JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקר התפקוד של פימבריה בהתיישבות חיידקים.

Abstract

פימבריה מסוג 1 הם גורמים חשובים לאלימות של כמה פתוגנים גראם-שליליים, המקדמים קולוניזציה של חיידקים. מוט הפימבריאל מורכב בעיקר מעותקים מרובים של תת-היחידה הפימבריאלית העיקרית FimA. עם זאת, הידבקות FimH קיימת כמבנה קצה סיבי המניע חיידקים הנקשרים לקולטן המכיל מנוז תאי מארח. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים להערכה והשוואה של התפקוד של תת-יחידות פימבריאליות מסוג 1 ב-Escherichia coli (STEC) המייצרת רעלן F18ab fimbriae+ Shiga. מצאנו שגם FimA וגם FimH נדרשים להידבקות חיידקים, פלישה והיווצרות ביופילם. מחיקת הגן fimA הראתה הרבה יותר הפחתה בהידבקות חיידקים ופלישה לתאי אפיתל עמודי מעיים חזיריים IPEC-J2, מאשר זו של מוטציה fimH. היווצרות הביופילם הופחתה באופן משמעותי בשני המוטאנטים עם רמה שווה. בנוסף, qPCR הוכיח כי מחיקת fimA או fimH הפחתה את ביטוי הגנים החיידקיים ו-F18 fimbriae, בעוד ש-adhesin מווסת היה מעורב בביטוי הגן של דבקות מפוזרת-I (AIDA-I), מה שמרמז על ויסות משותף של הידבקויות מקומיות על פני התא ב-F18ab fimbriae+ STEC.

Introduction

הידבקות בתיווך חיידקי פימבריה מקלה על התקשרות חיידקית למשטח תא המטרה ומבססת זיהום ראשוני. פימבריה מסוג 1 מופצת באופן נרחב בקרב Escherichia coli (E. coli) ומקדמת התקשרות חיידקית לתאי יונקים על ידי קשירה לקולטן המכיל מנוז 1,2,3. בניגוד לזנים פתוגניים, 85% מזני E. coli קומנסליים שנבדקו ממקור אנושי אינם מבטאים פימבריה מסוג 14, מה שמעיד על תפקידו הקריטי בזיהום המחלה. פימבריה מסוג 1 הם גם גורמי אלימות חשובים לפתוגנים חוץ-מעיים, כגון E. coli אורופתוגני (UPEC) ו-E. coli הגורם לדלקת קרום המוח בילודים (NMEC)2,5,6.

