使用 Fimbrial 杆进行 F18ab 菌毛 + STEC 定植到宿主细胞

摘要

在这里，我们提出了一种方案来研究菌毛在细菌定植中的功能。

摘要

1 型菌毛是一些革兰氏阴性病原体的重要毒力决定因素，可促进细菌定植。菌毛杆主要由主要菌毛亚基 FimA 的多个拷贝组成。然而，FimH 粘附素以纤维状尖端结构存在，可驱动细菌与含有甘露糖的宿主细胞受体结合。在这里，我们提供了评估和比较 F1ab 菌毛 ⁺ 产志贺毒素大肠杆菌 （STEC） 中 1 型菌毛亚基功能的方案。我们发现 FimA 和 FimH 都是细菌粘附、侵袭和生物膜形成所必需的。与 fimH 突变体相比，删除 fimA 基因显示细菌对猪肠柱状上皮细胞 IPEC-J2 的粘附和侵袭减少得多。在相同水平的两种突变体中，生物膜形成显着减少。此外，qPCR 表明 fimA 或 fimH 缺失下调细菌鞭毛和 F18 菌毛基因的表达，而上调的粘附素参与弥散粘附-I （AIDA-I） 基因表达，表明 F18ab 菌毛 ⁺ STEC 中细胞表面定位粘附素的共同调节。

引言

菌毛介导的粘附促进细菌附着到靶细胞表面并建立初始感染。1 型菌毛广泛分布在大肠杆菌（E. coli）中，通过与含甘露糖的受体结合促进细菌附着到哺乳动物细胞中 ^1,2,3。与致病菌株相比，85% 的受试人类共生大肠杆菌菌株不表达 1 型菌毛⁴，这表明它在疾病感染中起着关键作用。1 型菌毛也是肠外病原体的重要毒力因子，例如尿路致病性大肠杆菌 （UPEC） 和引起新生儿脑膜炎的大肠埃希菌 （NMEC）^2,5,6。

由 F18 菌毛⁺（包括两种变体：ab 和 ac）产志贺毒素大肠杆菌 （STEC） 菌株引起的感染与猪水肿病 （ED） 和断奶后腹泻 （PWD） 有关⁷。猪 F18 菌毛 ⁺ STEC 通过多种表面粘附素附着在肠上皮受体上，包括 F18 菌毛、鞭毛、大肠杆菌共同菌毛 （ECP） 和参与弥漫粘附的粘附素 （AIDA-I）^8,9,10,11。以前，我们已经研究了 F18ac 菌毛 ⁺ ETEC 中 1 型菌毛的功能，结果表明 1 型菌毛促进细菌生物膜形成和粘附于宿主细胞¹²。然而，由于 F18ab 和 F18ac 菌毛 ⁺ STEC 的发病机制并不完全相同⁷，因此 1 型菌毛在 F18ab 菌毛 ⁺ STEC 中的作用仍不清楚。菌毛杆主要由主要菌毛亚基 FimA 的多个拷贝组成，FimH 粘附素组装成纤维状尖端结构，驱动细菌与宿主细胞甘露糖结合受体¹³。使用 λ-Red 重组¹⁴，我们成功地从 F18ab fimbriae⁺ STEC 菌株 F107/86 （野生型，O139：H1，Stx2e⁺） 中敲除 fimA/fimH 基因，并为本研究构建了补体菌株¹⁵。

在这里，我们描述了一种研究细菌菌毛在定植中功能的方案。细菌粘附试验和侵袭试验是研究细菌菌毛结合性能的主要方法。执行动物攻击模型或分离原代细胞系以进行进一步的感染测定既复杂又昂贵¹⁶。通常，这些结果都不是稳定的，也没有良好的可重复性，因为被测动物之间存在个体差异。在本研究中，使用了 IPEC-J2 细胞。这些是从新生仔猪的空肠中期¹⁷ 中分离出的猪肠柱状上皮细胞。它是一种稳定的体外细胞模型，用于检查各种动物和人类病原体（包括 肠道沙门氏菌 和致病性大 肠杆菌）与肠上皮细胞的相互作用¹⁸，有助于方便快捷地解释菌毛在肠道感染中的作用。否则，IPEC-1 细胞是另一种广泛使用的猪肠上皮细胞系，在这种情况下，细胞受体的组成与 IPEC-J2¹⁹ 不同。对于乳腺病原菌的研究，最好使用乳腺上皮细胞系 MAC-T²⁰。因此，对于不同的细菌致病条件，选择模拟体内环境的合适细胞系很重要。

