die Zentrifugation bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C durchführen.
  10. Bereiten Sie die neuen 1,5 mL RNase-freien Röhrchen vor und etikettieren Sie sie. Übertragen Sie die obere wässrige Phase auf das neue Rohr und achten Sie darauf, die mittlere oder untere Schicht nicht zu stören.
  11. Geben Sie ein gleiches Volumen Isopropanol in das Röhrchen; Die Mischung aus wässriger Schicht und Isopropanol vortexen und die Proben 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen.
  12. Die Zentrifugation bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C durchführen.
  13. Beobachte den Boden des Röhrchens, um herauszufinden, ob sich ein weißes Kügelchen (RNA) befindet. Gießen Sie den Überstand vorsichtig aus dem Schlauch in einen Abfallbehälter aus.
  14. Fügen Sie 500 μl 75%iges Ethanol hinzu und wirbeln Sie es ein, um das RNA-Pellet zu waschen.
  15. Führen Sie die Zentrifugation erneut bei 12.000 x g für 5 min bei 4 °C durch.
  16. Vorsichtig aspirieren, um den Überstand so weit wie möglich zu entfernen.
  17. Trocknen Sie die weißen RNA-Pellets an der Luft, bis sie klar werden.
  18. Übertragen Sie 30 μl vorkaltes RNase-freies ddH2O, um die RNA aufzulösen. Passieren Sie die Lösung einige Male, um sie aufzulösen. Bewahren Sie die Proben die ganze Zeit auf Eis auf.
  19. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration jeder Probe mit einem Mikrospektrophotometer mit 1 μl der Probe. Notieren Sie die Konzentration aller Proben.
  20. Um eine reverse Transkription durchzuführen, bereiten Sie die folgende Mischung in einem RNase-freien Zentrifugenröhrchen vor: 4 μl 4x Mastermix, 1 μg Template-RNA und RNase-freies ddH2O bis zu 16 μl.
  21. Vorsichtig mit einer Pipette mischen. Verschließen Sie die Proben fest und beschriften Sie die PCR-Röhrchen an der Seite.
  22. Zentrifugieren Sie die PCR-Röhrchen kurz (kurzes Schleudern), um die Proben am Boden des Röhrchens zu sammeln.
  23. Legen Sie die PCR-Röhrchen in einen Thermocycler und lassen Sie die Proben unter den folgenden Einstellungen laufen: 42 °C für 2 min und dann bei 4 °C halten.
  24. Fügen Sie 4 μl 5x Enzymmischung zu der Mischung des vorherigen Schritts hinzu; Vorsichtig mit einer Pipette mischen.
  25. Zentrifugieren Sie die PCR-Röhrchen kurz, um Proben auf den Boden des Röhrchens zu sammeln.
  26. Legen Sie die PCR-Röhrchen in einen Thermocycler und lassen Sie die Proben unter den folgenden Einstellungen laufen: 37 °C für 15 Minuten, 85 °C für 5 s und dann bei 4 °C halten.
  27. Verdünnen Sie das Produkt seriell 1:5 mit ddH2O in den Röhrchen, die direkt in qPCR-Reaktionen verwendet werden können, oder lagern Sie es bei -20 °C zur weiteren Verwendung.