זיהומים הנגרמים על ידי F18 fimbriae+ (כולל שתי גרסאות: ab ו-ac) זני E. coli המייצרים רעלן שיגה (STEC) קשורים למחלת בצקת חזירים (ED) ושלשול לאחר גמילה (PWD)7. חזיר F18 fimbriae+ STEC נצמד לקולטני אפיתל המעי על ידי מגוון הידבקויות פני השטח, כולל F18 fimbriae, flagella, E. coli common pilus (ECP) והדבקות המעורבת בהיצמדות מפוזרת (AIDA-I)8,9,10,11. בעבר, חקרנו את התפקוד של פימבריה מסוג 1 ב-F18ac fimbriae+ ETEC, מה שהראה כי פימבריה מסוג 1 מקלה על היווצרות ביופילם חיידקי והיצמדות לתאים מארחים12. עם זאת, מכיוון שהפתוגנזה של F18ab ו-F18ac fimbriae+ STEC אינה זהה לחלוטין7, תפקידם של פימבריה מסוג 1 ב-F18ab fimbriae+ STEC נותר לא ברור. מוט הפימבריאלי מורכב בעיקר מעותקים מרובים של תת-היחידה הפימבריאלית העיקרית FimA, והידבקות FimH מורכבת למבנה קצה סיבי המניע חיידקים הנקשרים למנוז תאי מארח המכיל קולטן13. באמצעות רקומבינציה λ-Red14, הצלחנו להוציא בהצלחה את הגן fimA/fimH מזן F18ab fimbriae+ STEC F107/86 (סוג פראי, O139:H1, Stx2e+), ובנינו זנים משלימים למחקר זה15.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לחקר התפקוד של פימבריה חיידקית בקולוניזציה. בדיקת הידבקות חיידקים ובדיקת פלישה הן שיטות עיקריות לחקירת ביצועי קשירת החיידקים. זה מסובך ויקר לבצע מודל אתגר של בעלי חיים או לבודד את קו התאים הראשוני לבדיקות זיהום נוספות16. בדרך כלל, אף אחת מהתוצאות הללו אינה יציבה עם יכולת חזרה טובה מכיוון שההבדלים האישיים קיימים בין החיה שנבדקה. במחקר זה משתמשים בתאי IPEC-J2. אלה הם תאי אפיתל עמודי מעיים חזיריים שבודדו מאמצע הג'ג'ונום17 של חזרזיר יילוד. זהו מודל תאי מבחנה יציב לבחינת האינטראקציות של פתוגנים שונים של בעלי חיים ובני אדם, כולל סלמונלה אנטריקה , ו-E. coli פתוגני, עם תאי אפיתל במעי18, המסייע להסביר את תפקיד הפימבריה בזיהום מעיים בצורה נוחה ומהירה. אחרת, תאי IPEC-1 הם עוד קו תאי אפיתל במעי חזיר בשימוש נרחב, ובמקרה זה הרכב הקולטנים התאיים שונה מ- IPEC-J219. לחקר חיידקים פתוגניים בשלב, עדיף להשתמש בקו תאי אפיתל חלביים MAC-T20. לפיכך, עבור מצבים פתוגניים שונים של חיידקים, חשוב לבחור קו תאים מתאים המחקה סביבות in vivo.

בנוסף, הביופילם הוא מאפיין חיוני נוסף להישרדות חיידקים במהלך קולוניזציה21. בעבודות הקודמות נעשה שימוש בכסף ואדום קונגו כדי להכתים את היווצרות הביופילם בצינורות הזכוכית שהראו חזותית את התוצאות22,23. עם זאת, לא ניתן למדוד את ההבדל ביכולת היווצרות הביופילם בין זנים שונים. כאן, אנו מציגים גם פרוטוקול לכימות היווצרות ביופילם חיידקי במבחנה, שיכול להעריך בקלות את היכולת של פימבריה בהיווצרות ביופילם.

השיטות המוצעות במחקר זה משתמשות בדרך מהירה ופשוטה במבחנה כדי לקבוע את תפקודם של פימבריה חיידקית במהלך תהליך הזיהום החיידקי, אשר ניתן להתאים באופן נרחב למחקרים אחרים בחקר גורם האלימות במנגנון הפתוגני של החיידקים.

Protocol

1. תרבית תאים

  1. שמור על תאי IPEC-J2 בבקבוק בגודל 25 ס"מ2 המכיל 5 מ"ל של חומר מעורב F12-RPMI1640 (1:1) ללא אנטיביוטיקה בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ב-37 מעלות צלזיוס, באינקובטור 5% CO2 .
  2. יום אחד לפני בדיקת ההדבקה, השתמש ב-1 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA של 0.05% כדי לנסוע בתאי IPEC-J2 למשך 3 דקות. הסר בעדינות את תמיסת הטריפסין-EDTA לפני שהתאים מתחילים לנשור מהבקבוק. הוסף 3 מ"ל של מצע גידול והשהה את התאים.
  3. השתמש ב-10 מיקרוליטר של תרחיף התאים כדי לספור את התאים באמצעות המוציטומטר. לדלל את תרחיף התאים באמצעות מדיום תרבית תאים לריכוז סופי של 7 x 105 תאים/מ"ל בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
  4. העבירו 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים (~7 x 104 תאים) לכל באר של צלחת 96 בארות. וודאו שהתאים מתפזרים באופן אחיד בבארות. דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ואפשרו לתאים להיצמד ולצמוח בן לילה, שאמור להיות בכ-90% מפגש.

2. בדיקת הידבקות ופלישה של חיידקים

  1. יומיים לפני בדיקת ההדבקה, פס מלאי קפוא של E. coli F107/86, ΔfimA מוטנט, ΔfimH מוטנט, ΔfimA/pfimA ו-ΔfimH/pfimH על לוחות אגר LB נפרדים כדי לייצר מושבות בודדות. שמור את הצלחות בחממה מכוונת ל -37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר למושבות לצמוח בן לילה.
  2. יום אחד לפני ההדבקה, בחרו מושבה בודדת מצלחת תרבית החיידקים באמצעות לולאת חיסון סטרילית, וחיסנו חיידקים עם 4 מ"ל של מרק לוריא-ברטאני (LB) בצינור תרבית זכוכית חיידקית. מכסים את הצינורות לאחר החיסון ומכניסים אותם לשייקר עם 180 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס, למשך הלילה.
  3. ביום ההדבקה, הוציאו תרביות חיידקים שגדלו במהלך הלילה באינקובטור. העבירו 30 מיקרוליטר מתרבית זו (דילול 1:100) לצינור המכיל מדיה טרייה. מניחים את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה רועדת למשך 4 שעות (OD600 ~ 2.0, חיידקים הגדלים בשלב אמצע העץ).
  4. לאחר 4 שעות, הכינו 1 מ"ל מרק LB סטרילי כדגימה ריקה. מערבבים 100 מיקרוליטר של תת-תרבית חיידקים ו-900 מיקרוליטר LB לקובטה אחת כדגימת חיידקים. הכן את הצינורות לדגימות חיידקים שונות.
  5. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) של תרביות החיידקים באמצעות ספקטרופוטומטר. מדוד OD באורך גל של 600 ננומטר (OD600). מדוד את הדגימה הריקה כדי לקבל את ספיגת הרקע.
  6. מדוד ערכי OD עבור כל הדגימות ורשום את ערכי OD600 . חשב את הריכוז המהווה את גורם הדילול (10 בדוגמה זו).
  7. מדללים את התרבית עם F12-RPMI1640 טרי (ללא FBS) כדי לקבל OD של כ-0.1, המתאים בערך ל-1 x 108 cfu/mL. תרחיפי חיידקים אלה ישמשו מאוחר יותר כחיסון.
  8. הוציאו את צלחת 96 הבארות המכילה את התאים המתורבתים הלילה מהחממה. בשלב זה, יש בערך 1 x 105 תאים / באר בצלחת. סמן את מכסה הצלחת עם זן החיידקים שישמש לזיהום של כל באר, כאשר כל זיהום מבוצע בשלוש עותקים.
  9. הסר את המדיה מכל באר ושטוף בעדינות כל באר עם PBS שלוש פעמים כדי להסיר את החיידקים שאינם נדבקים. הוסף 100 מיקרוליטר מהחיסון לבארות המתאימות. להעביר את התאים הנגועים באינקובטור הנשמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
    1. לבדיקת הידבקות חיידקים, דגרו תאים נגועים בחממת CO2 של 5% ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת ועברו ישירות לשלב 2.12.
    2. לבדיקת פלישת חיידקים, דגרו תאים נגועים בחממה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים והתקדמו לשלב 2.10.
  10. לאחר שעתיים של דגירה, הוציאו את צלחת 96 הבאר ושאבו את אמצעי התרבות בעזרת פיפטה. שטפו בעדינות כל באר עם PBS שלוש פעמים כדי להסיר את החיידקים שאינם נדבקים.
  11. הוסף 200 מיקרוליטר של מדיה תאית עם 100 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין לכל באר, דגירה בחממה של 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי להרוג חיידקים חוץ-תאיים.
  12. לאחר שעה אחת של דגירה, הוציאו את צלחת 96 הבאר והסירו את אמצעי התרבית. שטפו בעדינות כל באר עם PBS שלוש פעמים כדי להסיר את החיידקים שאינם נדבקים.
  13. הוסף 200 מיקרוליטר של 0.5% טריטון X-100 לכל באר כדי לבזבז את התאים ולדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  14. העבר 200 מיקרוליטר של תא ליזה מכל באר לצינור סטרילי חדש של 1.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה. שטפו כל באר עם 300 מיקרוליטר PBS והוסיפו את מאגר הכביסה גם לצינור ה-1.5 מ"ל.
  15. בצע דילול סדרתי פי 10 של המתלה הליטי שנאסף עם PBS בצינורות.
  16. צלחת 100 מיקרוליטר משני הדילולים הנמוכים ביותר לצלחת אגר LB באמצעות מפזר תאים להשגת מושבות בודדות. דגרו את הצלחות הללו למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה.
  17. למחרת ספרו את היחידות היוצרות מושבות, המייצגות את מספר החיידקים הדבקים/פולשים. הנתונים מוצגים ביחס למספר זן ה-WT, שנורמל ל-100%. יש לחזור על כל ניסוי באופן עצמאי לפחות שלוש פעמים.

3. בדיקת כימות היווצרות ביופילם

  1. יומיים לפני בדיקת היווצרות ביופילם, הכינו את זני החיידקים כמו בשלב 2.1. צלחות תרבות חיידקים הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
  2. יום אחד לפני הבדיקה, הוסף 4 מ"ל של חומר מעורר ביופילם (להרכב המדיה ראה הפניה 10) לצינורות תרבית חיידקים סטריליים. בחרו מושבה בודדת מתרביות חיידקים מפוספסות באמצעות לולאת חיסון סטרילית והעבירו את המושבה למדיה המעוררת ביופילם. מכסים את הצינורות לאחר החיסון ומכניסים אותם לשייקר עם 120 סל"ד ב-30 מעלות צלזיוס, למשך הלילה.
  3. ביום הבדיקה, הכינו את צלחת 96 הבאר עם תחתית עגולה. סמנו את מכסה הצלחת בהתאם לזן הדגירה שישמש לכל באר, כאשר כל זן נעשה בשלוש עותקים.
  4. העבירו 10 מיקרוליטר מכל תרבית חיידקים לילה (דילול של 1 ל-100) ל-990 מיקרוליטר מדיה טרייה המעוררת ביופילם בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. תרחיפי חיידקים אלה ישמשו מאוחר יותר כחיסון.
  5. הוסף 200 מיקרוליטר של חיסון שונה לבארות מתאימות של הצלחת בשלוש עותקים. העבירו את צלחת 96 הבארות לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  6. לאחר 24 שעות של דגירה, הוציאו את צלחת 96 הבאר והסירו את המדיה התרבותית. שטפו בעדינות כל באר במים מזוקקים כפולים (ddH2O) שלוש פעמים כדי להסיר את החיידקים הלא משולבים.
  7. הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת סגול קריסטל2% 10 לכל באר ודגר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי להכתים את הביופילם.
  8. הסר את תמיסת הסגול הקריסטל 2% מצלחת 96 הבארות. שטפו בעדינות כל באר עם ddH2O שלוש פעמים כדי להסיר את הצבע המיותר. לאחר מכן, העבירו את הצלחת לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לייבוש הבארות.
  9. הוסף 300 מיקרוליטר של 95% אתנול לכל באר; ממיסים את הקריסטל סגול המוכתם על הביופילם החיידקי.
  10. הפעל את הספקטרופוטומטר 96 באר; הגדר את ספיגת הזיהוי כ-600 ננומטר. הנח את צלחת 96 הבאר על העומס והתחל בזיהוי.
  11. השווה את הערך הממוצע של דגימות שונות. הנתונים מוצגים ביחס לספיגה של זן ה-WT, שנורמל ל-100%. יש לחזור על כל ניסוי, בנפרד, לפחות שלוש פעמים.