此外，生物膜是定植过程中细菌存活的另一个基本特征²¹。在以前的工作中，银和刚果红被用来对玻璃管中生物膜的形成进行染色，直观地显示了结果^22,23。然而，无法测量不同菌株之间生物膜形成能力的差异。在这里，我们还提出了一种在体外定量细菌生物膜形成的方案，该方案可以很容易地评估菌毛在生物膜形成中的能力。

本研究提出的方法利用一种快速简单的体外方法来确定细菌感染过程中菌毛的功能，可广泛适用于细菌致病机制中毒力因子研究的其他研究。

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研究方案

1. 细胞培养

1. 在 37 °C 下，将 IPEC-J2 细胞维持在 25 cm² 培养瓶中，该培养瓶含有 5 mL 不含抗生素的 F12-RPMI1640 （1：1） 混合培养基，补充有 10% 胎牛血清 （FBS），在 5% CO₂ 培养箱中。
2. 粘附测定前一天，使用 1 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液对 IPEC-J2 细胞进行胰蛋白酶消化 3 分钟。在细胞开始从培养瓶中脱落之前，轻轻去除胰蛋白酶-EDTA 溶液。加入 3 mL 生长培养基并悬浮细胞。
3. 使用 10 μL 细胞悬液，使用血细胞计数器对细胞进行计数。在 15 mL 锥形管中，使用细胞培养基将细胞悬液稀释至终浓度为 7 x 10⁵ 个细胞/mL。
4. 将 100 μL 细胞悬液（~7 x 10⁴ 个细胞）转移到 96 孔板的每个孔中。确保细胞在孔中均匀分布。将板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育，让细胞粘附并生长过夜，应达到约 90% 汇合度。

