宿主細胞へのF18ab Fimbriae+ STECコロニー形成のための線維ロッドの使用

要約

ここでは、細菌のコロニー形成における線毛の機能を研究するためのプロトコルを紹介します。

要約

1型線毛は、細菌のコロニー形成を促進する一部のグラム陰性病原体の重要な病原性決定因子です。フィンブリアルロッドは、主に主要なフィンブリアサブユニットFimAの複数のコピーで構成されています。しかし、FimHアドヘシンは、宿主の細胞マンノース含有受容体に細菌が結合するのを促進する線維線維先端構造として存在します。ここでは、F18ab fimbriae⁺ Shiga 毒素産生 大腸菌 (STEC) における 1 型線維サブユニットの機能を評価および比較するためのプロトコルを提供します。その結果、細菌の付着、侵入、バイオフィルム形成には、FimAとFimHの両方が必要であることがわかりました。 fimA 遺伝子の欠失は、 fimH 変異体よりもブタ腸管円柱上皮細胞IPEC-J2への細菌の接着と浸潤の減少がはるかに大きいことを示しました。バイオフィルム形成は、両方の変異体で同じレベルで有意に減少しました。さらに、qPCRは、 fimA または fimH の欠失が細菌のべん毛とF18線毛遺伝子の発現をダウンレギュレーションし、アップレギュレーションされたアドヘシンがびまん性アドヒアランスI(AIDA-I)遺伝子発現に関与していることを示し、F18ab線毛⁺ STECの細胞表面局在アドヘシンの共制御を示唆しています。

概要

細菌線毛を介した接着は、標的細胞表面への細菌の付着を促進し、初期感染を確立します。1型線毛は大腸菌(E. coli)に広く分布しており、マンノースを含む受容体^1,2,3に結合することにより、哺乳類細胞への細菌の付着を促進します。病原性株とは対照的に、ヒト由来の試験済みの共生大腸菌株の85%は1型線毛⁴を発現しておらず、これは疾患感染におけるその重要な役割を示しています。1型線毛は、尿路病原性大腸菌(UPEC)や新生児髄膜炎の原因性大腸菌(NMEC)^などの腸外病原体にとって重要な病原性因子でもあります^2,5,6。

F18 線毛⁺(abとacの2つの変異体を含む)志賀毒素産生大腸菌(STEC)株によって引き起こされる感染症は、ブタ浮腫症(ED)および離乳後下痢(PWD^{)に関連しています}7。ブタF18線毛⁺ STECは、F18線毛、べん毛、大腸菌の毛道(ECP)、びまん性付着に関与するアドヘシン(AIDA-I⁾8,9,10,11など、さまざまな表面アドヘシンによって腸上皮受容体に付着します。これまでに、F1ac線毛⁺ ETECにおける1型線毛の機能を調べ、1型線毛が細菌のバイオフィルム形成と宿主細胞への接着を促進することを実証した¹²。しかし、F18abとF18ac線毛⁺ STECの病因は^{全く同じでは}ないため7、F18ab線毛⁺ STECにおける1型線毛の役割は不明のままである。線細体ロッドは、主に主要な線細亜ユニットFimAの複数のコピーで構成されており、FimHアドヘシンは、宿主の細胞マンノースを含む受容体¹³に結合する細菌を駆動する線維線維先端構造に組み立てられています。我々は、λ-Red組換え¹⁴を用いて、F18ab fimbriae⁺ STEC株F107/86(野生型、O139:H1、Stx2e⁺)からfimA/fimH遺伝子をノックアウトすることに成功し、本研究のための補体株を構築した¹⁵。

ここでは、コロニー形成における細菌線毛の機能を研究するためのプロトコルについて説明します。バクテリア接着アッセイと侵入アッセイは、バクテリアの糸状結合性能を調査するための主要な方法です。動物チャレンジモデルを実施したり、さらなる感染アッセイのために初代細胞株を単離したりすることは、複雑で費用がかかる¹⁶。通常、これらの結果はどちらも、試験した動物間に個体差が存在するため、再現性が良好で安定していません。本研究では、IPEC-J2細胞を使用します。これらは、新生児の子豚の空腸中部から単離されたブタ腸円柱上皮細胞です¹⁷。これは、 サルモネラ・エンテリカ や病原性 大腸菌などのさまざまな動物およびヒトの病原体と腸上皮細胞との相互作用を調べるための安定したin vitro細胞モデル^であり18、腸感染症における線毛の役割を便利かつ迅速に説明するのに役立ちます。そうでなければ、IPEC-1細胞は、広く使用されている別のブタ腸上皮細胞株であり、その場合、細胞受容体の組成はIPEC-J2とは異なる¹⁹。乳腺病原菌の研究には、乳腺上皮細胞株MAC-T²⁰を使用するのが良いでしょう。したがって、さまざまな細菌性病原性条件に対して、in vivo環境を模倣する適切な細胞株の選択が重要です。