4. בידוד RNA ושעתוק הפוך

  1. יומיים לפני בדיקת ה-qPCR, פס מלאי קפוא של E. coli F107/86, מוטנט ΔfimA, מוטנט ΔfimH, Δ fimA/pfimA ו-ΔfimH/pfimH על לוחות אגר LB כדי לייצר מושבות בודדות, בהתאמה. מעבירים את הצלחות לאינקובטור המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס ומאפשרים צמיחה למשך הלילה.
  2. יום אחד לפני הבדיקה, הוסף 4 מ"ל של חומר מעורר ביופילם לצינורות תרבית חיידקים סטריליים. בחר מושבה בודדת מתרביות חיידקים מפוספסות באמצעות לולאת חיסון סטרילית וגע בלולאה במדיה המעוררת ביופילם. מכסים את הצינורות לאחר החיסון ומכניסים אותם לשייקר עם 180 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס, למשך הלילה.
  3. העבירו 30 מיקרוליטר מתרבית החיידקים הלילה ל-3 מ"ל מדיה טרייה של LB בצינורות הזכוכית ביום הבדיקה. הכניסו את הצינורות לאינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 180 סל"ד.
  4. לאחר תרבית של 4 שעות (OD600 ~ 2.0, חיידקים שגדלו בשלב אמצע העץ), 1 מ"ל של תרבית חיידקים נאספה על ידי צנטריפוגה (12,000 x גרם, 2 דקות) בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי ללא RNase בנפח 2 מ"ל.
  5. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת ליזוזים (1 מ"ג/מ"ל) לתוך צינור 2 מ"ל ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  6. הוסף 800 מיקרוליטר של מגיב גואנידיום הידרוכלוריד זמין מסחרית לשפופרת; לאחר מכן, העבירו את הצינור לקרח.
  7. הוסף 200 מיקרוליטר כלורופורם לכל צינור דגימה. לאחר מכן, מכסה בזהירות את הצינור והמערבולת למשך 15 שניות. לבסוף, דגרו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  8. הצנטריפוגה השולחנית מוגדרת לטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס וקרה מראש לפני השימוש.
  9. בצע את הצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  10. הכן ותייג את הצינורות החדשים ללא RNase בנפח 1.5 מ"ל. העבירו את השלב המימי העליון לצינור החדש, והקפידו לא להפריע לשכבות האמצעיות או התחתונות.
  11. הוסף נפח שווה של איזופרופנול לצינור; מערבולת את התערובת של שכבה מימית ואיזופרופנול ואפשר לדגימות לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  12. בצע את הצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  13. צפה בתחתית הצינור כדי לגלות אם יש כדור לבן (RNA). שפכו בזהירות את הסופרנטנט מהצינור למיכל פסולת.
  14. הוסף 500 מיקרוליטר של 75% אתנול ומערבולת, כדי לשטוף את כדור ה- RNA.
  15. בצע את הצנטריפוגה שוב, ב-12,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  16. שאפו בזהירות להסיר את הסופרנטנט ככל האפשר.
  17. יבש באוויר את כדורי ה-RNA הלבנים במשטח הספסל עד שהוא מתבהר.
  18. העבירו 30 מיקרוליטר של ddH2O נטול RNase קר מראש כדי להמיס את ה-RNA. העבירו את התמיסה כמה פעמים כדי לעזור להתמוסס. שמור את הדגימות על קרח לאורך כל הדרך.
  19. זהה את ריכוז ה-RNA של כל דגימה באמצעות מיקרו-ספקטרופוטומטר עם 1 מיקרוליטר מהדגימה. רשום את הריכוז של כל הדגימות.
  20. כדי לבצע שעתוק הפוך, הכינו את התערובת הבאה בצינור צנטריפוגה נטול RNase: 4 מיקרוליטר של תערובת מאסטר 4x, 1 מיקרוגרם תבנית RNA ו-ddH2O ללא RNase עד 16 מיקרוליטר.
  21. מערבבים בעדינות עם פיפטה. מכסים היטב את הדגימות וסמנו את צינורות ה-PCR בצד.
  22. צנטריפוגה של צינורות ה-PCR לזמן קצר (סיבוב קצר) כדי לאסוף את הדגימות בתחתית הצינור.
  23. הנח את צינורות ה-PCR בתרמו-סייקלר והפעל את הדגימות בהגדרות הבאות: 42 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחר מכן החזק ב-4 מעלות צלזיוס.
  24. הוסף 4 מיקרוליטר של תערובת אנזימים פי 5 לתערובת של השלב הקודם; מערבבים בעדינות עם פיפטה.
  25. צנטריפוגה קצרה של צינורות ה-PCR כדי לאסוף דגימות לתחתית הצינור.
  26. הנח את צינורות ה-PCR בתרמו-סייקלר והפעל את הדגימות בהגדרות הבאות: 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, 85 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, ולאחר מכן החזק ב-4 מעלות צלזיוס.
  27. יש לדלל את המוצר באופן סדרתי 1:5 עם ddH2O בצינורות, שניתן להשתמש בהם ישירות בתגובות qPCR, או לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף.