2. 细菌粘附和侵袭试验

1. 粘附测定前两天，将 大肠杆菌 F107/86、ΔfimA 突变体、ΔfimH 突变体、ΔfimA/pfimA 和 ΔfimH/pfimH 的冷冻原液划线到单独的 LB 琼脂平板上，以产生单个菌落。将板保持在设置为 37 °C 的培养箱中，让菌落生长过夜。
2. 感染前一天，使用无菌接种环从细菌培养板中挑选一个菌落，并在细菌玻璃培养管中用 4 mL Luria-Bertani （LB） 肉汤接种细菌。接种后盖上试管，并将其放入 37 °C 下以 180 rpm 的转速摇床中过夜。
3. 在感染当天，取出在培养箱中生长过夜的细菌培养物。将 30 μL 这种培养物（1：100 稀释）转移到含有新鲜制备培养基的试管中。将试管在 37 °C 下置于振荡培养箱中 4 小时（OD₆₀₀ ~ 2.0，细菌在对数中期生长）。
4. 4 小时后，准备 1 mL 无菌 LB 肉汤作为空白样品。将 100 μL 细菌传代培养物和 900 μL LB 混合到一个比色皿中作为细菌样品。为不同的细菌样品准备试管。
5. 使用分光光度计测量细菌培养物的光密度 （OD）。在 600 nm 波长 （OD₆₀₀） 处测量 OD。测量空白样品以获得背景吸光度。
6. 测量所有样品的 OD 值并记录 OD₆₀₀ 值。计算稀释因子的浓度（本例中为 10）。
7. 用新鲜的 F12-RPMI1640（不含 FBS）稀释培养物，以获得约 0.1 的 OD，大致相当于 1 x 10⁸ cfu/mL。这些细菌悬浮液稍后将用作接种物。
8. 从培养箱中取出含有过夜培养细胞的 96 孔板。此时，板中大约有 1 x 10^{个 5} 个细胞/孔。用用于每个孔感染的细菌菌株标记板的盖子，每次感染一式三份进行。
9. 从每个孔中取出培养基，然后用 PBS 轻轻洗涤每个孔 3 次，以去除非粘附细菌。将 100 μL 接种物添加到适当的孔中。将感染的细胞转移到维持在 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中。
   1. 对于细菌粘附测定，将感染的细胞在 5% CO₂ 培养箱中于 37 °C 孵育 1 小时，然后直接进入步骤 2.12。
   2. 对于细菌侵袭测定，将感染的细胞在 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中孵育 2 小时，然后继续进行步骤 2.10。
10. 孵育 2 小时后，取出 96 孔板，用移液管吸出培养基。用 PBS 轻轻洗涤每个孔 3 次，以去除非粘附细菌。
11. 向每个孔中加入 200 μL 含 100 μg/mL 庆大霉素的细胞培养基，在 5% CO₂ 培养箱中于 37 °C 孵育 1 小时以杀死细胞外细菌。
12. 孵育 1 小时后，取出 96 孔板并去除培养基。用 PBS 轻轻洗涤每个孔 3 次，以去除非粘附细菌。
13. 向每个孔中加入 200 μL 0.5% Triton X-100 以裂解细胞并在室温下孵育 20 分钟。
14. 将 200 μL 裂解细胞从每个孔转移到新的 1.5 mL 微量离心机无菌管中。用 300 μL PBS 洗涤每个孔，并将洗涤缓冲液添加到 1.5 mL 试管中。
15. 用管中的 PBS 对收集的裂解悬浮液进行 10 倍连续稀释。
16. 使用细胞铺展器将 100 μL 两种最低稀释液接种到 LB 琼脂板中，以获得单个菌落。将这些板在培养箱中于 37 °C 孵育过夜。
17. 第二天计算菌落形成单位，这些单位代表粘附/侵袭细菌的数量。数据是相对于 WT 菌株的数量呈现的，该菌株的数量被标准化为 100%。每个实验都需要独立重复，至少一式三份。

3. 生物膜形成定量测定

1. 在生物膜形成测定前两天，按照步骤 2.1 准备细菌菌株。将细菌培养板在 37 °C 下孵育过夜。
2. 测定前一天，向无菌细菌培养管中加入 4 mL 生物膜诱导培养基（有关培养基成分，请参见参考文献 ¹⁰）。使用无菌接种环从划线细菌培养物中挑选单个菌落，并将菌落转移到生物膜诱导培养基中。接种后盖上试管，并将其放入 30 °C 下以 120 rpm 的转速摇床中过夜。
3. 在测定当天，准备圆底的 96 孔板。根据将用于每个孔的孵育菌株标记板的盖子，每个菌株一式三份。
4. 将 10 μL 每种过夜细菌培养物（1/100 稀释液）转移到 1.5 mL 微量离心管中的 990 μL 新鲜生物膜诱导培养基中。这些细菌悬浮液稍后将用作接种物。
5. 将 200 μL 不同的接种物一式三份添加到板的适当孔中。将 96 孔板转移到 37 °C 的培养箱中 24 小时。
6. 孵育 24 小时后，取出 96 孔板并取出培养基。用双蒸水 （ddH₂O） 轻轻清洗每个孔 3 次，以去除未结合的细菌。
7. 向每个孔中加入 250 μL 2% 结晶紫溶液¹⁰ ，并在室温下孵育 15 分钟以对生物膜进行染色。
8. 从 2 孔板中取出 96% 结晶紫溶液。用 ddH₂O 轻轻洗涤每个孔 3 次，以去除多余的染料。然后，将板转移到 37 °C 的培养箱中 15 分钟以干燥孔。
9. 向每个孔中加入 300 μL 95% 乙醇;溶解细菌生物膜上染色的结晶紫。
10. 打开 96 孔分光光度计;将检测吸光度设置为 600 nm。将 96 孔板放在负载上并开始检测。
11. 比较各种样本的平均值。数据是相对于 WT 菌株的吸光度呈现的，该吸光度已归一化为 100%。每个实验需要独立重复至少三次。