さらに、バイオフィルムは、コロニー形成中の細菌の生存に重要な別の特徴です²¹。これまでの研究では、ガラス管内のバイオフィルム形成を染色するために銀とコンゴレッドが使用されており、その結果を視覚的に示していました^22,23。しかし、異なる菌株間のバイオフィルム形成能力の違いは測定できません。ここでは、バイオフィルム形成における線毛の能力を容易に評価できる、in vitroでの細菌バイオフィルム形成の定量化のためのプロトコルも提示します。

この研究で提案された方法は、細菌感染プロセス中の細菌線毛の機能を決定するための迅速かつ簡単なin vitroの方法を利用しており、これは細菌病原性メカニズムにおける病原性因子の研究における他の研究に広く適応することができます。

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プロトコル

1. 細胞培養

1. 5 mLの抗生物質フリーF12-RPMI1640(1:1)混合培地に10%ウシ胎児血清(FBS)を添加した5 mLの25 cm² フラスコにIPEC-J2細胞を5%_CO2 インキュベーターで37°Cで保持します。
2. 接着アッセイの1日前に、1 mLの0.05%トリプシン-EDTA溶液を使用して、IPEC-J2細胞を3分間トリプシン化します。細胞がフラスコから脱落し始める前に、トリプシン-EDTA溶液を静かに除去します。3 mLの増殖培地を添加し、細胞を懸濁します。
3. 10 μLの細胞懸濁液を使用して、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞培養培地を使用して細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブ内で最終濃度7 x 10⁵ 細胞/mLに希釈します。
4. 100 μL の細胞懸濁液 (~7 x 10⁴ 細胞) を 96 ウェルプレートの各ウェルに移します。細胞がウェル内に均一に分布していることを確認してください。プレートを37°Cで5%_CO2 とインキュベートし、細胞が接着して一晩中増殖するのを待ちます(これは約90%のコンフルエント度になるはずです)。

