Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

Resumen

Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.

Resumen

El firebrat Thermobia domestica es una especie ametabolosa y sin alas que es adecuada para estudiar los mecanismos de desarrollo de los insectos que condujeron a su exitosa radiación evolutiva en la Tierra. La aplicación de herramientas genéticas como la edición del genoma es la clave para entender los cambios genéticos que son responsables de las transiciones evolutivas en un enfoque Evo-Devo. En este artículo, describimos nuestro protocolo actual para generar y mantener cepas mutantes de T. domestica. Informamos de un método de inyección en seco, como alternativa al método de inyección húmeda notificado, que nos permite obtener tasas de supervivencia establemente altas en embriones inyectados. También informamos de un entorno optimizado para acoplar adultos y obtener generaciones posteriores con alta eficiencia. Nuestro método subraya la importancia de tener en cuenta la biología única de cada especie para la aplicación exitosa de métodos de edición del genoma a organismos modelo no tradicionales. Predicemos que estos protocolos de edición del genoma ayudarán a implementar T. domestica como modelo de laboratorio y a acelerar aún más el desarrollo y la aplicación de herramientas genéticas útiles en esta especie.

Introducción

Thermobia domestica pertenece a una de las órdenes de insectos más basales, Zygentoma, que conserva un ciclo de vida ancestral ametaboloso y sin alas. Tal posición filogenética basal y características ancestrales establecen a esta especie como un modelo atractivo para estudiar los mecanismos subyacentes al éxito de los insectos en la Tierra, que cubren más del 70% de las especies animales descritas^1. T. domestica se ha utilizado durante mucho tiempo principalmente para estudiar las características ancestrales de la fisiología de insectos debido a sus características adecuadas como modelo de laboratorio, como un ciclo de vida relativamente corto (2,5–3,0 meses de embrión a adulto reproductor; Figura 1A) y una cría fácil. En las últimas tres décadas, su uso se ha ampliado para investigar características ancestrales de diversos rasgos como el plan corporal, la diferenciación neuronal y los ritmos circadianos^2,3,4.

La aplicación de herramientas genéticas avanzadas en T. domestica podría acelerar aún más esas contribuciones en un amplio área de investigación. Se ha notificado una interferencia exitosa del ARN (ARN) en embriones, ninfas y adultos en T. domestica^4,5,6. La eficiencia del RNAi sistémico sigue siendo altamente dependiente de las especies, por ejemplo, generalmente es alta en coleoptera, mientras que es baja en el orden^{lepidópteros 7.} La eficiencia y duración del derribo de la RNAi en T. domestica aún no ha sido evaluada. Además de RNAi, hemos informado previamente de un exitoso knockout genético mediado por CRISPR/Cas9 en T. domestica⁸. El sistema CRISPR/Cas se ha aplicado ampliamente para la edición del genoma en insectos, particularmente para el knockout genético específico. Su uso podría ampliarse para otras aplicaciones como el ensayo de reporteros genéticos, el seguimiento del linaje celular y la manipulación de la actividad transcripcional mediante el derribo de construcciones exógenas después del establecimiento de un protocolo para la entrega de componentes del sistema CRISPR/Cas en núcleos^9. Combinado con el ensamblaje del genoma publicado^10,el uso amplio y el desarrollo posterior de la edición del genoma basado en CRISPR/Cas en T. domestica facilitarían estudios centrados en los mecanismos evolutivos detrás del excepcional éxito adaptativo de los insectos. Aquí, describimos un protocolo detallado para la microinyección embrionaria y para aparear T. domestica adulto para generar una cepa mutante usando CRISPR/Cas9. Teniendo en cuenta este novedoso método, discutimos la importancia de considerar la biología única de las especies modelo no tradicionales para aplicaciones exitosas de estas técnicas.