4. RNA 分离和逆转录

1. 在 qPCR 测定前两天，将 大肠杆菌 F107/86、ΔfimA 突变体、ΔfimH 突变体、ΔfimA/pfimA 和 ΔfimH/pfimH 的冷冻储备液划线到 LB 琼脂平板上，分别产生单个菌落。将板转移到设置为 37 °C 的培养箱中，并允许过夜生长。
2. 测定前一天，将 4 mL 生物膜诱导培养基添加到无菌细菌培养管中。使用无菌接种环从划线细菌培养物中挑选单个菌落，并将环接触生物膜诱导培养基。接种后盖上试管，并将其放入 37 °C 下以 180 rpm 的转速摇床中过夜。
3. 在检测当天将 30 μL 过夜细菌培养物转移到玻璃管中的 3 mL 新鲜 LB 培养基中。将试管放入 37 °C 以 180 rpm 的振荡培养箱中。
4. 培养 4 小时后（OD₆₀₀ ~ 2.0，细菌在对数中期生长），在 2 mL 无菌无 RNase 微量离心管中离心（12,000 x g，2 分钟）收集 1 mL 细菌培养物。
5. 将 200 μL 溶菌酶溶液 （1 mg/mL） 加入 2 mL 试管中，并在 37 °C 下孵育 10 分钟。
6. 向试管中加入 800 μL 市售的盐酸胍试剂;然后，将试管转移到冰上。
7. 向每个样品管中加入 200 μL 氯仿。然后，小心地盖上试管并涡旋 15 秒。最后，将试管在室温下孵育 10 分钟。
8. 台式离心机的温度设置为 4 °C，并在使用前预冷。
9. 在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 10 分钟。
10. 准备并标记新的 1.5 mL 无 RNase 试管。将上层水相转移到新管中，注意不要干扰中间层或下层。
11. 向试管中加入等体积的异丙醇;涡旋水层和异丙醇的混合物，让样品在室温下静置 10 分钟。
12. 在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 10 分钟。
13. 观察试管底部，查看是否有白色颗粒 （RNA）。小心地将管中的上清液倒入废液容器中。
14. 加入 500 μL 75% 乙醇并涡旋，以洗涤 RNA 沉淀。
15. 再次离心，在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 5 分钟。
16. 小心吸出以尽可能多地去除上清液。
17. 在工作台上风干白色 RNA 沉淀，直到它变得透明。
18. 转移 30 μL 预冷无 RNase 的 ddH₂O 以溶解 RNA。将溶液传递几次以帮助溶解。始终将样品放在冰上。
19. 使用微量分光光度计检测每个样品的 RNA 浓度 1 μL。记录所有样品的浓度。
20. 要进行逆转录，请在不含 RNase 的离心管中制备以下混合物：4 μL 4x 预混液、1 μg 模板 RNA 和不含 RNase 的 ddH₂O，最多 16 μL。
21. 用移液管轻轻混合。盖紧样品盖上盖子，并在侧面标记 PCR 管。
22. 短暂离心 PCR 管（短时间旋转）以收集管底部的样品。
23. 将PCR管放入热循环仪中，并在以下设置下运行样品：42°C2分钟，然后保持在4°C。
24. 将 4 μL 5x 酶混合物添加到上一步的混合物中;用移液管轻轻混合。
25. 短暂离心 PCR 管以将样品收集到管底部。
26. 将PCR管放入热循环仪中，并在以下设置下运行样品：37°C15分钟，85°C5秒，然后保持在4°C。
27. 在试管中用 ddH₂O 以 1：5 的比例连续稀释产物，可直接用于 qPCR 反应，或储存在 -20 °C 以备进一步使用。

5. qPCR 分析

1. 规划用于样品分析的 96 孔 qPCR 板的设置。
2. 在冰上解冻引物（序列见 表 1）、预混液和 cDNA。
3. 为每个孔反应准备如下混合物：10 μL 2x SYBR qPCR 预混液、0.4 μL 引物正向和反向引物，以及 ddH₂O 至 18 μL。
   注：主要的细菌菌毛/粘附素基因片段，包括 fedF （编码 F18 菌毛的粘附素）、 fliC （编码鞭毛蛋白）、 ecpA （编码 大肠 杆菌的主要亚基）和 AIDA-I （编码参与弥散粘附的粘附素）作为靶基因扩增。 gapA （编码 3-磷酸甘油醛） 用作参考基因。
4. 涡旋混合物并以 500 x g 离心 1 分钟。使用重复移液器，小心地将 18 μL 混合物转移到 96 孔板的每个孔中。
5. 将 2 μL 稀释的 cDNA（来自步骤 3.8）转移到每个引物组的一式三份孔中。
6. 使用胶膜密封板表面，确保覆盖所有孔。使用滚筒密封牢固。
7. 将板以 500 x g 离心 1 分钟。空板用作平衡。
8. 打开 Real-time PCR System;按照 qPCR 试剂说明设置参数。确保 Melt Curve 包含在程序中。
9. 将 96 孔板放入热循环仪中并开始分析。
10. 比较各种样品的值并使用 ^2-ΔΔCT 方法分析数据²⁴.

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结果

在 F18ab fimbriae ⁺ STEC 粘附和侵袭 IPEC-J2 细胞中，FimA 比 FimH 更重要。与 WT 菌株相比，删除 fimA 使 F18ab fimbriae ⁺ STEC 对 IPEC-J2 细胞的粘附降低了约 86% （p < 0.01），而删除 fimH 使 STEC 粘附降低了约 71% （p < 0.01）（图 1A）。通过与 4% D-甘露糖共孵育来阻断 WT 菌株的粘附素 FimH，显示出与 ΔfimH 突变体相同的...

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讨论

此处提供的方法有助于有效地确定菌毛在细菌定植中的功能。有趣的是，在这项研究中，fimA 的缺失显示粘附比 fimH 突变体低 15%，这表明尖端粘附素可能不是 F18ab fimbriae ⁺ STEC 粘附所需的唯一因素，并且菌毛杆亚基 FimA 也起作用于细菌附着（图 1A）。最近的一项研究表明，FimA 调节菌毛干的机械性能可以在流动的体液引起的阻力...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well microplate	Corning	3599	adhesion and invasion assay
96-well microplate(Round bottom)	Corning	3799	biofilm formation
crystal violet	Sinopharm Chemical Reagent	71012314	Biofilm staining
dextrose	Sangon Biotech	A610219	Culture broth
Ex Taq	TaKaRa	RR01A	PCR
F12 medium	Gibco	11765062	Cell culture
FeSO4	Sangon Biotech	A501386	Culture broth
K2HPO4	Sinopharm Chemical Reagent	20032116	Culture broth
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent	10017608	Culture broth
L-Arabinose	Sangon Biotech	A610071	λ-Red recombination
MgSO4	Sinopharm Chemical Reagent	20025117	Culture broth
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	Culture broth
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	Culture broth
Micro spectrophotometer	Thermo Fisher	Nano Drop one	Nucleic acid concentration detection
New-born calf serum	Gibco	16010159	Cell culture
Peptone	Sangon Biotech	A505247	Culture broth
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser	TaKaRa	RR047	qPCR
Real-Time PCR	Applied Biosystems	7500 system	qPCR
RPMI1640 medium	Gibco	11875500	Cell culture
Spectrophotometer	Eppendorf	BioSpectrometer	Absorbance detection
Spectrophotometer (96-well microplate)	BioTek	Epoch	Absorbance detection
SYBR Premix Ex Taq II	TaKaRa	RR820	qPCR
Tabletop centrifuge	Thermo Fisher	Micro 17(R)	Centrifugation
thiamine hydrochloride	Sangon Biotech	A500986	Culture broth
Triton X-100	Sangon Biotech	A110694	adhesion and invasion assay
TRIzol	Invitrogen	15596018	RNA isolation
Tryptone	Oxoid	LP0042	Culture broth
Yeast extract	Oxoid	LP0021	Culture broth