2. 細菌の付着および侵入の試金石

1. 接着アッセイの2日前に、 大腸菌 F107/86、ΔfimA 変異体、ΔfimH 変異体、ΔfimA/pfimA、 およびΔfimH/pfimH の凍結ストックを別々のLB寒天プレートにストリークして、単一のコロニーを作製します。プレートをインキュベーターに入れ、37°Cに設定して、コロニーを一晩成長させます。
2. 感染の1日前に、滅菌接種ループを使用して細菌培養プレートから1つのコロニーを選択し、細菌ガラス培養チューブに4mLのLuria–Bertani(LB)ブロスを細菌に接種します。接種後、チューブにキャップをし、37°Cで180rpmのシェーカーに一晩入れます。
3. 感染した日は、インキュベーターで一晩中増殖した細菌培養物を取り出します。この培養物30μL(1:100希釈)を、新たに調製した培地の入ったチューブに移します。チューブを37°Cの振とうインキュベーターに4時間置きます(OD₆₀₀ ~2.0、中対数期に細菌を増殖させます)。
4. 4時間後、ブランクサンプルとして1 mLの滅菌LBブロスを調製します。100 μLの細菌継代培養と900 μLのLBを1つのキュベットに混合し、細菌サンプルとして調製します。さまざまな細菌サンプル用にチューブを準備します。
5. 分光光度計を使用して、細菌培養物の光学密度(OD)を測定します。600nmの波長でODを測定します(_OD600)。ブランクサンプルを測定して、バックグラウンド吸光度を取得します。
6. すべてのサンプルのOD値を測定し、_OD600 値を記録します。希釈係数(この例では10)を考慮した濃度を計算します。
7. 培養物を新鮮なF12-RPMI1640(FBSなし)で希釈すると、ODは約0.1(これはおおよそ1 x 10⁸ cfu/mLに相当)になります。これらの細菌懸濁液は、後で接種材料として使用されます。
8. インキュベーターから一晩培養した細胞が入った96ウェルプレートを取り出します。この時点で、プレート内には約1 x 10⁵ 細胞/ウェルがあります。プレートの蓋に、各ウェルの感染に使用する細菌株をラベル付けし、各感染を3回に分けて行います。
9. 各ウェルから培地を取り出し、PBSで各ウェルを3回優しく洗浄して、付着していない細菌を取り除きます。100 μLの接種材料を適切なウェルに加えます。感染した細胞を37°Cに維持し、5%CO₂でインキュベーターに移します。
   1. 細菌接着アッセイでは、感染した細胞を5% CO₂ インキュベーターで37°Cで1時間インキュベートし、直接ステップ2.12に進みます。
   2. 細菌侵入アッセイでは、感染した細胞を5% CO₂ インキュベーターで37°Cで2時間インキュベートし、ステップ2.10に進みます。
10. 2時間のインキュベーション後、96ウェルプレートを取り出し、ピペットで培地を吸引します。各ウェルをPBSで3回優しく洗い、付着していないバクテリアを取り除きます。
11. 各ウェルに100 μg/mLのゲンタマイシンを含む200 μLの細胞培地を加え、5% CO₂ インキュベーターで37°Cで1時間インキュベートして細胞外細菌を死滅させます。
12. インキュベーションの1時間後、96ウェルプレートを取り出し、培地を取り出します。各ウェルをPBSで3回優しく洗い、付着していないバクテリアを取り除きます。
13. 各ウェルに200 μLの0.5% Triton X-100を加えて細胞を溶解し、室温で20分間インキュベートします。
14. 各ウェルから200 μLの溶解細胞を新しい1.5 mL微量遠心分離滅菌チューブに移します。各ウェルを300 μL PBSで洗浄し、1.5 mLチューブに洗浄バッファーも加えます。
15. 回収した溶解懸濁液をチューブ内のPBSで10倍段階希釈します。
16. 最も希釈度の低い2つの2つの液をLB寒天プレートに100μLプレートし、セルスプレッダーを使用して単一コロニーを取得します。これらのプレートをインキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。
17. 翌日、付着性/侵襲性細菌の数を表すコロニー形成単位をカウントします。データは、100%に正規化されたWT株の数を基準にして表示されます。各実験は、少なくとも三回ずつ独立して繰り返す必要があります。

3. バイオフィルム形成定量アッセイ

1. バイオフィルム形成アッセイの2日前に、ステップ2.1のように細菌株を調製します。細菌培養プレートを37°Cで一晩インキュベートしました。
2. アッセイの1日前に、4 mLのバイオフィルム誘導培地(培地組成については参考文献¹⁰を参照)を滅菌細菌培養チューブに加えます。滅菌接種ループを使用して、縞模様の細菌培養物から単一のコロニーを選択し、コロニーをバイオフィルム誘導培地に移します。接種後、チューブにキャップをし、30°Cで120rpmのシェーカーに一晩入れます。
3. アッセイ当日は、底が丸い96ウェルプレートを調製します。プレートの蓋には、各ウェルに使用されるインキュベート株に応じてラベルを付け、各株を3回に分けて行います。
4. 各10 μLの一晩の細菌培養物(100希釈分の1)を、1.5 mLの微量遠心チューブ内の990 μLの新鮮なバイオフィルム誘導培地に移します。これらの細菌懸濁液は、後で接種材料として使用されます。
5. 200 μLの異なる接種材料をプレートの適切なウェルに三重に添加します。96ウェルプレートをインキュベーターに37°Cで24時間移します。
6. 24時間のインキュベーション後、96ウェルプレートを取り出し、培養培地を取り出します。各ウェルを二重蒸留水(ddH₂O)で3回穏やかに洗浄し、結合していない細菌を取り除きます。
7. 250 μLの2%クリスタルバイオレット溶液¹⁰ を各ウェルに加え、室温で15分間インキュベートしてバイオフィルムを染色します。
8. 2%クリスタルバイオレット溶液を96ウェルプレートから取り出します。各ウェルをddH₂Oで3回優しく洗浄し、余分な色素を取り除きます。次に、プレートを37°Cのインキュベーターに15分間移し、ウェルを乾燥させます。
9. 各ウェルに300 μLの95%エタノールを加えます。細菌のバイオフィルムに染色されたクリスタルバイオレットを可溶化します。
10. 96ウェル分光光度計をオンにします。[検出吸光度] を 600 nm に設定します。96ウェルプレートをロードに置き、検出を開始します。
11. さまざまなサンプルの平均値を比較します。データは、100%に正規化されたWT株の吸光度を基準にして示されています。各実験は、独立して少なくとも3回繰り返す必要があります。

4. RNA単離と逆転写

1. qPCRアッセイの2日前に、 大腸菌 F107/86、ΔfimA 変異体、ΔfimH 変異体、ΔfimA/pfimA、 およびΔfimH/pfimH の凍結ストックをLB寒天プレートにストリークして、それぞれ単一コロニーを作製します。プレートを37°Cに設定されたインキュベーターに移し、一晩成長させます。
2. アッセイの1日前に、4 mLのバイオフィルム誘導培地を滅菌細菌培養チューブに加えます。滅菌接種ループを使用して縞模様の細菌培養物から単一のコロニーを選択し、ループをバイオフィルム誘導培地に接触させます。接種後、チューブにキャップをし、37°Cで180rpmのシェーカーに一晩入れます。
3. アッセイ当日に、30 μLの一晩の細菌培養物をガラス管内の3 mLの新鮮なLB培地に移します。チューブを37°C、180rpmの振とうインキュベーターに入れます。
4. 4時間培養(OD₆₀₀ ~2.0、中log期に増殖した細菌)後、1 mLの細菌培養物を遠心分離(12,000 x g、2分間)により、2 mLの滅菌RNaseフリー微量遠心チューブに回収しました。
5. 2 mLチューブに200 μLのリゾチーム溶液(1 mg/mL)を加え、37°Cで10分間インキュベートします。
6. 800 μLの市販の塩酸グアニジウム試薬をチューブに加えます。次に、チューブを氷に移します。
7. 各サンプルチューブに200 μLのクロロホルムを加えます。次に、チューブとボルテックスを慎重にキャップし、15秒間キャップします。最後に、チューブを室温で10分間インキュベートします。
8. 卓上遠心分離機は4°Cの温度に設定され、使用前に予冷されます。
9. 12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離を行います。
10. 新しい1.5 mL RNaseフリーチューブを調製し、ラベル付けします。上部水相を新しいチューブに移し、中間層または下層を乱さないように注意してください。
11. 等量のイソプロパノールをチューブに加えます。水層とイソプロパノールの混合物をボルテックスし、サンプルを室温で10分間放置します。
12. 12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離を行います。
13. チューブの底を観察して、白いペレット(RNA)があるかどうかを確認します。チューブから上清を慎重に廃棄物容器に注ぎます。
14. 500 μLの75%エタノールとボルテックスを加えて、RNAペレットを洗浄します。
15. 再度、12,000 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離を行います。
16. 上澄みをできるだけ取り除くように慎重に吸引します。
17. ホワイトRNAペレットをベンチトップで透明になるまで風乾します。
18. 30 μLのプレコールドRNaseフリーddH₂Oを移し、RNAを溶解します。溶液を数回通過させて溶解させます。サンプルは常に氷の上に置いておきます。
19. マイクロ分光光度計を使用して、サンプルの1 μLで各サンプルのRNA濃度を検出します。すべてのサンプルの濃度を記録します。
20. 逆転写を行うには、RNaseフリーの遠心分離チューブで次の混合物を調製します:4x Master Mix4 μL、1 μgテンプレートRNA、およびRNaseフリーddH₂Oを最大16 μL。
21. ピペットでやさしく混ぜます。サンプルにしっかりとキャップをし、側面のPCRチューブにラベルを付けます。
22. PCRチューブを短時間(短回転)遠心分離して、チューブの底にサンプルを採取します。
23. PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、42°Cで2分間、その後4°Cで保持するという設定でサンプルを分析します。
24. 4 μLの5x Enzyme Mixを前のステップの混合物に加えます。ピペットでやさしく混ぜます。
25. PCRチューブを短時間遠心分離して、サンプルをチューブの底まで収集します。
26. PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、37°Cで15分間、85°Cで5秒間、その後4°Cで保持するという設定でサンプルを分析します。
27. 製品をチューブ内のddH₂Oで1:5に連続希釈し、qPCR反応に直接使用したり、-20°Cで保存してさらに使用したりできます。

5. qPCR解析

1. サンプル分析用の96ウェルqPCRプレートのセットアップを計画します。
2. プライマー(配列については 表1を参照)、マスターミックス、およびcDNAを氷上で解凍します。
3. 各ウェル反応について、10 μLの2x SYBR qPCR Master Mix、0.4 μLのPrimer ForwardおよびPrimer Reverse、およびddH₂Oを最大18 μLで調製します。
   注: fedF (F18線毛のアドヘシンをコードする)、 fliC (フラジェリンをコードする)、 ecpA ( 大腸菌 の一般的な毛道の主要なサブユニットをコードする)、 AIDA-I (びまん性付着に関与するアドヘシンをコードする)を含む主要な細菌の線毛/アドヘシン遺伝子断片は、標的遺伝子として増幅されます。参照遺伝子として は、gapA (グリセルアルデヒド3-リン酸をコードする)が用いられます。
4. 混合物をボルテックスし、500 x g で1分間遠心分離します。リピーターピペットを使用して、18 μLの混合物を96ウェルプレートの各ウェルに慎重に移します。
5. 希釈したcDNA 2 μL(ステップ3.8)を、各プライマーセットのトリプリケートウェルに移します。
6. 粘着フィルムを使用してプレート表面をシールし、すべてのウェルが覆われていることを確認します。ローラーを使用してしっかりと密封します。
7. プレートを500 x g で1分間遠心分離します。空のプレートはカウンターバランスとして使用されます。
8. リアルタイムPCRシステムの電源を入れます。qPCR試薬の指示に従って、パラメータを設定します。メルトカーブがプログラムに含まれていることを確認します。
9. 96ウェルプレートをサーモサイクラーにセットし、分析を開始します。
10. さまざまなサンプルの値を比較し、^2-ΔΔCT 法²⁴でデータを分析します。

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結果

F18ab fimbriae⁺ STECのIPEC-J2細胞への接着と浸潤において、FimAはFimHよりも重要です。WT株と比較して、 fimA を欠失すると、F18ab fimbriae⁺ STECのIPEC-J2細胞への接着が約86（p <0.01)減少し、 fimH を欠失するとSTECの接着が約71（p <0.01）減少しました（図1A)。WT株のアドヘシンFimHを4%D-マンノースと共インキュベートし?...

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ディスカッション

ここで提供される方法は、細菌のコロニー形成における線毛の機能を効率的に決定するのに役立ちます。興味深いことに、この研究では、fimAの欠失はfimH変異体よりも接着が15%少ないことが示され、F18ab fimbriae⁺ STEC接着に必要な因子は先端アドヘシンだけではない可能性があること、および線維桿体サブユニットであるFimAが細菌の付着にも作用?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well microplate	Corning	3599	adhesion and invasion assay
96-well microplate(Round bottom)	Corning	3799	biofilm formation
crystal violet	Sinopharm Chemical Reagent	71012314	Biofilm staining
dextrose	Sangon Biotech	A610219	Culture broth
Ex Taq	TaKaRa	RR01A	PCR
F12 medium	Gibco	11765062	Cell culture
FeSO4	Sangon Biotech	A501386	Culture broth
K2HPO4	Sinopharm Chemical Reagent	20032116	Culture broth
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent	10017608	Culture broth
L-Arabinose	Sangon Biotech	A610071	λ-Red recombination
MgSO4	Sinopharm Chemical Reagent	20025117	Culture broth
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	Culture broth
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	Culture broth
Micro spectrophotometer	Thermo Fisher	Nano Drop one	Nucleic acid concentration detection
New-born calf serum	Gibco	16010159	Cell culture
Peptone	Sangon Biotech	A505247	Culture broth
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser	TaKaRa	RR047	qPCR
Real-Time PCR	Applied Biosystems	7500 system	qPCR
RPMI1640 medium	Gibco	11875500	Cell culture
Spectrophotometer	Eppendorf	BioSpectrometer	Absorbance detection
Spectrophotometer (96-well microplate)	BioTek	Epoch	Absorbance detection
SYBR Premix Ex Taq II	TaKaRa	RR820	qPCR
Tabletop centrifuge	Thermo Fisher	Micro 17(R)	Centrifugation
thiamine hydrochloride	Sangon Biotech	A500986	Culture broth
Triton X-100	Sangon Biotech	A110694	adhesion and invasion assay
TRIzol	Invitrogen	15596018	RNA isolation
Tryptone	Oxoid	LP0042	Culture broth
Yeast extract	Oxoid	LP0021	Culture broth