JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол изучения функции фимбрий в бактериальной колонизации.

Аннотация

Фимбрии 1-го типа являются важными детерминантами вирулентности некоторых грамотрицательных патогенов, которые способствуют колонизации бактерий. Фимбриальный стержень в основном состоит из множественных копий основной фимбриальной субъединицы FimA. Адгезин FimH, однако, присутствует в виде фибриллярной кончиковой структуры, которая заставляет бактерии связываться с рецептором клеточной маннозы хозяина. В данной статье мы приводим протоколы для оценки и сравнения функции фимбриальных субъединиц типа 1 в F18ab fimbriae+ Escherichia coli, продуцирующей токсин шига. Мы обнаружили, что как FimA, так и FimH необходимы для адгезии бактерий, инвазии и образования биопленки. Удаление гена fimA показало гораздо большее снижение бактериальной адгезии и инвазии в столбчатые эпителиальные клетки кишечника свиней IPEC-J2, чем у мутанта fimH. Биопленкообразование было значительно снижено у обоих мутантов с одинаковым уровнем. Кроме того, кПЦР показала, что делеция fimA или fimH подавляет экспрессию бактериальных жгутиков и генов F18 fimbriae, в то время как повышенная адгезин участвует в экспрессии гена диффузной адгезии-I (AIDA-I), что свидетельствует о совместной регуляции локализованных на клеточной поверхности адгезинов в F18ab fimbriae+ STEC.

Введение

Адгезия, опосредованная бактериальными фимбриями, способствует прикреплению бактерий к поверхности клетки-мишени и создает начальную инфекцию. Фимбрии 1-го типа широко распространены среди кишечной палочки (E. coli) и способствуют прикреплению бактерий к клеткам млекопитающих путем связывания с маннозсодержащим рецептором 1,2,3. В отличие от патогенных штаммов, 85% исследуемых комменсальных штаммов E. coli человеческого происхождения не экспрессируют fimbriae4 типа 1, что указывает на его критическую роль в инфицировании заболеванием. Фимбрии 1-го типа также являются важными факторами вирулентности для внекишечных патогенов, таких как уропатогенная кишечная палочка (UPEC) и неонатальная кишечная палочка, вызывающая менингит (NMEC)2,5,6.

Инфекции, вызванные штаммами F18 fimbriae+ (включая два варианта: ab и ac), продуцирующими токсин шига E. coli (STEC), связаны с отечной болезнью свиней (ЭД) и диареей после отъема (PWD)7. F18 fimbriae+ STEC прикрепляется к эпителиальным рецепторам кишечника с помощью различных поверхностных адгезинов, включая F18 fimbriae, жгутики, кишечную палочку обыкновенную (ECP) и адгезин, участвующий в диффузной адгезии (AIDA-I)8,9,10,11. Ранее мы исследовали функцию фимбрий 1-го типа в F18ac fimbriae+ ETEC, что продемонстрировало, что фимбрии 1-го типа способствуют образованию бактериальной биопленки и адгезии к клеткам-хозяевам12. Однако, поскольку патогенез F18ab и F18ac fimbriae+ STEC не полностью одинаков7, роль фимбрий 1 типа в F18ab fimbriae+ STEC остается неясной. Фимбриальный стержень в основном состоит из множественных копий основной фимбриальной субъединицы FimA, а адгезин FimH собран в фибриллярную структуру кончика, которая стимулирует связывание бактерий с клеточной маннозой хозяина, содержащей рецептор13. Используя λ-красную рекомбинацию14, мы успешно нокаутировали ген fimA/fimH из штамма F107/86 F18ab fimbriae+ STEC (дикого типа, O139:H1, Stx2e+) и сконструировали штаммы комплемента для этого исследования15.