5. qPCR-Analyse

  1. Planen Sie den Aufbau der 96-Well-qPCR-Platte für die Probenanalyse.
  2. Primer auftauen (Sequenz siehe Tabelle 1), Mastermixe und cDNA auf Eis.
  3. Bereiten Sie die Mischung für jede Well-Reaktion wie folgt vor: 10 μl 2x SYBR qPCR Master Mix, 0,4 μl Primer Forward und Primer Reverse und ddH2O bis zu 18 μl.
    HINWEIS: Die wichtigsten bakteriellen Fimbrien/Adhesin-Genfragmente, einschließlich fedF (kodiert für das Adhäsin von F18-Fimbrien), fliC (kodiert für das Flagellin), ecpA (kodiert für die Hauptuntereinheit von E. coli common pilus) und AIDA-I (kodiert für das Adhäsin, das an der diffusen Adhärenz beteiligt ist) werden als Zielgene amplifiziert. gapA (kodiert für das Glycerinaldehyd-3-phosphat) wird als Referenzgen verwendet.
  4. Die Mischung zerkleinern und bei 500 x g 1 min zentrifugieren. Übertragen Sie mit einer Repetierpipette vorsichtig 18 μl der Mischung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.
  5. 2 μl verdünnte cDNA (aus Schritt 3.8) werden für jeden Primersatz in dreifache Vertiefungen übertragen.
  6. Verwenden Sie eine Klebefolie, um die Plattenoberfläche zu versiegeln, und stellen Sie sicher, dass alle Vertiefungen abgedeckt sind. Verwenden Sie eine Rolle, um fest zu verschließen.
  7. Die Platte bei 500 x g 1 min zentrifugieren. Als Gegengewicht wird eine leere Platte verwendet.
  8. Schalten Sie das Real-Time-PCR-System ein. Befolgen Sie die Anweisungen des qPCR-Reagenzes, um die Parameter einzustellen. Stellen Sie sicher, dass die Schmelzekurve im Programm enthalten ist.
  9. Setzen Sie die 96-Well-Platte in den Thermocycler ein und starten Sie die Analyse.
  10. Vergleichen Sie den Wert der verschiedenen Proben und analysieren Sie die Daten mit der 2-ΔΔCT-Methode 24.

Ergebnisse

FimA ist wichtiger als FimH bei der Adhäsion und Invasion von F18ab fimbriae+ STEC an IPEC-J2-Zellen. Im Vergleich zum WT-Stamm reduzierte das Entfernen von fimA die Adhäsion von F18ab fimbriae+ STEC an IPEC-J2-Zellen um etwa 86 % (p < 0,01), während das Löschen von fimH die STEC-Adhäsion um etwa 71 % (p < 0,01) reduzierte (Abbildung 1A). Die Blockierung des Adhäsins FimH des WT-Stammes durch Co...

Diskussion

Die hier vorgestellten Methoden helfen, die Funktion von Fimbrien bei der bakteriellen Besiedlung effizient zu bestimmen. Interessanterweise zeigte die Deletion von fimA in dieser Studie eine um 15 % geringere Adhäsion als die fimH-Mutante, was darauf hindeutet, dass die Spitzenadhäsin möglicherweise nicht der einzige Faktor ist, der für die F18ab fimbriae+ STEC-Adhäsion erforderlich ist, und dass die Fimbrialstäbchen-Untereinheit, FimA, auch bei der ba...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31672579) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well microplateCorning3599adhesion and invasion assay
96-well microplate(Round bottom)Corning3799biofilm formation
crystal violetSinopharm Chemical Reagent71012314Biofilm staining
dextroseSangon BiotechA610219Culture broth
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
F12 mediumGibco11765062Cell culture
FeSO4Sangon BiotechA501386Culture broth
K2HPO4Sinopharm Chemical Reagent20032116Culture broth
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent10017608Culture broth
L-ArabinoseSangon BiotechA610071λ-Red recombination
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent20025117Culture broth
NaClSinopharm Chemical Reagent10019308Culture broth
(NH4)2SO4Sinopharm Chemical Reagent10002917Culture broth
Micro spectrophotometerThermo FisherNano Drop oneNucleic acid concentration detection
New-born calf serumGibco16010159Cell culture
PeptoneSangon BiotechA505247Culture broth
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA EraserTaKaRaRR047qPCR
Real-Time PCRApplied Biosystems7500 systemqPCR
RPMI1640 mediumGibco11875500Cell culture
SpectrophotometerEppendorfBioSpectrometerAbsorbance detection
Spectrophotometer (96-well microplate)BioTekEpochAbsorbance detection
SYBR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qPCR
Tabletop centrifugeThermo FisherMicro 17(R)Centrifugation
thiamine hydrochlorideSangon BiotechA500986Culture broth
Triton X-100Sangon BiotechA110694adhesion and invasion assay
TRIzolInvitrogen15596018RNA isolation
TryptoneOxoidLP0042Culture broth
Yeast extractOxoidLP0021Culture broth

Referenzen

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