Protocolo

1. Mantenimiento de colonias de laboratorio

1. Para el mantenimiento de poblaciones de wildtype y mutantes, utilice un recipiente de plástico grande (460 mm x 360 mm x 170 mm) con alimentos artificiales regulares para peces, agua en vasos de plástico con un orificio de ventilación en la parte superior, un papel doblado para ocultar los insectos y algodón en capas para poner huevos(Figura 2A). Mantenga todos los cultivos de T. domestica dentro de incubadoras de 37 °C y establezca la humedad relativa (RH) dentro de cada recipiente en 60%-80%.
   NOTA: Debido a que T. domestica absorbe vapor de agua de la atmósfera^11,no se necesita un suministro directo de agua. El RH adecuado se mantiene debido a la presencia de vapor de agua de vasos de plástico que contienen un orificio de ventilación en la parte superior o de tazas sin tapa dentro de cada recipiente. No hay necesidad de humidificar dentro de toda una incubadora que contiene cultivos. La duración aproximada de cada etapa de desarrollo bajo la condición descrita en este protocolo se muestra en la Figura 1. La velocidad de desarrollo podría ajustarse cambiando la temperatura y/o rh¹².
2. Agregue los alimentos periódicamente. Agregue agua antes de que se seque.
3. Transfiera las poblaciones a un nuevo recipiente limpio al menos cada 3 meses, dado que los adultos dejan de poner huevos en un ambiente sucio y/o población densa (ver Discusión).