Здесь мы описываем протокол изучения функции бактериальных фимбрий в колонизации. Анализ адгезии бактерий и анализ инвазии являются основными методами исследования эффективности связывания бактерий. Проведение провокационной модели на животных или выделение первичной клеточной линии для дальнейших анализов инфекции является сложным и дорогостоящим процессом16. Как правило, ни один из этих результатов не является стабильным с хорошей повторяемостью, поскольку индивидуальные различия присутствуют между испытуемым животным. В данном исследовании используются клетки IPEC-J2. Это столбчатые эпителиальные клетки кишечника свиньи, которые были выделены из середины17-й тощей кишки новорожденного поросенка. Это стабильная клеточная модель in vitro для изучения взаимодействия различных патогенов животных и человека, включая Salmonella enterica и патогенную кишечную палочку, с эпителиальными клетками кишечника18, что помогает удобно и быстро объяснить роль фимбрий в кишечной инфекции. В противном случае клетки IPEC-1 являются еще одной широко используемой линией эпителиальных клеток кишечника свиней, и в этом случае состав клеточных рецепторов отличается от IPEC-J219. Для исследования патогенных бактерий молочной железы лучше использовать эпителиальные клетки молочной железы линии MAC-T20. Следовательно, для различных бактериальных патогенных состояний важен выбор подходящей клеточной линии, которая имитирует среду in vivo.

Кроме того, биопленка является еще одной важной характеристикой для выживания бактерий во время колонизации. В предыдущих работах серебро и конголезский красный использовались для окрашивания образования биопленки в стеклянных трубках, что визуально показало результаты22,23. Однако разница в способности биопленки к образованию между различными штаммами не может быть измерена. Здесь мы также представляем протокол количественной оценки образования бактериальной биопленки in vitro, который может легко оценить способность фимбрий к образованию биопленки.

Методы, предложенные в этом исследовании, используют быстрый и простой in vitro способ определения функции бактериальных фимбрий в процессе бактериальной инфекции, который может быть широко адаптирован к другим исследованиям по изучению фактора вирулентности в бактериальном патогенетическом механизме.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Культура клеток

  1. Поддерживайте клетки IPEC-J2 в колбе размером 25см2 , содержащей 5 мл смешанной среды F12-RPMI1640 без антибиотиков (1:1) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) при температуре 37 °C, в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 .
  2. За сутки до анализа адгезии используйте 1 мл 0,05% раствора трипсин-ЭДТА для трипсинизации клеток IPEC-J2 в течение 3 минут. Аккуратно удалите раствор трипсин-ЭДТА, прежде чем клетки начнут выделяться из колбы. Добавьте 3 мл питательной среды и подвесьте клетки.
  3. Используйте 10 мкл клеточной суспензии для подсчета клеток с помощью гемоцитометра. Разбавляют клеточную суспензию в среде для клеточных культур до конечной концентрации 7 x 105 клеток/мл в конической пробирке объемом 15 мл.
  4. Перенесите 100 мкл клеточной суспензии (~7 x 104 клетки) в каждую лунку 96-луночного планшета. Следите за тем, чтобы ячейки равномерно распределялись в лунках. Инкубируйте планшет при 37 °C с 5%CO2 и дайте клеткам прилипнуть и вырасти в течение ночи, которая должна быть при слиянии около 90%.

