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Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para estudar a função das fímbrias na colonização bacteriana.

Resumo

As fímbrias do tipo 1 são importantes determinantes de virulência de alguns patógenos Gram-negativos, que promovem a colonização bacteriana. A haste fimbrial é composta principalmente de várias cópias da subunidade fimbrial principal FimA. A adesina FimH, no entanto, está presente como uma estrutura de ponta fibrilar que leva as bactérias a se ligarem ao receptor contendo manose celular hospedeiro. Aqui, fornecemos protocolos para avaliar e comparar a função das subunidades fimbriais do tipo 1 em Fímbrias F18ab + Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC). Descobrimos que tanto o FimA quanto o FimH são necessários para a adesão bacteriana, invasão e formação de biofilme. A deleção do gene fimA mostrou muito mais redução na adesão bacteriana e invasão às células epiteliais colunares intestinais suínas IPEC-J2, do que a do mutante fimH . A formação de biofilme foi significativamente reduzida em ambos os mutantes com um nível igual. Além disso, a qPCR demonstrou que a deleção fimA ou fimH regulou negativamente os flagelos bacterianos e a expressão dos genes das fímbrias F18, enquanto a adesina regulada positivamente estava envolvida na expressão do gene da adesão difusa-I (AIDA-I), sugerindo a co-regulação das adesinas localizadas na superfície celular em F18ab fímbrias + STEC.

Introdução

A adesão mediada por fímbrias bacterianas facilita a ligação bacteriana à superfície da célula-alvo e estabelece uma infecção inicial. As fímbrias do tipo 1 são amplamente distribuídas entre Escherichia coli (E. coli) e promovem a ligação bacteriana às células de mamíferos ligando-se ao receptor contendo manose 1,2,3. Em contraste com as cepas patogênicas, 85% das cepas comensais de E. coli testadas de origem humana não expressam fímbrias tipo 14, o que indica seus papéis críticos na infecção da doença. As fímbrias do tipo 1 também são importantes fatores de virulência para patógenos extraintestinais, como E. coli uropatogênica (UPEC) e E. coli causadora de meningite neonatal (NMEC)2,5,6.

As infecções causadas por F18 fímbrias + (incluindo duas variantes: ab e ac) de E. coli produtoras de toxina Shiga (STEC) estão associadas à doença do edema suíno (DE) e à diarreia pós-desmame (PCD)7. As fímbrias F18+ STEC suínas ligam-se aos receptores epiteliais intestinais por uma variedade de adesinas superficiais, incluindo fímbrias F18, flagelos, E. coli pilus comum (ECP) e a adesina envolvida na adesão difusa (AIDA-I)8,9,10,11. Anteriormente, havíamos investigado a função das fímbrias do tipo 1 nas fímbrias F18ac + ETEC, o que demonstrou que as fímbrias do tipo 1 facilitam a formação de biofilme bacteriano e a adesão às células hospedeiras12. No entanto, como a patogênese das fímbrias F18ab e F18ac + STEC não são totalmente as mesmas7, o papel das fímbrias do tipo 1 nas fímbrias F18ab + STEC permanece obscuro. A haste fimbrial é composta principalmente de várias cópias da subunidade fimbrial principal FimA, e a adesina FimH é montada em uma estrutura de ponta fibrilar que impulsiona a ligação das bactérias à manose celular hospedeira contendo o receptor13. Usando a recombinação λ-Red14, nocauteamos com sucesso o gene fimA / fimH de uma cepa F18ab fimbriae + STEC F107 / 86 (tipo selvagem, O139: H1, Stx2e +) e construímos cepas de complemento para este estudo15.

Aqui, descrevemos um protocolo para estudar a função das fímbrias bacterianas na colonização. O ensaio de adesão bacteriana e o ensaio de invasão são os principais métodos para investigar o desempenho da ligação fimbrial bacteriana. É complicado e caro realizar um modelo de desafio animal ou isolar a linha celular primária para novos ensaiosde infecção 16. Normalmente, nenhum desses resultados é estável com boa repetibilidade, uma vez que as diferenças individuais estão presentes entre os animais testados. Neste estudo, são utilizadas células IPEC-J2. Estas são células epiteliais colunares intestinais suínas que foram isoladas do jejuno médio de um leitão neonatal17. É um modelo celular in vitro estável para examinar as interações de vários patógenos animais e humanos, incluindo Salmonella enterica e E. coli patogênica, com células epiteliais intestinais18, ajudando a explicar o papel das fímbrias na infecção intestinal de forma conveniente e rápida. Por outro lado, as células IPEC-1 são outra linhagem de células epiteliais intestinais suínas amplamente utilizadas, caso em que a composição dos receptores celulares é diferente da IPEC-J219. Para o estudo de bactérias patogênicas mamárias, é melhor usar a linhagem de células epiteliais mamárias MAC-T20. Portanto, para diferentes condições patogênicas bacterianas, a escolha de uma linhagem celular adequada que imite ambientes in vivo é importante.

Além disso, o biofilme é outra característica essencial para a sobrevivência bacteriana durante a colonização21. Nos trabalhos anteriores, prata e vermelho congo foram usados para manchar a formação de biofilme nos tubos de vidro que mostraram visualmente os resultados22,23. No entanto, a diferença da capacidade de formação de biofilme entre cepas variadas não pode ser medida. Aqui, também apresentamos um protocolo para a quantificação da formação de biofilme bacteriano in vitro, que poderia facilmente avaliar a capacidade das fímbrias na formação de biofilme.

Os métodos propostos neste estudo utilizam uma forma in vitro rápida e simples para determinar a função das fímbrias bacterianas durante o processo de infecção bacteriana, que pode ser amplamente adaptada a outras pesquisas no estudo do fator de virulência no mecanismo patogênico bacteriano.

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Protocolo

1. Cultura de células

  1. Manter as células IPEC-J2 em um frasco de 25 cm2 contendo 5 mL de F12-RPMI1640 livre de antibióticos (1: 1) em meio misto suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C, em uma incubadora de 5% de CO2 .
  2. Um dia antes do ensaio de adesão, use 1 mL de solução de tripsina-EDTA a 0,05% para tripsinizar as células IPEC-J2 por 3 min. Remova suavemente a solução de tripsina-EDTA antes que as células comecem a se desprender do frasco. Adicione 3 mL de meio de crescimento e suspenda as células.
  3. Use 10 μL da suspensão celular para contar as células usando um hemocitômetro. Diluir a suspensão celular com meio de cultura celular até uma concentração final de 7 x 105 células/ml num tubo cónico de 15 ml.
  4. Transfira 100 μL de suspensão celular (~ 7 x 104 células) para cada poço de uma placa de 96 poços. Certifique-se de que as células se distribuam uniformemente nos poços. Incubar a placa a 37 °C com 5% de CO2 e permitir que as células adiram e cresçam durante a noite, o que deve estar a cerca de 90% de confluência.

2. Ensaio de adesão e invasão de bactérias

  1. Dois dias antes do ensaio de adesão, listrar os estoques congelados de E. coli F107/86, ΔfimA mutante, ΔfimH mutante, ΔfimA/pfimA e ΔfimH/pfimH em placas de ágar LB separadas para produzir colônias únicas. Manter as placas numa incubadora regulada para 37 °C para permitir que as colónias cresçam durante a noite.
  2. Um dia antes da infecção, pegue uma única colônia da placa de cultura bacteriana usando uma alça de inoculação estéril e inocule as bactérias com 4 mL de caldo Luria-Bertani (LB) em um tubo de cultura de vidro bacteriano. Tampe os tubos após a inoculação e coloque-os em um agitador com 180 rpm a 37 ° C, durante a noite.
  3. No dia da infecção, retire as culturas bacterianas que cresceram durante a noite na incubadora. Transferir 30 μL desta cultura (diluição 1:100) para um tubo contendo meios recém-preparados. Coloque os tubos a 37 °C em uma incubadora agitada por 4 h (OD600 ~ 2.0, bactérias cultivadas na fase intermediária).
  4. Após 4 h, prepare 1 mL de caldo LB estéril como uma amostra em branco. Misture 100 μL de subcultura bacteriana e 900 μL de LB em uma cubeta como uma amostra bacteriana. Prepare os tubos para diferentes amostras bacterianas.
  5. Medir a densidade óptica (DO) das culturas bacterianas utilizando um espectrofotómetro. Medir o diâmetro externo no comprimento de onda de 600 nm (diâmetro externo600). Meça a amostra em branco para obter a absorbância de fundo.
  6. Meça os valores de OD para todas as amostras e registre os valores de OD600 . Calcular a concentração que tem em conta o factor de diluição (10 neste exemplo).
  7. Dilua a cultura com F12-RPMI1640 fresco (sem FBS) para obter uma DO de aproximadamente 0,1, que corresponde aproximadamente a 1 x 108 ufc/mL. Essas suspensões bacterianas serão posteriormente utilizadas como inóculo.
  8. Retire a placa de 96 poços contendo as células cultivadas durante a noite da incubadora. Neste ponto, existem aproximadamente 1 x 105 células/poço na placa. Rotule a tampa da placa com a cepa bacteriana a ser usada para a infecção de cada poço, com cada infecção sendo realizada em triplicata.
  9. Remova a mídia de cada poço e lave suavemente cada poço com PBS três vezes para remover as bactérias não aderentes. Adicionar 100 μL do inóculo aos alvéolos apropriados. Transferir as células infectadas para uma incubadora mantida a 37 °C com 5% de CO2.
    1. Para o ensaio de adesão de bactérias, incubar as células infectadas numa incubadora de CO2 a 5% a 37 °C durante 1 h e passar diretamente para o passo 2.12.
    2. Para o ensaio de invasão de bactérias, incubar as células infectadas numa incubadora de CO2 a 5% a 37 °C durante 2 h e avançar para o passo 2.10.
  10. Após 2 h de incubação, retirar a placa de 96 poços e aspirar os meios de cultura com uma pipeta. Lave suavemente cada poço com PBS três vezes para remover as bactérias não aderentes.
  11. Adicione 200 μL de meio celular com 100 μg / mL de gentamicina a cada poço, incube em uma incubadora de CO2 a 5% a 37 ° C por 1 h para matar bactérias extracelulares.
  12. Após 1 h de incubação, retirar a placa de 96 poços e remover os meios de cultura. Lave suavemente cada poço com PBS três vezes para remover as bactérias não aderentes.
  13. Adicione 200 μL de Triton X-100 a 0,5% a cada poço para lisar as células e incubar por 20 min em temperatura ambiente.
  14. Transfira 200 μL de célula lisada de cada poço para um novo tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL. Lave cada poço com 300 μL de PBS e adicione o tampão de lavagem ao tubo de 1,5 mL também.
  15. Realize uma diluição serial de 10 vezes da suspensão lítica coletada com PBS em tubos.
  16. Colocar 100 μL das duas diluições mais baixas na placa de ágar LB usando um espalhador de células para obter colônias únicas. Incubar estas placas durante a noite a 37 °C numa incubadora.
  17. No dia seguinte, conte as unidades formadoras de colônias, que representam o número de bactérias aderentes/invasivas. Os dados são apresentados em relação ao número da cepa WT, que foi normalizado para 100%. Cada experimento precisa ser repetido independentemente, pelo menos triplicado.

3. Ensaio de quantificação da formação de biofilme

  1. Dois dias antes do ensaio de formação de biofilme, preparar as estirpes de bactérias como no passo 2.1. As placas culturais bacterianas foram incubadas a 37 °C durante a noite.
  2. Um dia antes do ensaio, adicione 4 mL de meio indutor de biofilme (para composição do meio, consulte a ref.10) aos tubos de cultura bacteriana estéreis. Escolha uma única colônia de culturas bacterianas listradas usando uma alça de inoculação estéril e transfira a colônia para o meio indutor de biofilme. Tampe os tubos após a inoculação e coloque-os em um agitador com 120 rpm a 30 °C, durante a noite.
  3. No dia do ensaio, prepare a placa de 96 poços com fundo redondo. Rotule a tampa da placa de acordo com a cepa incubada que será usada para cada poço, com cada cepa sendo feita em triplicata.
  4. Transfira 10 μL de cada cultura bacteriana durante a noite (diluição de 1 em 100) para 990 μL de meios indutores de biofilme fresco em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Essas suspensões bacterianas serão posteriormente utilizadas como inóculo.
  5. Adicionar 200 μL de inóculo diferente aos poços apropriados da placa em triplicata. Transferir a placa de 96 poços para uma incubadora a 37 °C durante 24 h.
  6. Após 24 h de incubação, retire a placa de 96 poços e remova os meios culturais. Lave suavemente cada poço com água bidestilada (ddH2O) três vezes para remover as bactérias não combinadas.
  7. Adicione 250 μL de solução violeta de cristal a 2%10 a cada poço e incube em temperatura ambiente por 15 min para corar o biofilme.
  8. Remova a solução violeta de cristal a 2% da placa de 96 poços. Lave suavemente cada poço com ddH2O três vezes para remover o corante redundante. Em seguida, transfira a placa para uma incubadora a 37 °C por 15 min para secar os poços.
  9. Adicionar 300 μL de etanol a 95% a cada poço; Solubilize o cristal violeta corado no biofilme bacteriano.
  10. Ligue o espectrofotômetro de 96 poços; Defina a absorbância de detecção como 600 nm. Coloque a placa de 96 poços na carga e inicie a detecção.
  11. Compare o valor médio de várias amostras. Os dados são apresentados em relação à absorbância da cepa WT, que foi normalizada para 100%. Cada experimento precisa ser repetido, independentemente, pelo menos três vezes.

4. Isolamento de RNA e transcrição reversa

  1. Dois dias antes do ensaio de qPCR, listre os estoques congelados de E. coli F107 / 86, mutante ΔfimA , mutante ΔfimH , ΔfimA / pfimA e ΔfimH / pfimH nas placas de ágar LB para produzir colônias únicas, respectivamente. Transferir as placas para uma incubadora regulada para 37 °C e deixar crescer durante a noite.
  2. Um dia antes do ensaio, adicione 4 mL de meio indutor de biofilme aos tubos de cultura bacteriana estéreis. Escolha uma única colônia de culturas bacterianas listradas usando uma alça de inoculação estéril e toque a alça no meio indutor de biofilme. Tampe os tubos após a inoculação e coloque-os em um agitador com 180 rpm a 37 ° C, durante a noite.
  3. Transfira 30 μL da cultura bacteriana durante a noite para 3 mL de meio LB fresco nos tubos de vidro no dia do ensaio. Colocar os tubos numa incubadora agitável a 37 °C a 180 rpm.
  4. Após uma cultura de 4 h (OD600 ~ 2,0, bactérias cultivadas na fase mid-log), 1 mL de cultura de bactérias foi coletado por centrifugação (12.000 x g, 2 min) em um tubo de microcentrífuga estéril sem RNase de 2 mL.
  5. Adicione 200 μL de solução de lisozima (1 mg / mL) no tubo de 2 mL e incube a 37 ° C por 10 min.
  6. Adicione 800 μL de reagente de cloridrato de guanídio disponível comercialmente ao tubo; Em seguida, transfira o tubo para o gelo.
  7. Adicionar 200 μL de clorofórmio a cada tubo de amostra. Em seguida, tampe cuidadosamente o tubo e o vórtice por 15 s. Por fim, incube o tubo em temperatura ambiente por 10 min.
  8. A centrífuga de mesa é ajustada para uma temperatura de 4 °C e pré-resfriada antes do uso.
  9. Efectuar a centrifugação a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  10. Prepare e rotule os novos tubos sem RNase de 1,5 mL. Transferir a fase aquosa superior para o novo tubo, tomando cuidado para não perturbar as camadas média ou inferior.
  11. Adicione um volume igual de isopropanol no tubo; vórtice a mistura de camada aquosa e isopropanol e deixe as amostras em temperatura ambiente por 10 min.
  12. Efectuar a centrifugação a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  13. Observe o fundo do tubo para descobrir se há um pellet branco (RNA). Despeje cuidadosamente o sobrenadante do tubo em um recipiente de resíduos.
  14. Adicione 500 μL de etanol a 75% e vórtice para lavar o pellet de RNA.
  15. Efectuar a centrifugação mais uma vez, a 12.000 x g , durante 5 min a 4 °C.
  16. Aspire cuidadosamente para remover o sobrenadante o máximo possível.
  17. Seque ao ar os pellets de RNA brancos na bancada até que fiquem claros.
  18. Transfira 30 μL de ddH2O livre de RNase pré-fria para dissolver o RNA. Passe a solução algumas vezes para ajudar a dissolver. Mantenha as amostras no gelo o tempo todo.
  19. Detectar a concentração de RNA de cada amostra usando um microespectrofotômetro com 1 μL da amostra. Registar a concentração de todas as amostras.
  20. Para realizar a transcrição reversa, prepare a seguinte mistura em um tubo de centrífuga livre de RNase: 4 μL de master mix 4x, 1 μg de RNA molde e ddH2O livre de RNase até 16 μL.
  21. Misture delicadamente com uma pipeta. Tampe bem as amostras e rotule os tubos de PCR na lateral.
  22. Centrifugue os tubos de PCR brevemente (centrifugação curta) para coletar as amostras no fundo do tubo.
  23. Coloque os tubos de PCR em um termociclador e execute as amostras nas seguintes configurações: 42 °C por 2 min e depois mantenha a 4 °C.
  24. Adicione 4 μL de 5x Enzyme Mix à mistura da etapa anterior; misture delicadamente com uma pipeta.
  25. Centrifugue brevemente os tubos de PCR para coletar amostras no fundo do tubo.
  26. Coloque os tubos de PCR em um termociclador e execute as amostras nas seguintes configurações: 37 °C por 15 min, 85 °C por 5 s e, em seguida, mantenha a 4 °C.
  27. Diluir em série o produto 1:5 com ddH2O nos tubos, que podem ser usados diretamente em reações de qPCR, ou armazenar a -20 °C para uso posterior.

5. Análise de qPCR

  1. Planeje a configuração da placa qPCR de 96 poços para análise de amostras.
  2. Primers de descongelamento (para sequência, consulte a Tabela 1), misturas principais e cDNA no gelo.
  3. Prepare a mistura da seguinte forma para cada reação de poço: 10 μL de 2x SYBR qPCR Master Mix, 0,4 μL de Primer Forward e Primer Reverse e ddH2O até 18 μL.
    NOTA: Os principais fragmentos de genes de fímbrias bacterianas / adesina, incluindo fedF (que codifica a adesina de F18 fímbrias), fliC (que codifica a flagelina), ecpA (que codifica a subunidade principal de E. coli common pilus) e AIDA-I (que codifica a adesina envolvida na adesão difusa) são amplificados como genes-alvo. gapA (que codifica o gliceraldeído 3-fosfato) é usado como gene de referência.
  4. Vortex a mistura e centrifugue a 500 x g por 1 min. Usando uma pipeta repetidora, transfira cuidadosamente 18 μL da mistura para cada poço da placa de 96 poços.
  5. Transfira 2 μL de cDNA diluído (da etapa 3.8) para poços triplicados para cada conjunto de primers.
  6. Use um filme adesivo para selar a superfície da placa, garantindo que todos os poços sejam cobertos. Use um rolo para selar firmemente.
  7. Centrifugue a placa a 500 x g por 1 min. Uma placa vazia é usada como contrapeso.
  8. Ligue o sistema de PCR em tempo real; siga as instruções do reagente qPCR para definir os parâmetros. Certifique-se de que a curva de fusão esteja incluída no programa.
  9. Coloque a placa de 96 poços no termociclador e inicie a análise.
  10. Compare o valor das várias amostras e analise os dados com o método 2-ΔΔCT 24.

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Resultados

FimA é mais importante do que FimH na adesão e invasão de fímbrias F18ab + STEC às células IPEC-J2. Em comparação com a cepa WT, a exclusão de fimA reduziu a adesão de F18ab fímbrias + STEC às células IPEC-J2 em aproximadamente 86% (p < 0,01), enquanto a exclusão de fimH reduziu a adesão de STEC em aproximadamente 71% (p < 0,01) (Figura 1A). O bloqueio da adesina FimH da cepa WT por co-...

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Discussão

Os métodos fornecidos aqui ajudam a determinar com eficiência a função das fímbrias na colonização bacteriana. Curiosamente, neste estudo, a deleção de fimA mostrou 15% menos adesão do que o mutante fimH, sugerindo que a adesina da ponta pode não ser o único fator necessário para a adesão de fímbrias F18ab + STEC e que a subunidade de bastonetes fimbriais, FimA, também funciona na fixação bacteriana (Figura 1A)....

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 31672579).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well microplateCorning3599adhesion and invasion assay
96-well microplate(Round bottom)Corning3799biofilm formation
crystal violetSinopharm Chemical Reagent71012314Biofilm staining
dextroseSangon BiotechA610219Culture broth
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
F12 mediumGibco11765062Cell culture
FeSO4Sangon BiotechA501386Culture broth
K2HPO4Sinopharm Chemical Reagent20032116Culture broth
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent10017608Culture broth
L-ArabinoseSangon BiotechA610071λ-Red recombination
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent20025117Culture broth
NaClSinopharm Chemical Reagent10019308Culture broth
(NH4)2SO4Sinopharm Chemical Reagent10002917Culture broth
Micro spectrophotometerThermo FisherNano Drop oneNucleic acid concentration detection
New-born calf serumGibco16010159Cell culture
PeptoneSangon BiotechA505247Culture broth
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA EraserTaKaRaRR047qPCR
Real-Time PCRApplied Biosystems7500 systemqPCR
RPMI1640 mediumGibco11875500Cell culture
SpectrophotometerEppendorfBioSpectrometerAbsorbance detection
Spectrophotometer (96-well microplate)BioTekEpochAbsorbance detection
SYBR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qPCR
Tabletop centrifugeThermo FisherMicro 17(R)Centrifugation
thiamine hydrochlorideSangon BiotechA500986Culture broth
Triton X-100Sangon BiotechA110694adhesion and invasion assay
TRIzolInvitrogen15596018RNA isolation
TryptoneOxoidLP0042Culture broth
Yeast extractOxoidLP0021Culture broth

Referências

  1. Ofek, I., Beachey, E. H. Mannose binding and epithelial cell adherence of Escherichia coli. Infection and Immunity. 22 (1), 247-254 (1978).
  2. Khan, N. A., Kim, Y., Shin, S., Kim, K. S. FimH-mediated Escherichia coli K1 invasion of human brain microvascular endothelial cells. Cellular Microbiology. 9 (1), 169-178 (2007).
  3. Ashkar, A. A., et al. FimH adhesin of type 1 fimbriae is a potent inducer of innate antimicrobial responses which requires TLR4 and type 1 interferon signalling. PLoS Pathogens. 4 (12), (2008).
  4. Pusz, P., Bok, E., Mazurek, J., Stosik, M., Baldy-Chudzik, K. Type 1 fimbriae in commensal Escherichia coli derived from healthy humans. Acta Biochimica Polonica. 61 (2), 389-392 (2014).
  5. Gunther, N. W., Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In Vivo Dynamics of Type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infection and Immunity. 69 (5), 2838-2846 (2001).
  6. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).
  7. Imberechts, H., et al. Characterization of F18 fimbrial genes fedE and fedF involved in adhesion and length of enterotoxemic Escherichia coli strain 107/86. Microbial Pathogenesis. 21 (3), 183-192 (1996).
  8. Nagy, B., et al. Biological relationship between F18ab and F18ac fimbriae of enterotoxigenic and verotoxigenic Escherichia coli from weaned pigs with oedema disease or diarrhoea. Microbial Pathogenesis. 22 (1), 1-11 (1997).
  9. Ravi, M., et al. Contribution of AIDA-I to the pathogenicity of a porcine diarrheagenic Escherichia coli and to intestinal colonization through biofilm formation in pigs. Veterinary Microbiology. 120 (3-4), 308-319 (2007).
  10. Duan, Q., et al. The flagella of F18ab Escherichia coli is a virulence factor that contributes to infection in a IPEC-J2 cell model in vitro. Veterinary Microbiology. 160 (1-2), 132-140 (2012).
  11. Rendón, M. A., et al. Commensal and pathogenic Escherichia coli use a common pilus adherence factor for epithelial cell colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (25), 10637-10642 (2007).
  12. Duan, Q., Nandre, R., Zhou, M., Zhu, G. Type I fimbriae mediate in vitro adherence of porcine F18ac+ enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Annals of Microbiology. 44 (1), (2017).
  13. Zeiner, S. A., Dwyer, B. E., Clegg, S. FimA, FimF, and FimH are necessary for assembly of type 1 fimbriae on Salmonella enterica Serovar Typhimurium. Infection and Immunity. 80 (9), 3289-3296 (2012).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Guo, Z. Study on FimA mediated F18ab+ Escherichi coli pathogenicity. Yangzhou University. , MA dissertation [in Chinese] (2014).
  16. Kudva, I. T., Dean-Nystrom, E. A. Bovine recto-anal junction squamous epithelial (RSE) cell adhesion assay for studying Escherichia coli O157 adherence. Journal of Applied Microbiology. 111, 1283-1294 (2011).
  17. Berschneider, H. Development of normal cultured small intestinal epithelial cell lines which transport Na and Cl. Gastroenterology. 96, 41(1989).
  18. Brosnahan, A. J., Brown, D. R. Porcine IPEC-J2 intestinal epithelial cells in microbiological investigations. Veterinary Microbiology. 156, 229-237 (2012).
  19. Koh, S. Y., et al. Porcine intestinal epithelial cell lines as a new in vitro model for studying adherence and pathogenesis of enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 130, 191-197 (2008).
  20. Dogan, B., et al. Phylogroup and lpfA influence epithelial invasion by mastitis associated Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 159, 163-170 (2012).
  21. Hossain, M. M., Tsuyumu, S. Flagella-mediated motility is required for biofilm formation by Erwinia carotovora subsp. carotovora. Journal of General Plant Pathology. 72 (1), 34-39 (2006).
  22. Wang, Y., Chen, H., Zhu, X. Observation on Pseudomonas aeruginosa biofilm with sliver staining method. Chinese Journal of Microecology. 12 (1), (2012).
  23. Ambalam, P., Kondepudi, K. K., Nilsson, I., Wadström, T., Ljungh, Å Bile stimulates cell surface hydrophobicity, congo red binding and biofilm formation of lactobacillus strains. FEMS Microbiology Letters. 333 (1), 10-19 (2012).
  24. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), (2008).
  25. Kisiela, D. I., et al. Evolutionary analysis points to divergent physiological roles of type 1 fimbriae in Salmonella and Escherichia coli. mBio. 4 (2), (2013).
  26. Forero, M., Yakovenko, O., Sokurenko, E. V., Thomas, W. E., Vogel, V. Uncoiling mechanics of Escherichia coli type I fimbriae are optimized for catch bonds. PLoS Biology. 4 (9), 298(2006).
  27. Di Martino, P., Cafferini, N., Joly, B., Darfeuille-Michaud, A. Klebsiella pneumoniae type 3 pili facilitate adherence and biofilm formation on abiotic surfaces. Research in Microbiology. 154 (1), 9-16 (2003).
  28. Fazli, M., et al. The exopolysaccharide gene cluster Bcam1330-Bcam1341 is involved in Burkholderia cenocepacia biofilm formation, and its expression is regulated by c-di-GMP and Bcam1349. MicrobiologyOpen. 2 (1), 105-122 (2013).
  29. Zamani, H., Salehzadeh, A. Biofilm formation in uropathogenic Escherichia coli: association with adhesion factor genes. Turkish Journal of Medical Sciences. 48 (1), 162-167 (2018).
  30. Duan, Q., et al. Contribution of flagellin subunit FliC to piglet epithelial cells invasion by F18ab E. coli. Veterinary Microbiology. 166 (1-2), 220-224 (2013).

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