2. Recolección de huevos y microinjección

1. Diseñar un ARN guía (gRNA)
   1. Diseñe una secuencia de gRNA para cada objetivo necesario y BLAST las secuencias de gRNA en el ensamblaje del genoma para comprobar posibles sitios de reconocimiento fuera de destino.
   2. Sintetizar y purificar los gRNAs de acuerdo con las instrucciones del fabricante⁸.
      NOTA: Como ejemplo, en el caso de dirigirse al gen blanco transportador de casete de unión a ATP, se diseñó una secuencia objetivo de 20 bp y se ordenaron dos oligonucleótidos de ADN sintetizados 5'-TAATACACTCACTATAGTAAGTGTTGGTGGGAC-3' y 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCCCCCAACACTTA-3'. La plantilla de ADN se preparó recocido estos dos oligonucleótidos seguidos de amplificación de PCR y el gRNA se transcribe in vitro de la plantilla con una polimerasa de ARN T7.
2. Preparan colonias de recolección de huevo
   1. Transfiera alrededor de 20 adultos machos y 20 hembras a un recipiente de tamaño mediano (200 mm x 150 mm x 90 mm) con alimentos, suministro de agua, un papel doblado y un pequeño trozo de algodón en capas para la puesta de huevos(Figura 2B).
   2. Establecer varias colonias para obtener un gran número de embriones escenificados en un corto período de tiempo para ser utilizados para la edición del genoma.
      NOTA: Se espera que se recojan entre 20 y 40 huevos de una colonia después de 8 h a 37 °C. Por lo general, los adultos transferidos tardan unos días en empezar a poner huevos, posiblemente debido a la adaptación a un nuevo entorno.
3. El día de la inyección, reemplace el algodón dentro de los recipientes por otros nuevos.
4. Coloque una cinta de doble cara de 76 mm x 5 mm en una tobogán de vidrio normal de 76 mm x 26 mm.
5. Ocho horas más tarde, recoge los huevos del algodón en capas separando las capas usando fórceps.
6. Alinee los huevos en la cinta de doble cara con un pincel húmedo y mantenga una distancia de 2 mm entre los huevos. Todos los huevos deben estar orientados para que el eje longitudinal de un huevo se enfrente al lado de la inyección(Figura 3A). Presione suavemente los huevos con un pincel para sujetar firmemente durante la inyección.
   NOTA: En este protocolo, el hongo crece rápidamente en huevos inyectados dañados en condiciones húmedas y cálidas. Es importante mantener la distancia entre los huevos para evitar la contaminación cruzada y la expansión del hongo.
7. Mezcle la proteína gRNA y Cas9 a una concentración final de 100 ng/μL y 500 ng/μL, respectivamente. Utilice agua destilada para diluirla. Incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente para promover la formación compleja ribonucleoprotein y luego mantener la mezcla en hielo.
   NOTA: Rojo neutro a una concentración final del 1% podría añadirse a la solución de inyección para controlar la cantidad inyectada.
8. Cargue 2 μL de la solución gRNA/Cas9 en un capilar de inyección de vidrio con un microcargador. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la solución antes de la inyección. Si es necesario, toque la aguja para extraer las burbujas.
   NOTA: En este experimento, se utiliza una aguja prefabricada para obtener una punta de aguja fina (Figura 3B). En su lugar, se podría utilizar una aguja casera con una forma similar.
9. Fijar el capilar de inyección de vidrio, previamente cargado con la solución gRNA/Cas9, a un soporte equipado con un manipulador y conectar el soporte a un microinyector electrónico.
10. Optimice la forma de la punta de la aguja rompiéndolo ligeramente con fórceps para evitar obstrucciones y obteniendo una mejor durabilidad a lo largo de una serie de inyecciones (se muestra un ejemplo de una aguja adecuada en la Figura 3C).
    NOTA: Se recomienda cambiar una aguja cuando está obstruida. Es posible seguir inyectando con la misma aguja si se rompe de nuevo con fórceps, pero una punta más ancha conduce a más daño del huevo y reduce su tasa de supervivencia. Como los huevos T. domestica son blandos y frágiles, mantener una punta fina de aguja es clave para tener una alta tasa de supervivencia después de la inyección.
11. Inserte la aguja en el punto medio del eje longitudinal de un huevo e inyecte una ligera cantidad de la solución (consulte la Figura 3D-H como referencia sobre la cantidad de inyección). Ajuste la configuración del microinyector electrónico durante la inyección, dependiendo de la forma de la punta de la aguja.
    NOTA: Se recomienda aplicar una presión constante durante la inyección, de lo contrario el contenido pegajoso del huevo puede fluir fácilmente en la aguja de vidrio y puede obstruirla. La solución puede ser inyectar un pulso de presión corto o con una presión constante, dependiendo de la cantidad de líquido inyectado. Tenga en cuenta que cuando una punta de aguja tiene una abertura amplia, se inyecta demasiada solución en un óvulo, lo que causa letalidad(Figura 3F-H). En ese caso, mantenga un flujo de líquido constante por presión constante, luego inserte la aguja en un huevo y extraiga inmediatamente. Si causa demasiado desbordamiento o el huevo estalla, cambie la aguja.
12. Mantenga los huevos inyectados en un recipiente con el tamaño adecuado para el número de huevos inyectados (<20 huevos: plato pequeño; >20 huevos: recipiente de tamaño mediano) con 60%-80% RH y 37 °C.

3. Apareamiento

1. Revise los huevos inyectados periódicamente y deseche los huevos dañados con fórceps para evitar el crecimiento fúngico(Figura 3I,J). En caso de que haya demasiado hongo creciendo en un huevo, limpie la superficie del huevo con un 70% de EtOH.
2. Antes de eclosionar (aproximadamente 10 días a 37 °C después de la puesta de huevos), sumerja el vaso con los huevos inyectados en polvo de talco para cubrir la superficie de la cinta de doble cara. Esto evitará el apilamiento de ninfas eclosionadas. Transfiera los toboganes de vidrio recubiertos de polvo a un recipiente de tamaño mediano con alimentos, agua y un papel doblado para ocultar los insectos.
3. Retire las diapositivas de vidrio después de que las ninfas hayan eclosionado. Suministran alimentos periódicamente hasta que lleguen a la edad adulta.
   NOTA: Se tarda aproximadamente 2.0–2.5 meses para que las personas lleguen a la edad adulta después de eclosionar(Figura 1A). La etapa adulta se juzga sobre la base de un ovipositor bien desarrollado en las hembras(Figura 1B).
4. Para aparear a los individuos, transfiera tantos como sea necesario a adultos hembras de wildtype de una colonia de laboratorio al contenedor mediano e incubarlos durante al menos 14 días a 37 °C para asegurarse de que son vírgenes.
   NOTA: No es necesario recoger hembras vírgenes de una colonia de laboratorio porque las T. domestica adultas tienen un ciclo repetido de fundido y apareamiento llamado "ciclo reproductivo y ardiente", durante el cual las hembras tiran espermatozoides con cada muda y se aparean de nuevo en el siguiente ciclo de fertilización^13.
5. Transfiera un adulto G0 macho o hembra que se desarrolló de un huevo inyectado y un(los) adulto(s) de wildtype a un pequeño plato de plástico (Ø 100 mm x 40 mm) con alimentos, un papel doblado y un pequeño trozo de algodón para poner huevos G1(Figura 2C';plato de apareamiento). Mantenga los platos de apareamiento en un recipiente más grande con 60%-80% RH(Figura 2C).
   NOTA: Múltiples adultos de wildtype pueden ser incluidos en un plato para aumentar la probabilidad de apareamiento exitoso, aunque se han logrado altas tasas de éxito con emparejamiento uno a uno.

4. Genotipado

1. Diseñe pares de imprimación PCR para cada gRNA para amplificar un producto de 100-200 bp que incluye el sitio dirigido por el gRNA. BLAST cada primera secuencia contra el ensamblaje del genoma para comprobar su especificidad (se muestra un ejemplo para la focalización del gen blanco en la Figura 4A).
2. Compruebe la transformación germinina de los adultos G0.
   1. Cinco días después de que se ponen los huevos, recoger huevos G1 individuales de cada par adulto G0 en tubos de 0,2 ml (un huevo por tubo; almacenar muestras recogidas a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo). Separe las capas de algodón para recoger los huevos.
      NOTA: Se recomienda genotipo de al menos 12 ninfas G1 de cada par de acoplamiento para evaluar el éxito de la transmisión de la línea germinográfica (ver Resultados representativos).
   2. Añadir 15 μL de una solución Proteinasa K de 0,25 mg/ml (disuelta en tampón Tris-EDTA) a cada tubo, homogeneizar brevemente muestras con palillos de dientes e incubar a 55 °C durante 3 a 16 h.
   3. Inactive la Proteinasa K colocando las muestras a 95 °C durante 10 min.
   4. Añadir 90 μL de agua destilada a cada tubo y mezclar bien. Utilice 2 μL de sobrenadante en una mezcla de reacción PCR de 10 μL que contenga las imprimaciones diseñadas en el paso 4.1.
      NOTA: Se recomienda el uso de una polimerasa de ADN optimizada para plantillas crudas para alcanzar suficiente amplificación de PCR.
   5. Para analizar los productos PCR, realice un ensayo de movilidad heteroduplex (HMA) con un sistema de electroforesis de microchip(Figura 3B;ver Ohde et al., 2018)⁸.
      NOTA: Las mutaciones podrían evaluarse con dos métodos alternativos: (1) HMA con polímeros de gel estándar, como 8% poliacrilamida^14; (2) digestión de productos DEP con endonuclease T7 seguido de electroforesis de gel de agarose¹⁵.
   6. Mantenga sólo las ninfas G1 resultantes de los adultos G0 que contienen mutaciones en su línea germino y deseche las otras.
3. Genotipado individual de ninfas/adultos G1
   1. Aísle las ninfas G1 en placas de 24 pozos con un aspirador o un pincel. Coloque las placas de 24 pozos en un recipiente más grande (por ejemplo, el recipiente mediano utilizado en este protocolo) con suministro de agua como se describió anteriormente para mantener un RH del 60%-80%(Figura 1D). Mantener el suministro de alimentos artificiales regulares para el pescado(Figura 1D').
      NOTA: Aunque este paso se puede realizar en cualquier punto de las etapas de ninfas y adultos, se recomienda realizarlo después de llegar a la edad adulta y justo antes del emparejamiento (>2.5 meses después de la inyección; Figura 1B) porque es más fácil mantener los ignífugos en un recipiente grande. Se requiere una cría individual para rastrear el genotipo de cada ninfa G1 en los siguientes pasos. Las ninfas G1 del mismo adulto G0 pueden tener mutaciones diferentes.
   2. Pellizque y tire de cerci y el filamento caudal de una ninfa/adulto usando fórceps y recogerlos en un tubo de 0,2 ml que contenga 50 μL EtOH (almacene las muestras recogidas a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo).
      NOTA: Las muestras de tejido se recogen en etoh porque evita la pérdida de estas pequeñas muestras debido a la electricidad estática. Si uno necesita detener el movimiento de los insectos, anestesia ninfa/adulto en hielo al tomar muestras de tejido. Debido a que T. domestica no puede sobrevivir después del enfriamiento a largo plazo en el hielo, no los anestesia durante más de un minuto e inmediatamente los mueva de vuelta a temperatura ambiente. La ablación del cerci y el filamento caudal no causa un aumento de la mortalidad.
   3. Coloque tubos de muestra con las tapas abiertas en un bloque térmico durante 15 minutos a 70 °C para evaporar el EtOH.
   4. Repita los pasos 4.2.2–4.2.5 para genotipado.
   5. Envíe los productos PCR en los que se observa un patrón de banda mutante a un servicio de secuenciación Sanger estándar.
   6. Mantenga las ninfas/adultos G1 con las mutaciones deseadas y deseche las demás (consulte la Figura 4C para obtener un resultado representativo de secuenciación).
4. Cruza a los adultos que contienen las mutaciones deseadas en un plato de apareamiento y obtiene las próximas generaciones para establecer una cepa mutante homocigólica.

Resultados

En nuestras manos, alrededor de 100 huevos se pueden inyectar bien con un solo capilar de inyección cuando tiene la punta adecuada(Figura 3C). Inyección de gRNA/Cas9 complejo ribonucleoprotein en embriones dentro de las primeras 8 h después de la puesta de óvulos resulta en indels en el sitio objetivo de gRNA. Esto causa mutaciones biallelicas en algunas células de la generación inyectada (G0) y por lo tanto los fenotipos de mosaico mutantes generalmente se obtienen en G0. Por ejemplo,...

Discusión

Para la generación exitosa del mutante T. domestica deseado con CRISPR/Cas9, primero es importante recoger un número suficiente de embriones escenificados para la inyección. Para una recolección constante de un número suficiente de huevos T. domestica, la clave es seleccionar un tamaño adecuado del recipiente para tener una menor densidad de población porque ayudaría a completar con éxito una serie de comportamientos complejos de apareamiento, que se repite después de cada muda adulta

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg	Integrated DNA Technologies	1081060
Anti-static cleaner	Hozan	Z-292	for removing static electricity from a 24-well plate
Barrier Box 20.7L	AS ONE	4-5606-01	Large container
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000013	Electronic microinjector
Femtotip II, injection capillary	Eppendorf	5242957000	Glass injection capillary
High Pack 2440mL	AS ONE	5-068-25	Middle-sized container
Incubator	Panasonic	MIR-554-PJ	for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator.
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.
Magnetic stand	Narishige	GJ-8	for holding the micromanipulator
Microloader	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MM-3
Microscope	Olympus	SZX12	for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
MultiNA	Shimadzu	MCE-202	Microchip electrophoresis system
NiceTac	Nichiban	NW-5	Double-sided tape to place eggs on a glass slide
Paint brush (horse hair)	Pentel	ZBS1-0
Plant culture dish	SPL Life Sciences	310100	Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris	Roche	3115836001
SZX 12 microscope	Olympus	SZX 12	More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
Talcum powder	Maruishi	877113
Tetra Goldfish Gold Growth	Spectrum Brands		Artificial regular fish food