2. Анализ на адгезию и инвазию бактерий

  1. За два дня до анализа адгезии поместите замороженные запасы E. coli F107/86, мутанта ΔfimA , мутантаΔ fimH , ΔfimA/pfimA и ΔfimH/pfimH на отдельные пластины агара LB для получения одиночных колоний. Держите тарелки в инкубаторе при температуре 37 °C, чтобы дать колониям вырасти за ночь.
  2. За день до заражения выберите одну колонию из бактериального планшета с помощью стерильной петли инокуляции и инокулируйте бактерии 4 мл бульона Лурия-Бертани (LB) в бактериальную стеклянную пробирку для культивирования. После инокуляции закройте пробирки крышками и поместите их в шейкер со скоростью 180 об/мин при 37 °C на ночь.
  3. В день заражения удалите бактериальные культуры, которые росли в инкубаторе в течение ночи. Перенесите 30 μL этой культуры (в разведении 1:100) в пробирку со свежеприготовленной средой. Поместите пробирки при температуре 37 °C в встряхивающий инкубатор на 4 ч (наружный диаметр600 ~ 2,0, бактерии, выращенные в середине логарифмической фазы).
  4. Через 4 ч приготовьте 1 мл стерильного бульона LB в качестве пустого образца. Смешайте 100 μL бактериальной субкультуры и 900 μL LB в одну кювету в качестве бактериального образца. Подготовьте пробирки для различных образцов бактерий.
  5. Измерьте оптическую плотность (OD) бактериальных культур с помощью спектрофотометра. Измерьте OD на длине волны 600 нм (OD600). Измерьте чистый образец, чтобы получить фоновую абсорбцию.
  6. Измерьте значения наружного диаметра для всех образцов и запишите значения наружного диаметра600 . Рассчитайте концентрацию с учетом коэффициента разбавления (10 в этом примере).
  7. Разведите культуру свежим F12-RPMI1640 (без FBS) до получения ОД примерно 0,1, что примерно соответствует 1 х10 8 КОЕ/мл. Эти бактериальные суспензии в дальнейшем будут использоваться в качестве посевного материала.
  8. Достаньте из инкубатора 96-луночный планшет, содержащий культивируемые за ночь клетки. На этом этапе в пластине имеется примерно 1 x 105 ячеек/лунок. Пометьте крышку планшета штаммом бактерий, который будет использоваться для заражения каждой лунки, при этом каждое заражение проводится в трех экземплярах.
  9. Удалите фильтрующий материал из каждой лунки и осторожно промойте каждую лунку PBS три раза, чтобы удалить неадгезивные бактерии. Добавьте 100 мкл инокулюма в соответствующие лунки. Перенесите инфицированные клетки в инкубатор, где поддерживается температура 37 °C с 5%CO2.
    1. Для анализа адгезии бактерий инфицированные клетки инкубируют в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C в течение 1 ч и непосредственно переходят к шагу 2.12.
    2. Для анализа на инвазию бактерий инкубируйте инфицированные клетки в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C в течение 2 ч и переходите к шагу 2.10.
  10. После 2 ч инкубации извлеките 96-луночный планшет и отаскуйте питательную среду с помощью пипетки. Аккуратно промойте каждую лунку PBS три раза, чтобы удалить неприлипшие бактерии.
  11. Добавьте в каждую лунку 200 мкл клеточной среды с 100 мкг/мл гентамицина, инкубируйте в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при 37 °C в течение 1 ч для уничтожения внеклеточных бактерий.
  12. Через 1 ч инкубации выньте 96 лунку планшета и удалите питательную среду. Аккуратно промойте каждую лунку PBS три раза, чтобы удалить неприлипшие бактерии.
  13. Добавьте 200 мкл 0,5% Triton X-100 в каждую лунку для лизирования клеток и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
  14. Перенесите 200 мкл лизированной клетки из каждой лунки в новую стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Промойте каждую лунку PBS объемом 300 мкл и добавьте буфер для промывки в пробирку объемом 1,5 мл.
  15. Выполнить 10-кратное серийное разведение собранной литической суспензии с ПБС в пробирках.
  16. Планшет 100 мкл двух самых низких разведений на агаровую пластину LB с использованием распределителя клеток для получения одиночных колоний. Инкубируйте эти планшеты в течение ночи при температуре 37 °C в инкубаторе.
  17. На следующий день подсчитайте колонии, образующие единицы, которые представляют собой количество адгезивных/инвазивных бактерий. Данные представлены относительно количества штамма WT, которое было нормализовано до 100%. Каждый эксперимент нужно повторять независимо друг от друга, как минимум в трех размерах.