5. ניתוח qPCR

  1. תכנן את ההתקנה של צלחת qPCR 96 באר לניתוח דגימה.
  2. להפשיר פריימרים (לרצף ראה טבלה 1), תערובות מאסטר ו-cDNA על קרח.
  3. הכן את התערובת באופן הבא עבור כל תגובת באר: 10 מיקרוליטר של 2x SYBR qPCR Master Mix, 0.4 מיקרוליטר של פריימר קדימה ופריימר הפוך, ו-ddH2O עד 18 מיקרוליטר.
    הערה: מקטעי גן פימבריה/אדהזין חיידקיים עיקריים, כולל fedF (מקודד את ההידבקות של F18 fimbriae), fliC (מקודד את הפלאגלין), ecpA (מקודד את תת-היחידה העיקרית של E. coli common pilus) ו-AIDA-I (מקודד את הדבקות המעורבת בהיצמדות מפוזרת) מוגברים כגני מטרה. gapA (המקודד את הגליצרלדהיד 3-פוספט) משמש כגן הייחוס.
  4. מערבולת את התערובת והצנטריפוגה ב -500 x גרם למשך דקה. בעזרת פיפטה משחזרת, העבירו בזהירות 18 מיקרוליטר מהתערובת לכל באר של צלחת 96 הבארות.
  5. העבר 2 מיקרוליטר של cDNA מדולל (משלב 3.8) לבארות משולשות עבור כל סט פריימר.
  6. השתמש בסרט דבק כדי לאטום את משטח הצלחת, וודא שכל הבארות מכוסות. השתמשו ברולר כדי לאטום היטב.
  7. צנטריפוגה את הצלחת ב 500 x גרם למשך דקה. צלחת ריקה משמשת כאיזון נגד.
  8. הפעל את מערכת ה-PCR בזמן אמת; עקוב אחר הוראות המגיב qPCR כדי להגדיר את הפרמטרים. ודא שעקומת ההיתוך כלולה בתוכנית.
  9. הנח את צלחת 96 הבאר בתרמוסייקלר והתחל את הניתוח.
  10. השווה את ערך הדגימות השונות ונתח את הנתונים בשיטת 2-ΔΔCT 24.

תוצאות

FimA חשוב יותר מ-FimH בהידבקות F18ab fimbriae+ STEC ופלישה לתאי IPEC-J2. בהשוואה לזן WT, מחיקת fimA הפחיתה את הידבקות F18ab fimbriae+ STEC לתאי IPEC-J2 בכ-86% (p < 0.01), בעוד שמחיקת fimH הפחיתה את הידבקות STEC בכ-71% (p < 0.01) (איור 1A). חסימת ההידבקות FimH של זן WT על ידי דגירה ?...

Discussion

השיטות הניתנות כאן עוזרות לקבוע ביעילות את תפקוד הפימבריה בהתיישבות חיידקים. מעניין לציין שבמחקר זה, מחיקת fimA הראתה 15% פחות הידבקות מאשר מוטציה fimH, מה שמרמז על כך שייתכן שהידבקות קצה אינה הגורם היחיד הנדרש להדבקה F18ab fimbriae+ STEC וכי תת-יחידת מוט פימבריאלית, FimA...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 31672579).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well microplateCorning3599adhesion and invasion assay
96-well microplate(Round bottom)Corning3799biofilm formation
crystal violetSinopharm Chemical Reagent71012314Biofilm staining
dextroseSangon BiotechA610219Culture broth
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
F12 mediumGibco11765062Cell culture
FeSO4Sangon BiotechA501386Culture broth
K2HPO4Sinopharm Chemical Reagent20032116Culture broth
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent10017608Culture broth
L-ArabinoseSangon BiotechA610071λ-Red recombination
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent20025117Culture broth
NaClSinopharm Chemical Reagent10019308Culture broth
(NH4)2SO4Sinopharm Chemical Reagent10002917Culture broth
Micro spectrophotometerThermo FisherNano Drop oneNucleic acid concentration detection
New-born calf serumGibco16010159Cell culture
PeptoneSangon BiotechA505247Culture broth
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA EraserTaKaRaRR047qPCR
Real-Time PCRApplied Biosystems7500 systemqPCR
RPMI1640 mediumGibco11875500Cell culture
SpectrophotometerEppendorfBioSpectrometerAbsorbance detection
Spectrophotometer (96-well microplate)BioTekEpochAbsorbance detection
SYBR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qPCR
Tabletop centrifugeThermo FisherMicro 17(R)Centrifugation
thiamine hydrochlorideSangon BiotechA500986Culture broth
Triton X-100Sangon BiotechA110694adhesion and invasion assay
TRIzolInvitrogen15596018RNA isolation
TryptoneOxoidLP0042Culture broth
Yeast extractOxoidLP0021Culture broth

References

  1. Ofek, I., Beachey, E. H. Mannose binding and epithelial cell adherence of Escherichia coli. Infection and Immunity. 22 (1), 247-254 (1978).
  2. Khan, N. A., Kim, Y., Shin, S., Kim, K. S. FimH-mediated Escherichia coli K1 invasion of human brain microvascular endothelial cells. Cellular Microbiology. 9 (1), 169-178 (2007).
  3. Ashkar, A. A., et al. FimH adhesin of type 1 fimbriae is a potent inducer of innate antimicrobial responses which requires TLR4 and type 1 interferon signalling. PLoS Pathogens. 4 (12), (2008).
  4. Pusz, P., Bok, E., Mazurek, J., Stosik, M., Baldy-Chudzik, K. Type 1 fimbriae in commensal Escherichia coli derived from healthy humans. Acta Biochimica Polonica. 61 (2), 389-392 (2014).
  5. Gunther, N. W., Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In Vivo Dynamics of Type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infection and Immunity. 69 (5), 2838-2846 (2001).
  6. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).
  7. Imberechts, H., et al. Characterization of F18 fimbrial genes fedE and fedF involved in adhesion and length of enterotoxemic Escherichia coli strain 107/86. Microbial Pathogenesis. 21 (3), 183-192 (1996).
  8. Nagy, B., et al. Biological relationship between F18ab and F18ac fimbriae of enterotoxigenic and verotoxigenic Escherichia coli from weaned pigs with oedema disease or diarrhoea. Microbial Pathogenesis. 22 (1), 1-11 (1997).
  9. Ravi, M., et al. Contribution of AIDA-I to the pathogenicity of a porcine diarrheagenic Escherichia coli and to intestinal colonization through biofilm formation in pigs. Veterinary Microbiology. 120 (3-4), 308-319 (2007).
  10. Duan, Q., et al. The flagella of F18ab Escherichia coli is a virulence factor that contributes to infection in a IPEC-J2 cell model in vitro. Veterinary Microbiology. 160 (1-2), 132-140 (2012).
  11. Rendón, M. A., et al. Commensal and pathogenic Escherichia coli use a common pilus adherence factor for epithelial cell colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (25), 10637-10642 (2007).
  12. Duan, Q., Nandre, R., Zhou, M., Zhu, G. Type I fimbriae mediate in vitro adherence of porcine F18ac+ enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Annals of Microbiology. 44 (1), (2017).
  13. Zeiner, S. A., Dwyer, B. E., Clegg, S. FimA, FimF, and FimH are necessary for assembly of type 1 fimbriae on Salmonella enterica Serovar Typhimurium. Infection and Immunity. 80 (9), 3289-3296 (2012).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Guo, Z. Study on FimA mediated F18ab+ Escherichi coli pathogenicity. Yangzhou University. , (2014).
  16. Kudva, I. T., Dean-Nystrom, E. A. Bovine recto-anal junction squamous epithelial (RSE) cell adhesion assay for studying Escherichia coli O157 adherence. Journal of Applied Microbiology. 111, 1283-1294 (2011).
  17. Berschneider, H. Development of normal cultured small intestinal epithelial cell lines which transport Na and Cl. Gastroenterology. 96, 41 (1989).
  18. Brosnahan, A. J., Brown, D. R. Porcine IPEC-J2 intestinal epithelial cells in microbiological investigations. Veterinary Microbiology. 156, 229-237 (2012).
  19. Koh, S. Y., et al. Porcine intestinal epithelial cell lines as a new in vitro model for studying adherence and pathogenesis of enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 130, 191-197 (2008).
  20. Dogan, B., et al. Phylogroup and lpfA influence epithelial invasion by mastitis associated Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 159, 163-170 (2012).
  21. Hossain, M. M., Tsuyumu, S. Flagella-mediated motility is required for biofilm formation by Erwinia carotovora subsp. carotovora. Journal of General Plant Pathology. 72 (1), 34-39 (2006).
  22. Wang, Y., Chen, H., Zhu, X. Observation on Pseudomonas aeruginosa biofilm with sliver staining method. Chinese Journal of Microecology. 12 (1), (2012).
  23. Ambalam, P., Kondepudi, K. K., Nilsson, I., Wadström, T., Ljungh, &. #. 1. 9. 7. ;. Bile stimulates cell surface hydrophobicity, congo red binding and biofilm formation of lactobacillus strains. FEMS Microbiology Letters. 333 (1), 10-19 (2012).
  24. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), (2008).
  25. Kisiela, D. I., et al. Evolutionary analysis points to divergent physiological roles of type 1 fimbriae in Salmonella and Escherichia coli. mBio. 4 (2), (2013).
  26. Forero, M., Yakovenko, O., Sokurenko, E. V., Thomas, W. E., Vogel, V. Uncoiling mechanics of Escherichia coli type I fimbriae are optimized for catch bonds. PLoS Biology. 4 (9), 298 (2006).
  27. Di Martino, P., Cafferini, N., Joly, B., Darfeuille-Michaud, A. Klebsiella pneumoniae type 3 pili facilitate adherence and biofilm formation on abiotic surfaces. Research in Microbiology. 154 (1), 9-16 (2003).
  28. Fazli, M., et al. The exopolysaccharide gene cluster Bcam1330-Bcam1341 is involved in Burkholderia cenocepacia biofilm formation, and its expression is regulated by c-di-GMP and Bcam1349. MicrobiologyOpen. 2 (1), 105-122 (2013).
  29. Zamani, H., Salehzadeh, A. Biofilm formation in uropathogenic Escherichia coli: association with adhesion factor genes. Turkish Journal of Medical Sciences. 48 (1), 162-167 (2018).
  30. Duan, Q., et al. Contribution of flagellin subunit FliC to piglet epithelial cells invasion by F18ab E. coli. Veterinary Microbiology. 166 (1-2), 220-224 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

F18ab FimbriaeSTEC1FimAFimHQPCRAIDA I

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved