JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour étudier la fonction des fimbriae dans la colonisation bactérienne.

Résumé

Les fimbriae de type 1 sont d’importants déterminants de la virulence de certains agents pathogènes à Gram négatif, qui favorisent la colonisation bactérienne. La tige fimbriale est principalement composée de plusieurs copies de la sous-unité fimbriale majeure FimA. L’adhésine FimH, cependant, est présente sous la forme d’une structure de pointe fibrillaire qui entraîne la liaison des bactéries au récepteur cellulaire hôte contenant du mannose. Ici, nous fournissons des protocoles pour évaluer et comparer la fonction des sous-unités fimbriales de type 1 chez F18ab fimbriae+ Escherichia coli producteur de toxine Shiga (STEC). Nous avons constaté que FimA et FimH sont nécessaires à l’adhésion bactérienne, à l’invasion et à la formation de biofilms. La suppression du gène fimA a montré une réduction beaucoup plus importante de l’adhésion bactérienne et de l’invasion des cellules épithéliales cylindriques intestinales porcines IPEC-J2 que celle du mutant fimH . La formation de biofilm a été considérablement réduite chez les deux mutants à niveau égal. De plus, la qPCR a démontré que la délétion de fimA ou de fimH régulait à la baisse l’expression des flagelles bactériens et des gènes F18 fimbriae, tandis que l’adhésine régulée à la hausse était impliquée dans l’expression du gène d’adhésion diffuse I (AIDA-I), suggérant la co-régulation des adhésines localisées à la surface cellulaire dans F18ab fimbriae+ STEC.

Introduction

L’adhésion médiée par les fimbriae bactériennes facilite l’attachement bactérien à la surface d’une cellule cible et établit une infection initiale. Les fimbriae de type 1 sont largement répandus chez Escherichia coli (E. coli) et favorisent l’attachement bactérien aux cellules de mammifères en se liant au récepteur 1,2,3 contenant le mannose. Contrairement aux souches pathogènes, 85 % des souches commensales d’E. coli d’origine humaine testées n’expriment pas les fimbriae4 de type 1, ce qui indique son rôle critique dans l’infection par la maladie. Les fimbriae de type 1 sont également des facteurs de virulence importants pour les agents pathogènes extra-intestinaux, tels que E. coli uropathogène (UPEC) et E. coli causant la méningite néonatale (NMEC)2,5,6.

Les infections causées par les souches E. coli productrices de shigatoxines F18 fimbriae+ (y compris les deux variants ab et ac) sont associées à l’œdème porcin et à la diarrhée post-sevrage7. Le STEC porcin F18 fimbriae+ se fixe aux récepteurs épithéliaux intestinaux par une variété d’adhésines de surface, y compris F18 fimbriae, flagelles, le pilus commun d’E. coli (ECP) et l’adhésine impliquée dans l’adhérence diffuse (AIDA-I)8,9,10,11. Auparavant, nous avions étudié la fonction des fimbriae de type 1 chez F18ac fimbriae+ ETEC, ce qui a démontré que les fimbriae de type 1 facilitent la formation de biofilms bactériens et l’adhésion aux cellules hôtes12. Cependant, comme la pathogenèse de F18ab et de F18ac fimbriae+ STEC n’est pas totalement la même7, le rôle des fimbriae de type 1 dans F18ab fimbriae+ STEC reste incertain. Le bâtonnet fimbrial, principalement composé de plusieurs copies de la sous-unité fimbriale majeure, FimA, et l’adhésine FimH est assemblée en une structure de pointe fibrillaire qui entraîne la liaison des bactéries à l’hôte cellulaire contenant du mannose contenant le récepteur13. En utilisant la recombinaison λ-Red14, nous avons réussi à éliminer le gène fimA/fimH d’une souche STEC F107/86 F18ab fimbriae+ (de type sauvage, O139 :H1, Stx2e+), et construit des souches de complément pour cette étude15.

Ici, nous décrivons un protocole pour étudier la fonction des fimbriae bactériennes dans la colonisation. Le test d’adhésion bactérienne et le test d’invasion sont des méthodes majeures pour étudier les performances de liaison fimbriale des bactéries. Il est compliqué et coûteux d’effectuer un modèle de provocation animale ou d’isoler la lignée cellulaire primaire pour d’autres tests d’infection16. Habituellement, aucun de ces résultats n’est stable avec une bonne répétabilité puisque les différences individuelles sont présentes entre les animaux testés. Dans cette étude, des cellules IPEC-J2 sont utilisées. Il s’agit de cellules épithéliales cylindriques intestinales porcines qui ont été isolées à partir du jéjunum moyen d’un porceletnouveau-né 17. Il s’agit d’un modèle cellulaire in vitro stable permettant d’examiner les interactions de divers agents pathogènes animaux et humains, y compris Salmonella enterica et E. coli pathogène, avec les cellules épithéliales intestinales18, ce qui permet d’expliquer le rôle des fimbriae dans l’infection intestinale de manière pratique et rapide. Sinon, les cellules IPEC-1 sont une autre lignée de cellules épithéliales intestinales porcines largement utilisées, auquel cas la composition des récepteurs cellulaires est différente de celle d’IPEC-J219. Pour l’étude des bactéries pathogènes mammaires, il est préférable d’utiliser la lignée cellulaire épithéliale mammaire MAC-T20. Par conséquent, pour différentes conditions pathogènes bactériennes, le choix d’une lignée cellulaire appropriée qui imite les environnements in vivo est important.

De plus, le biofilm est une autre caractéristique essentielle de la survie bactérienne pendant la colonisation21. Dans les travaux précédents, l’argent et le rouge congo ont été utilisés pour colorer la formation du biofilm dans les tubes de verre qui ont montré visuellement les résultats22,23. Cependant, la différence de capacité de formation de biofilm entre les différentes souches ne peut pas être mesurée. Ici, nous présentons également un protocole pour la quantification de la formation de biofilm bactérien in vitro, qui pourrait facilement évaluer la capacité des fimbriae dans la formation de biofilm.

Les méthodes proposées dans cette étude utilisent une méthode in vitro simple et rapide pour déterminer la fonction des fimbriae bactériennes pendant le processus d’infection bactérienne, qui peut être largement adaptée à d’autres recherches dans l’étude du facteur de virulence dans le mécanisme pathogène bactérien.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Culture cellulaire

  1. Conserver les cellules IPEC-J2 dans une fiole de25 cm contenant 5 mL de milieux mixtes F12-RPMI1640 (1:1) sans antibiotiques complétés par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) à 37 °C, dans un incubateur à 5 % de CO2 .
  2. La veille de l’essai d’adhésion, utiliser 1 mL de solution de trypsine-EDTA à 0,05 % pour trypsiniser les cellules IPEC-J2 pendant 3 min. Retirez délicatement la solution de trypsine-EDTA avant que les cellules ne commencent à se détacher du flacon. Ajouter 3 mL de milieu de croissance et suspendre les cellules.
  3. Utilisez 10 μL de suspension cellulaire pour compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Diluer la suspension cellulaire à l’aide d’un milieu de culture cellulaire jusqu’à une concentration finale de 7 x 105 cellules/mL dans un tube conique de 15 mL.
  4. Transférer 100 μL de suspension cellulaire (~7 x 104 cellules) dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Assurez-vous que les cellules se répartissent uniformément dans les puits. Incuber la plaque à 37 °C avec 5 % de CO2 et laisser les cellules adhérer et se développer pendant la nuit, qui doit être à environ 90 % de confluence.

2. Essai d’adhésion et d’invasion des bactéries

  1. Deux jours avant l’essai d’adhésion, s’étaler sur des plaques de gélose LB séparées de souches congelées d’E. coli F107/86, de mutant ΔfimA, de mutant ΔfimH/pfimA et de ΔfimH/pfimH distinctes pour produire des colonies uniques. Conservez les plaques dans un incubateur réglé à 37 °C pour laisser les colonies grandir pendant la nuit.
  2. La veille de l’infection, prélever une seule colonie dans la plaque de culture bactérienne à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile et inoculer les bactéries avec 4 ml de bouillon Luria-Bertani (LB) dans un tube de culture bactérienne en verre. Après l’inoculation, bouchez les tubes et mettez-les dans un agitateur à 180 tr/min à 37 °C, pendant la nuit.
  3. Le jour de l’infection, sortez les cultures bactériennes qui ont poussé toute la nuit dans l’incubateur. Transvaser 30 μL de cette culture (dilution 1:100) dans un tube contenant un milieu fraîchement préparé. Placez les tubes à 37 °C dans un incubateur agitateur pendant 4 h (OD600 ~ 2.0, bactéries cultivées à mi-log).
  4. Après 4 h, préparer 1 mL de bouillon LB stérile en échantillon blanc. Mélangez 100 μL de sous-culture bactérienne et 900 μL de LB dans une cuvette en tant qu’échantillon bactérien. Préparez les tubes pour différents échantillons bactériens.
  5. Mesurez la densité optique (DO) des cultures bactériennes à l’aide d’un spectrophotomètre. Mesurez le diamètre extérieur à la longueur d’onde de 600 nm (OD600). Mesurez l’échantillon à blanc pour obtenir l’absorbance de fond.
  6. Mesurez les valeurs OD de tous les échantillons et enregistrez les valeurs OD600 . Calculez la concentration en tenant compte du facteur de dilution (10 dans cet exemple).
  7. Diluer la culture avec du F12-RPMI1640 frais (sans FBS) pour obtenir une DO d’environ 0,1, ce qui correspond à peu près à 1 x 108 ufc/mL. Ces suspensions bactériennes seront ensuite utilisées comme inoculum.
  8. Sortez de l’incubateur la plaque de 96 puits contenant les cellules cultivées pendant la nuit. À ce stade, il y a environ 1 x 105 cellules/puits dans la plaque. Étiquetez le couvercle de la plaque avec la souche bactérienne à utiliser pour l’infection de chaque puits, chaque infection étant réalisée en trois exemplaires.
  9. Retirez le milieu de chaque puits et lavez-le doucement trois fois avec du PBS pour éliminer les bactéries non adhérentes. Ajouter 100 μL de l’inoculum dans les puits appropriés. Transférez les cellules infectées dans un incubateur maintenu à 37 °C avec 5 % de CO2.
    1. Pour le test d’adhésion bactérienne, incubez les cellules infectées dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C pendant 1 h et passez directement à l’étape 2.12.
    2. Pour le test d’invasion bactérienne, incubez les cellules infectées dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C pendant 2 h et passez à l’étape 2.10.
  10. Après 2 h d’incubation, sortir la plaque à 96 puits et aspirer le milieu de culture à l’aide d’une pipette. Lavez doucement chaque puits avec du PBS trois fois pour éliminer les bactéries non adhérentes.
  11. Ajouter 200 μL de milieu cellulaire avec 100 μg/mL de gentamicine dans chaque puits, incuber dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C pendant 1 h pour tuer les bactéries extracellulaires.
  12. Après 1 h d’incubation, sortir la plaque à 96 puits et retirer le milieu de culture. Lavez doucement chaque puits avec du PBS trois fois pour éliminer les bactéries non adhérentes.
  13. Ajouter 200 μL de Triton X-100 à 0,5 % dans chaque puits pour lyser les cellules et incuber pendant 20 min à température ambiante.
  14. Transférez 200 μL de cellule lysée de chaque puits dans un nouveau tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Lavez chaque puits avec 300 μL de PBS et ajoutez également le tampon de lavage dans le tube de 1,5 ml.
  15. Effectuez une dilution en série de 10 fois de la suspension lytique recueillie avec du PBS dans des tubes.
  16. Déposer 100 μL des deux dilutions les plus faibles sur la plaque de gélose LB à l’aide d’un épandeur de cellules pour obtenir des colonies uniques. Incuber ces plaques pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur.
  17. Le lendemain, comptez les colonies formant des unités, qui représentent le nombre de bactéries adhérentes / envahissantes. Les données sont présentées par rapport au nombre de la souche WT, qui a été normalisé à 100 %. Chaque expérience doit être répétée indépendamment, au moins en trois exemplaires.

3. Essai de quantification de la formation du biofilm

  1. Deux jours avant le test de formation du biofilm, préparez les souches de bactéries comme à l’étape 2.1. Les plaques de culture bactérienne ont été incubées à 37 °C pendant la nuit.
  2. La veille du test, ajouter 4 mL de milieu inducteur de biofilm (pour la composition du milieu, voir réf.10) dans des tubes de culture bactérienne stériles. Prélever une seule colonie dans des cultures bactériennes striées à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile et transférer la colonie dans le milieu induisant un biofilm. Après l’inoculation, bouchez les tubes et mettez-les dans un agitateur à 120 tr/min à 30 °C, pendant la nuit.
  3. Le jour de l’essai, préparez la plaque à 96 puits à fond rond. Étiquetez le couvercle de la plaque en fonction de la souche incubée qui sera utilisée pour chaque puits, chaque souche étant faite en trois exemplaires.
  4. Transférez 10 μL de chaque culture bactérienne pendant la nuit (dilution de 1 sur 100) dans un milieu frais inducteur de biofilm de 990 μL dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Ces suspensions bactériennes seront ensuite utilisées comme inoculum.
  5. Ajouter 200 μL d’inoculum différent aux puits appropriés de la plaque en trois exemplaires. Transférez la plaque à 96 puits dans un incubateur à 37 °C pendant 24 h.
  6. Après 24 h d’incubation, sortir la plaque à 96 puits et retirer les milieux culturels. Lavez délicatement chaque puits avec de l’eau double distillée (ddH2O) trois fois pour éliminer les bactéries non combinées.
  7. Ajouter 250 μL de solution cristalline de violet à 2 %10 dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 15 minutes pour colorer le biofilm.
  8. Retirer la solution cristalline de violet à 2 % de la plaque à 96 puits. Lavez délicatement chaque puits avec du ddH2O trois fois pour éliminer le colorant redondant. Ensuite, transférez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 15 min pour sécher les puits.
  9. Ajouter 300 μL d’éthanol à 95 % dans chaque puits ; Solubiliser le violet cristallin coloré sur le biofilm bactérien.
  10. Allumez le spectrophotomètre à 96 puits ; Réglez l’absorbance de détection sur 600 nm. Placez la plaque à 96 puits sur la charge et lancez la détection.
  11. Comparez la valeur moyenne de différents échantillons. Les données sont présentées par rapport à l’absorbance de la déformation WT, qui a été normalisée à 100 %. Chaque expérience doit être répétée, indépendamment, au moins trois fois.

4. Isolement de l’ARN et transcription inverse

  1. Deux jours avant le test qPCR, s’étendez sur les plaques de gélose LB des stocks congelés d’E. coli F107/86, du mutant ΔfimA, du mutant ΔfimH/pfimA et du ΔfimH/pfimH sur les plaques de gélose LB pour produire des colonies uniques. Transférez les plaques dans un incubateur réglé à 37 °C et laissez pousser pendant la nuit.
  2. La veille de l’essai, ajouter 4 mL de milieu inducteur de biofilm dans des tubes de culture bactérienne stériles. Prélevez une seule colonie dans des cultures bactériennes striées à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile et touchez la boucle au milieu induisant le biofilm. Après l’inoculation, bouchez les tubes et mettez-les dans un agitateur à 180 tr/min à 37 °C, pendant la nuit.
  3. Transvaser 30 μL de la culture bactérienne de nuit dans 3 mL de milieu LB frais dans les tubes de verre le jour de l’essai. Placez les tubes dans un incubateur à agitation à 37 °C à 180 tr/min.
  4. Après une culture de 4 h (DO600 ~ 2,0, bactéries cultivées à mi-log), 1 mL de culture de bactéries a été prélevé par centrifugation (12 000 x g, 2 min) dans un tube de microcentrifugation stérile sans RNase de 2 mL.
  5. Ajouter 200 μL de solution de lysozyme (1 mg/mL) dans le tube de 2 mL et incuber à 37 °C pendant 10 min.
  6. Ajouter 800 μL de réactif de chlorhydrate de guanidium disponible dans le commerce dans le tube ; Ensuite, transférez le tube sur de la glace.
  7. Ajouter 200 μL de chloroforme dans chaque tube d’échantillon. Ensuite, bouchez soigneusement le tube et le vortex pendant 15 s. Enfin, incubez le tube à température ambiante pendant 10 min.
  8. La centrifugeuse de table est réglée à une température de 4 °C et pré-froide avant utilisation.
  9. Effectuer la centrifugation à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  10. Préparez et étiquetez les nouveaux tubes sans RNase de 1,5 ml. Transférez la phase aqueuse supérieure dans le nouveau tube, en prenant soin de ne pas déranger les couches intermédiaires ou inférieures.
  11. Ajouter un volume égal d’isopropanol dans le tube ; vortex le mélange de couche aqueuse et d’isopropanol et laissez les échantillons reposer à température ambiante pendant 10 min.
  12. Effectuer la centrifugation à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  13. Regardez le fond du tube pour voir s’il y a une pastille blanche (ARN). Versez délicatement le surnageant du tube dans un récipient à déchets.
  14. Ajouter 500 μL d’éthanol à 75 % et un vortex pour laver la pastille d’ARN.
  15. Effectuez à nouveau la centrifugation, à 12 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
  16. Aspirez soigneusement pour éliminer le surnageant autant que possible.
  17. Faites sécher à l’air libre les pastilles d’ARN blanc sur la paillasse jusqu’à ce qu’elles deviennent claires.
  18. Transférez 30 μL de ddH2O sans RNase pré-froide pour dissoudre l’ARN. Passez la solution plusieurs fois pour aider à dissoudre. Gardez les échantillons sur de la glace tout le long.
  19. Détectez la concentration d’ARN de chaque échantillon à l’aide d’un microspectrophotomètre avec 1 μL de l’échantillon. Noter la concentration de tous les échantillons.
  20. Pour effectuer la transcription inverse, préparez le mélange suivant dans un tube à centrifuger sans RNase : 4 μL de mélange maître 4x, 1 μg d’ARN matrice et ddH2O sans RNase jusqu’à 16 μL.
  21. Mélangez délicatement à l’aide d’une pipette. Fermez hermétiquement les échantillons et étiquetez les tubes PCR sur le côté.
  22. Centrifugez brièvement les tubes PCR (spin court) pour prélever les échantillons au fond du tube.
  23. Placez les tubes PCR dans un thermocycleur et analysez les échantillons dans les paramètres suivants : 42 °C pendant 2 min, puis maintenez-les à 4 °C.
  24. Ajouter 4 μL de 5x Enzyme Mix au mélange de l’étape précédente ; Mélangez délicatement à l’aide d’une pipette.
  25. Centrifugez brièvement les tubes PCR pour prélever des échantillons au fond du tube.
  26. Placez les tubes PCR dans un thermocycleur et analysez les échantillons dans les paramètres suivants : 37 °C pendant 15 min, 85 °C pendant 5 s, puis maintenez à 4 °C.
  27. Diluez en série le produit 1:5 avec du ddH2O dans les tubes, qui peuvent être directement utilisés dans les réactions qPCR, ou stockés à -20 °C pour une utilisation ultérieure.

5. Analyse qPCR

  1. Planifiez la configuration de la plaque qPCR à 96 puits pour l’analyse des échantillons.
  2. Amorces de décongélation (pour la séquence, voir le tableau 1), mélanges maîtres et ADNc sur glace.
  3. Préparez le mélange comme suit pour chaque réaction de puits : 10 μL de 2x SYBR qPCR Master Mix, 0,4 μL d’amorce avant et d’amorce arrière, et ddH2O jusqu’à 18 μL.
    REMARQUE : Les principaux fragments du gène bactérien fimbriae/adhésine, y compris fedF (codant pour l’adhésine de F18 fimbriae), fliC (codant pour la flagelline), ecpA (codant pour la sous-unité majeure du pilus commun d’E . coli ) et AIDA-I (codant pour l’adhésine impliquée dans l’adhésion diffuse) sont amplifiés en tant que gènes cibles. gapA (codant pour le glycéraldéhyde 3-phosphate) est utilisé comme gène de référence.
  4. Vortex le mélange et centrifuger à 500 x g pendant 1 min. À l’aide d’une pipette à répéteur, transférez soigneusement 18 μL du mélange dans chaque puits de la plaque à 96 puits.
  5. Transférez 2 μL d’ADNc dilué (à l’étape 3.8) dans des puits triples pour chaque ensemble d’amorces.
  6. Utilisez un film adhésif pour sceller la surface de la plaque, en vous assurant que tous les puits sont couverts. Utilisez un rouleau pour sceller fermement.
  7. Centrifuger la plaque à 500 x g pendant 1 min. Une assiette vide sert de contrepoids.
  8. Activez le système de PCR en temps réel ; suivez les instructions du réactif qPCR pour définir les paramètres. Assurez-vous que la courbe de fusion est incluse dans le programme.
  9. Placez la plaque à 96 puits dans le thermocycleur et lancez l’analyse.
  10. Comparez la valeur des différents échantillons et analysez les données avec la méthode 2-ΔΔCT 24.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

FimA est plus important que FimH dans l’adhésion et l’invasion de F18ab fimbriae+ STEC aux cellules IPEC-J2. Par rapport à la souche WT, la suppression de fimA a réduit l’adhérence de F18ab fimbriae+ STEC aux cellules IPEC-J2 d’environ 86 % (p < 0,01), tandis que la suppression de fimH a réduit l’adhésion de STEC d’environ 71 % (p < 0,01) (Figure 1A). Le blocage de l’adhésine FimH...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Les méthodes fournies ici aident à déterminer efficacement la fonction des fimbriae dans la colonisation bactérienne. Il est intéressant de noter que dans cette étude, la délétion de fimA a montré une adhérence inférieure de 15 % à celle du mutant fimH, ce qui suggère que l’adhésine de la pointe n’est peut-être pas le seul facteur requis pour l’adhésion de F18ab fimbriae+ STEC et que la sous-unité de la tige fimbriale, FimA, fonctionne ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 31672579).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well microplateCorning3599adhesion and invasion assay
96-well microplate(Round bottom)Corning3799biofilm formation
crystal violetSinopharm Chemical Reagent71012314Biofilm staining
dextroseSangon BiotechA610219Culture broth
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
F12 mediumGibco11765062Cell culture
FeSO4Sangon BiotechA501386Culture broth
K2HPO4Sinopharm Chemical Reagent20032116Culture broth
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent10017608Culture broth
L-ArabinoseSangon BiotechA610071λ-Red recombination
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent20025117Culture broth
NaClSinopharm Chemical Reagent10019308Culture broth
(NH4)2SO4Sinopharm Chemical Reagent10002917Culture broth
Micro spectrophotometerThermo FisherNano Drop oneNucleic acid concentration detection
New-born calf serumGibco16010159Cell culture
PeptoneSangon BiotechA505247Culture broth
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA EraserTaKaRaRR047qPCR
Real-Time PCRApplied Biosystems7500 systemqPCR
RPMI1640 mediumGibco11875500Cell culture
SpectrophotometerEppendorfBioSpectrometerAbsorbance detection
Spectrophotometer (96-well microplate)BioTekEpochAbsorbance detection
SYBR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qPCR
Tabletop centrifugeThermo FisherMicro 17(R)Centrifugation
thiamine hydrochlorideSangon BiotechA500986Culture broth
Triton X-100Sangon BiotechA110694adhesion and invasion assay
TRIzolInvitrogen15596018RNA isolation
TryptoneOxoidLP0042Culture broth
Yeast extractOxoidLP0021Culture broth

Références

  1. Ofek, I., Beachey, E. H. Mannose binding and epithelial cell adherence of Escherichia coli. Infection and Immunity. 22 (1), 247-254 (1978).
  2. Khan, N. A., Kim, Y., Shin, S., Kim, K. S. FimH-mediated Escherichia coli K1 invasion of human brain microvascular endothelial cells. Cellular Microbiology. 9 (1), 169-178 (2007).
  3. Ashkar, A. A., et al. FimH adhesin of type 1 fimbriae is a potent inducer of innate antimicrobial responses which requires TLR4 and type 1 interferon signalling. PLoS Pathogens. 4 (12), (2008).
  4. Pusz, P., Bok, E., Mazurek, J., Stosik, M., Baldy-Chudzik, K. Type 1 fimbriae in commensal Escherichia coli derived from healthy humans. Acta Biochimica Polonica. 61 (2), 389-392 (2014).
  5. Gunther, N. W., Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In Vivo Dynamics of Type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infection and Immunity. 69 (5), 2838-2846 (2001).
  6. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).
  7. Imberechts, H., et al. Characterization of F18 fimbrial genes fedE and fedF involved in adhesion and length of enterotoxemic Escherichia coli strain 107/86. Microbial Pathogenesis. 21 (3), 183-192 (1996).
  8. Nagy, B., et al. Biological relationship between F18ab and F18ac fimbriae of enterotoxigenic and verotoxigenic Escherichia coli from weaned pigs with oedema disease or diarrhoea. Microbial Pathogenesis. 22 (1), 1-11 (1997).
  9. Ravi, M., et al. Contribution of AIDA-I to the pathogenicity of a porcine diarrheagenic Escherichia coli and to intestinal colonization through biofilm formation in pigs. Veterinary Microbiology. 120 (3-4), 308-319 (2007).
  10. Duan, Q., et al. The flagella of F18ab Escherichia coli is a virulence factor that contributes to infection in a IPEC-J2 cell model in vitro. Veterinary Microbiology. 160 (1-2), 132-140 (2012).
  11. Rendón, M. A., et al. Commensal and pathogenic Escherichia coli use a common pilus adherence factor for epithelial cell colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (25), 10637-10642 (2007).
  12. Duan, Q., Nandre, R., Zhou, M., Zhu, G. Type I fimbriae mediate in vitro adherence of porcine F18ac+ enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Annals of Microbiology. 44 (1), (2017).
  13. Zeiner, S. A., Dwyer, B. E., Clegg, S. FimA, FimF, and FimH are necessary for assembly of type 1 fimbriae on Salmonella enterica Serovar Typhimurium. Infection and Immunity. 80 (9), 3289-3296 (2012).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Guo, Z. Study on FimA mediated F18ab+ Escherichi coli pathogenicity. Yangzhou University. , MA dissertation [in Chinese] (2014).
  16. Kudva, I. T., Dean-Nystrom, E. A. Bovine recto-anal junction squamous epithelial (RSE) cell adhesion assay for studying Escherichia coli O157 adherence. Journal of Applied Microbiology. 111, 1283-1294 (2011).
  17. Berschneider, H. Development of normal cultured small intestinal epithelial cell lines which transport Na and Cl. Gastroenterology. 96, 41(1989).
  18. Brosnahan, A. J., Brown, D. R. Porcine IPEC-J2 intestinal epithelial cells in microbiological investigations. Veterinary Microbiology. 156, 229-237 (2012).
  19. Koh, S. Y., et al. Porcine intestinal epithelial cell lines as a new in vitro model for studying adherence and pathogenesis of enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 130, 191-197 (2008).
  20. Dogan, B., et al. Phylogroup and lpfA influence epithelial invasion by mastitis associated Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 159, 163-170 (2012).
  21. Hossain, M. M., Tsuyumu, S. Flagella-mediated motility is required for biofilm formation by Erwinia carotovora subsp. carotovora. Journal of General Plant Pathology. 72 (1), 34-39 (2006).
  22. Wang, Y., Chen, H., Zhu, X. Observation on Pseudomonas aeruginosa biofilm with sliver staining method. Chinese Journal of Microecology. 12 (1), (2012).
  23. Ambalam, P., Kondepudi, K. K., Nilsson, I., Wadström, T., Ljungh, Å Bile stimulates cell surface hydrophobicity, congo red binding and biofilm formation of lactobacillus strains. FEMS Microbiology Letters. 333 (1), 10-19 (2012).
  24. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), (2008).
  25. Kisiela, D. I., et al. Evolutionary analysis points to divergent physiological roles of type 1 fimbriae in Salmonella and Escherichia coli. mBio. 4 (2), (2013).
  26. Forero, M., Yakovenko, O., Sokurenko, E. V., Thomas, W. E., Vogel, V. Uncoiling mechanics of Escherichia coli type I fimbriae are optimized for catch bonds. PLoS Biology. 4 (9), 298(2006).
  27. Di Martino, P., Cafferini, N., Joly, B., Darfeuille-Michaud, A. Klebsiella pneumoniae type 3 pili facilitate adherence and biofilm formation on abiotic surfaces. Research in Microbiology. 154 (1), 9-16 (2003).
  28. Fazli, M., et al. The exopolysaccharide gene cluster Bcam1330-Bcam1341 is involved in Burkholderia cenocepacia biofilm formation, and its expression is regulated by c-di-GMP and Bcam1349. MicrobiologyOpen. 2 (1), 105-122 (2013).
  29. Zamani, H., Salehzadeh, A. Biofilm formation in uropathogenic Escherichia coli: association with adhesion factor genes. Turkish Journal of Medical Sciences. 48 (1), 162-167 (2018).
  30. Duan, Q., et al. Contribution of flagellin subunit FliC to piglet epithelial cells invasion by F18ab E. coli. Veterinary Microbiology. 166 (1-2), 220-224 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Tige fimbrialeF18ab FimbriaeSTECFimbriae de type 1D terminants de la virulenceFimAFimHColonisation bact rienneadh sioninvasionformation de biofilmd l tion de g nesQPCRexpression g nique AIDA Icellules intestinales porcinescor gulation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.