3. Количественный анализ образования биопленки

  1. За два дня до анализа на образование биопленки подготовьте штаммы бактерий, как показано на шаге 2.1. Бактериальные культуральные планшеты инкубировали при 37 °C в течение ночи.
  2. За день до анализа добавьте 4 мл среды, индуцирующей биопленку (состав среды см. в ссылке 10) в стерильные пробирки для бактериальных культур. Выберите одну колонию из прожилированных бактериальных культур с помощью стерильной инокуляционной петли и перенесите колонию в среду, вызывающую биопленку. После инокуляции закройте пробирки крышками и поместите их в шейкер со скоростью 120 об/мин при 30 °C на ночь.
  3. В день проведения анализа подготовьте пластину на 96 лунок с круглым дном. Пометьте крышку планшета в соответствии с инкубируемым штаммом, который будет использоваться для каждой лунки, причем каждый штамм будет производиться в трех экземплярах.
  4. Перенесите по 10 мкл каждой бактериальной культуры на ночь (1 на 100 разведение) в 990 мкл свежей среды, индуцирующей биопленку, в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Эти бактериальные суспензии в дальнейшем будут использоваться в качестве посевного материала.
  5. Добавьте 200 μл различного инокулюма в соответствующие лунки планшета в трех экземплярах. Перенесите планшет на 96 лунок в инкубатор при температуре 37 °C на 24 часа.
  6. После 24 ч инкубации извлеките 96-луночный планшет и удалите питательные среды. Аккуратно промойте каждую лунку двойной дистиллированной водой (ddH2O) три раза, чтобы удалить необъединенные бактерии.
  7. Добавьте по 250 мкл 2% кристаллического фиолетового раствора по10 в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин для окрашивания биопленки.
  8. Удалите 2% кристаллический фиолетовый раствор из 96-луночного планшета. Аккуратно промойте каждую лунку ddH2O три раза, чтобы удалить лишний краситель. Затем перенесите планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 15 минут, чтобы просушить лунки.
  9. Добавьте в каждую лунку по 300 μл 95% этанола; Растворите кристалл фиалки, окрашенный на бактериальную биопленку.
  10. Включите 96 луночный спектрофотометр; Установите значение Detect absorbance равным 600 нм. Наденьте пластину на 96 лунок на груз и начните обнаружение.
  11. Сравните среднее значение различных образцов. Данные представлены относительно поглощения деформации WT, которая была нормализована до 100%. Каждый эксперимент нужно повторять, независимо друг от друга, не менее трех раз.

4. Выделение РНК и обратная транскрипция

  1. За два дня до количественной ПЦР внесите замороженные запасы E. coli F107/86, мутанта ΔfimA , мутантаΔ fimH , ΔfimA/pfimA и ΔfimH/pfimH на агаровые планшеты LB для получения одиночных колоний соответственно. Перенесите пластины в инкубатор, установленный на 37 °C, и дайте им вырасти в течение ночи.
  2. За день до анализа добавьте 4 мл среды, индуцирующей биопленку, в стерильные пробирки для бактериальных культур. Выберите одну колонию из полосатых бактериальных культур с помощью стерильной петли инокуляции и прикоснитесь петлей к среде, вызывающей биопленку. После инокуляции закройте пробирки крышками и поместите их в шейкер со скоростью 180 об/мин при 37 °C на ночь.
  3. Перенесите 30 мкл ночной бактериальной культуры в 3 мл свежей LB-среды в стеклянных пробирках в день анализа. Поместите пробирки в встряхивающий инкубатор при температуре 37 °C и 180 об/мин.
  4. После 4-часового посева (наружный диаметр600 ~ 2,0, бактерии, выращенные в середине логарифмической фазы) 1 мл бактериальной культуры собирали центрифугированием (12 000 х г, 2 минуты) в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл без РНКазы.
  5. Добавьте 200 мкл раствора лизоцима (1 мг/мл) в пробирку объемом 2 мл и инкубируйте при 37 °C в течение 10 минут.
  6. Добавьте в пробирку 800 μл коммерчески доступного реагента гидрохлорида гуанидия; Затем переложите трубку на лед.
  7. Добавьте 200 мкл хлороформа в каждую пробирку с образцом. Затем аккуратно закройте трубку и затвор на 15 с. Наконец, инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение 10 минут.
  8. Настольная центрифуга устанавливается на температуру 4 °C и предварительно охлаждается перед использованием.
  9. Выполните центрифугирование при давлении 12 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  10. Подготовьте и промаркируйте новые пробирки, не содержащие РНКазы объемом 1,5 мл. Перенесите верхнюю водную фазу в новую трубку, стараясь не потревожить средние или нижние слои.
  11. Добавьте в пробирку равный объем изопропанола; Смешайте смесь водного слоя и изопропанола и дайте образцам постоять при комнатной температуре в течение 10 минут.
  12. Выполните центрифугирование при давлении 12 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  13. Понаблюдайте за дном пробирки, чтобы определить, есть ли там белая гранула (РНК). Аккуратно вылейте надосадочную жидкость из пробирки в контейнер для отходов.
  14. Добавьте 500 μл 75% этанола и вортекс, чтобы промыть РНК-гранулы.
  15. Проведите центрифугирование еще раз, при 12 000 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  16. Осторожно аспирируйте, чтобы удалить надосадочную жидкость как можно больше.
  17. Высушите белые гранулы РНК на воздухе на столе, пока они не станут прозрачными.
  18. Перенесите 30 мкл предварительно холодной РНКазы ddH2O для растворения РНК. Пропустите раствор несколько раз, чтобы раствориться. Держите образцы на льду все это время.
  19. Определите концентрацию РНК в каждом образце с помощью микроспектрофотометра с 1 мкл образца. Запишите концентрацию всех образцов.
  20. Чтобы выполнить обратную транскрипцию, приготовьте следующую смесь в центрифужной пробирке, не содержащей РНКазы: 4 мкл 4x мастер-смеси, 1 мкг матричной РНК и ddH без РНКазы2O до 16 мкл.
  21. Аккуратно перемешайте пипеткой. Плотно закройте образцы крышками и пробирки для ПЦР промаркируйте сбоку.
  22. Кратковременно центрифугируйте пробирки для ПЦР (короткий отжим), чтобы собрать образцы на дне пробирки.
  23. Поместите пробирки для ПЦР в термоамплификатор и запустите образцы при следующих настройках: 42 °C в течение 2 минут, а затем подержите при 4 °C.
  24. Добавьте 4 мкл 5x Enzyme Mix к смеси предыдущего шага; Аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
  25. Кратковременно центрифугируйте пробирки для ПЦР, чтобы собрать образцы на дно пробирки.
  26. Поместите пробирки для ПЦР в амплификатор и запустите образцы при следующих настройках: 37 °C в течение 15 мин, 85 °C в течение 5 с, а затем подержите при 4 °C.
  27. Последовательно разбавляйте продукт в соотношении 1:5 с ddH2O в пробирках, которые можно непосредственно использовать в реакциях количественной ПЦР, или храните при температуре -20 °C для дальнейшего использования.

5. Анализ количественной ПЦР

  1. Спланируйте настройку 96-луночного планшета для количественной ПЦР для анализа образцов.
  2. Разморозьте праймеры (последовательность см. Таблицу 1), мастер-смеси и кДНК на льду.
  3. Приготовьте смесь следующим образом для каждой реакции лунки: 10 мкл 2x SYBR qPCR Master Mix, 0,4 мкл Primer Forward и Primer Reverse и ddH2O до 18 μл.
    Примечание: Основные фрагменты бактериальных генов fimbriae/адгезина, включая fedF (кодирующий адгезин F18 fimbriae), fliC (кодирующий флагеллин), ecpA (кодирующий основную субъединицу E. coli common pilus) и AIDA-I (кодирующий адгезин, участвующий в диффузной адгезии), амплифицируются в качестве генов-мишеней. В качестве референсного гена используется gapA (кодирующий глицеральдегид-3-фосфат).
  4. Перемешайте смесь и центрифугируйте при 500 x г в течение 1 минуты. С помощью пипетки-репитера осторожно перелейте 18 мкл смеси в каждую лунку 96-луночного планшета.
  5. Перенесите 2 мкл разбавленной кДНК (из шага 3.8) в тройные лунки для каждого набора праймеров.
  6. Используйте клейкую пленку для герметизации поверхности пластины, убедившись, что все лунки закрыты. Используйте валик для надежной герметизации.
  7. Центрифугируйте планшет при давлении 500 x g в течение 1 минуты. В качестве противовеса используется пустая тарелка.
  8. Включить систему ПЦР в реальном времени; следуйте инструкциям по настройке параметров реагента для количественной ПЦР. Убедитесь, что кривая расплава включена в программу.
  9. Поместите 96-луночную пластину в термоамплификатор и начните анализ.
  10. Сравните значения различных образцов и проанализируйте данные с помощью метода 2-ΔΔCT 24.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

FimA более важен, чем FimH, в адгезии F18ab fimbriae+ STEC и инвазии в клетки IPEC-J2. По сравнению со штаммом WT, удаление fimA снижало адгезию F18ab fimbriae+ STEC к клеткам IPEC-J2 примерно на 86% (p < 0,01), в то время как удаление fimH снижало адгезию STEC примерно на 71% (p < 0,01) (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Представленные здесь методы помогают эффективно определить функцию фимбрий в бактериальной колонизации. Интересно, что в этом исследовании делеция fimA показала на 15% меньшую адгезию, чем fimH mutant, что позволяет предположить, что адгезин на кончике может быть н?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Данное исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (No 31672579).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well microplateCorning3599adhesion and invasion assay
96-well microplate(Round bottom)Corning3799biofilm formation
crystal violetSinopharm Chemical Reagent71012314Biofilm staining
dextroseSangon BiotechA610219Culture broth
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
F12 mediumGibco11765062Cell culture
FeSO4Sangon BiotechA501386Culture broth
K2HPO4Sinopharm Chemical Reagent20032116Culture broth
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent10017608Culture broth
L-ArabinoseSangon BiotechA610071λ-Red recombination
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent20025117Culture broth
NaClSinopharm Chemical Reagent10019308Culture broth
(NH4)2SO4Sinopharm Chemical Reagent10002917Culture broth
Micro spectrophotometerThermo FisherNano Drop oneNucleic acid concentration detection
New-born calf serumGibco16010159Cell culture
PeptoneSangon BiotechA505247Culture broth
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA EraserTaKaRaRR047qPCR
Real-Time PCRApplied Biosystems7500 systemqPCR
RPMI1640 mediumGibco11875500Cell culture
SpectrophotometerEppendorfBioSpectrometerAbsorbance detection
Spectrophotometer (96-well microplate)BioTekEpochAbsorbance detection
SYBR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qPCR
Tabletop centrifugeThermo FisherMicro 17(R)Centrifugation
thiamine hydrochlorideSangon BiotechA500986Culture broth
Triton X-100Sangon BiotechA110694adhesion and invasion assay
TRIzolInvitrogen15596018RNA isolation
TryptoneOxoidLP0042Culture broth
Yeast extractOxoidLP0021Culture broth

Ссылки

  1. Ofek, I., Beachey, E. H. Mannose binding and epithelial cell adherence of Escherichia coli. Infection and Immunity. 22 (1), 247-254 (1978).
  2. Khan, N. A., Kim, Y., Shin, S., Kim, K. S. FimH-mediated Escherichia coli K1 invasion of human brain microvascular endothelial cells. Cellular Microbiology. 9 (1), 169-178 (2007).
  3. Ashkar, A. A., et al. FimH adhesin of type 1 fimbriae is a potent inducer of innate antimicrobial responses which requires TLR4 and type 1 interferon signalling. PLoS Pathogens. 4 (12), (2008).
  4. Pusz, P., Bok, E., Mazurek, J., Stosik, M., Baldy-Chudzik, K. Type 1 fimbriae in commensal Escherichia coli derived from healthy humans. Acta Biochimica Polonica. 61 (2), 389-392 (2014).
  5. Gunther, N. W., Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In Vivo Dynamics of Type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infection and Immunity. 69 (5), 2838-2846 (2001).
  6. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).
  7. Imberechts, H., et al. Characterization of F18 fimbrial genes fedE and fedF involved in adhesion and length of enterotoxemic Escherichia coli strain 107/86. Microbial Pathogenesis. 21 (3), 183-192 (1996).
  8. Nagy, B., et al. Biological relationship between F18ab and F18ac fimbriae of enterotoxigenic and verotoxigenic Escherichia coli from weaned pigs with oedema disease or diarrhoea. Microbial Pathogenesis. 22 (1), 1-11 (1997).
  9. Ravi, M., et al. Contribution of AIDA-I to the pathogenicity of a porcine diarrheagenic Escherichia coli and to intestinal colonization through biofilm formation in pigs. Veterinary Microbiology. 120 (3-4), 308-319 (2007).
  10. Duan, Q., et al. The flagella of F18ab Escherichia coli is a virulence factor that contributes to infection in a IPEC-J2 cell model in vitro. Veterinary Microbiology. 160 (1-2), 132-140 (2012).
  11. Rendón, M. A., et al. Commensal and pathogenic Escherichia coli use a common pilus adherence factor for epithelial cell colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (25), 10637-10642 (2007).
  12. Duan, Q., Nandre, R., Zhou, M., Zhu, G. Type I fimbriae mediate in vitro adherence of porcine F18ac+ enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Annals of Microbiology. 44 (1), (2017).
  13. Zeiner, S. A., Dwyer, B. E., Clegg, S. FimA, FimF, and FimH are necessary for assembly of type 1 fimbriae on Salmonella enterica Serovar Typhimurium. Infection and Immunity. 80 (9), 3289-3296 (2012).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Guo, Z. Study on FimA mediated F18ab+ Escherichi coli pathogenicity. Yangzhou University. , MA dissertation [in Chinese] (2014).
  16. Kudva, I. T., Dean-Nystrom, E. A. Bovine recto-anal junction squamous epithelial (RSE) cell adhesion assay for studying Escherichia coli O157 adherence. Journal of Applied Microbiology. 111, 1283-1294 (2011).
  17. Berschneider, H. Development of normal cultured small intestinal epithelial cell lines which transport Na and Cl. Gastroenterology. 96, 41(1989).
  18. Brosnahan, A. J., Brown, D. R. Porcine IPEC-J2 intestinal epithelial cells in microbiological investigations. Veterinary Microbiology. 156, 229-237 (2012).
  19. Koh, S. Y., et al. Porcine intestinal epithelial cell lines as a new in vitro model for studying adherence and pathogenesis of enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 130, 191-197 (2008).
  20. Dogan, B., et al. Phylogroup and lpfA influence epithelial invasion by mastitis associated Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 159, 163-170 (2012).
  21. Hossain, M. M., Tsuyumu, S. Flagella-mediated motility is required for biofilm formation by Erwinia carotovora subsp. carotovora. Journal of General Plant Pathology. 72 (1), 34-39 (2006).
  22. Wang, Y., Chen, H., Zhu, X. Observation on Pseudomonas aeruginosa biofilm with sliver staining method. Chinese Journal of Microecology. 12 (1), (2012).
  23. Ambalam, P., Kondepudi, K. K., Nilsson, I., Wadström, T., Ljungh, Å Bile stimulates cell surface hydrophobicity, congo red binding and biofilm formation of lactobacillus strains. FEMS Microbiology Letters. 333 (1), 10-19 (2012).
  24. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), (2008).
  25. Kisiela, D. I., et al. Evolutionary analysis points to divergent physiological roles of type 1 fimbriae in Salmonella and Escherichia coli. mBio. 4 (2), (2013).
  26. Forero, M., Yakovenko, O., Sokurenko, E. V., Thomas, W. E., Vogel, V. Uncoiling mechanics of Escherichia coli type I fimbriae are optimized for catch bonds. PLoS Biology. 4 (9), 298(2006).
  27. Di Martino, P., Cafferini, N., Joly, B., Darfeuille-Michaud, A. Klebsiella pneumoniae type 3 pili facilitate adherence and biofilm formation on abiotic surfaces. Research in Microbiology. 154 (1), 9-16 (2003).
  28. Fazli, M., et al. The exopolysaccharide gene cluster Bcam1330-Bcam1341 is involved in Burkholderia cenocepacia biofilm formation, and its expression is regulated by c-di-GMP and Bcam1349. MicrobiologyOpen. 2 (1), 105-122 (2013).
  29. Zamani, H., Salehzadeh, A. Biofilm formation in uropathogenic Escherichia coli: association with adhesion factor genes. Turkish Journal of Medical Sciences. 48 (1), 162-167 (2018).
  30. Duan, Q., et al. Contribution of flagellin subunit FliC to piglet epithelial cells invasion by F18ab E. coli. Veterinary Microbiology. 166 (1-2), 220-224 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

F18ab FimbriaeSTECFimbriae 1FimAFimHQPCRAIDA I

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены