Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat

Resumo

Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.

Resumo

O firebrat Thermobia domestica é uma espécie ametabolous, sem asas, que é adequada para estudar os mecanismos de desenvolvimento de insetos que levaram à sua radiação evolutiva bem sucedida na Terra. A aplicação de ferramentas genéticas como a edição de genomas é a chave para entender as mudanças genéticas responsáveis pelas transições evolutivas em uma abordagem Evo-Devo. Neste artigo, descrevemos nosso protocolo atual para gerar e manter cepas mutantes de T. domestica. Relatamos um método de injeção seca, como alternativa ao método de injeção molhada relatado, que nos permite obter altas taxas de sobrevivência em embriões injetados. Também relatamos uma configuração de ambiente otimizado para acasalar adultos e obter gerações subsequentes com alta eficiência. Nosso método ressalta a importância de levar em conta a biologia única de cada espécie para a aplicação bem sucedida de métodos de edição de genomas a organismos modelos não tradicionais. Prevemos que esses protocolos de edição de genomas ajudarão na implementação do T. domestica como modelo de laboratório e para acelerar ainda mais o desenvolvimento e a aplicação de ferramentas genéticas úteis nesta espécie.

Introdução

A termobia domestica pertence a uma das ordens mais basais de insetos, zygentoma, que mantém um ciclo de vida ancestral ametabolous e sem asas. Tal posição filogenética basal e características ancestrais definem esta espécie como um modelo atraente para estudar os mecanismos subjacentes ao sucesso dos insetos na Terra, que cobrem mais de 70% das espécies animais descritas¹. A T. domestica tem sido usada há muito tempo para estudar características ancestrais da fisiologia de insetos devido às suas características adequadas como modelo de laboratório, como um ciclo de vida relativamente curto (2,5-3,0 meses de embrião a adulto reprodutivo; Figura 1A) e uma criação fácil. Nas últimas três décadas, seu uso foi expandido para investigar características ancestrais de vários traços, como plano corporal, diferenciação neural e ritmos circadianos^2,3,4.

A aplicação de ferramentas genéticas avançadas em T. domestica poderia acelerar ainda mais tais contribuições em uma ampla área de pesquisa. A interferência de RNA bem sucedida (RNAi) mediada por danos genéticos em embriões, ninfas e adultos foi relatada em T. domestica^4,5,6. A eficiência do RNAi sistêmico ainda é altamente dependente de espécies — por exemplo, é geralmente alta em coleoptera, enquanto é baixa na ordem lepidoptera⁷. A eficiência e duração do knockdown rnai em T. domestica ainda está para ser avaliada. Além da RNAi, já reportamos um nocaute genético bem sucedido no CRISPR/Cas9 mediado em T. domestica⁸. O sistema CRISPR/Cas tem sido amplamente aplicado para edição de genomas em insetos particularmente para nocaute genético direcionado. Seu uso poderia ser expandido para outras aplicações, como ensaio de repórteres genéticos, rastreamento de linhagem celular e manipulação da atividade transcricional, derrubando construções exógenas após o estabelecimento de um protocolo para a entrega de componentes do sistema CRISPR/Cas em núcleos⁹. Combinado com o conjunto de genomas publicado^10,o amplo uso e o desenvolvimento da edição de genoma baseada em CRISPR/Cas em T. domestica facilitaria estudos com foco nos mecanismos evolutivos por trás do excelente sucesso adaptativo dos insetos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para microinjeção de embriões e para acasalamento adulto T. domestica para gerar uma cepa mutante usando CRISPR/Cas9. Considerando este novo método, discutimos a importância de considerar a biologia única de espécies modelos não tradicionais para aplicações bem sucedidas dessas técnicas.

Protocolo

1. Manutenção de colônias de laboratório

1. Para a manutenção de populações selvagens e mutantes, utilize um grande recipiente plástico (460 mm x 360 mm x 170 mm) com alimentos regulares de peixe artificial, água em copos plásticos com um orifício de ventilação na parte superior, um papel dobrado para esconder os insetos e algodão em camadas para colocação de ovos(Figura 2A). Mantenha todas as culturas T. domestica dentro de incubadoras de 37 °C e coloque a umidade relativa do ar (RH) dentro de cada recipiente para 60%-80%.
   NOTA: Como t. domestica absorve vapor de água da atmosfera^11,um fornecimento direto de água não é necessário. O RH apropriado é mantido devido à presença de vapor de água de copos plásticos contendo um orifício de ventilação na parte superior ou de copos sem tampa dentro de cada recipiente. Não há necessidade de umidificar dentro de uma incubadora inteira que contém culturas. A duração aproximada de cada estágio de desenvolvimento sob a condição descrita neste protocolo é mostrada na Figura 1. A velocidade de desenvolvimento poderia ser ajustada alterando a temperatura e/ou RH¹².
2. Adicione comida periodicamente. Adicione água antes que se doe.
3. Transfira as populações para um novo recipiente limpo pelo menos a cada 3 meses, dado que os adultos param de colocar ovos em um ambiente sujo e/ou população densa (ver Discussão).

2. Coleta de ovos e microinjeção

1. Projete um RNA guia (gRNA)
   1. Projete uma sequência de gRNA para cada alvo necessário e BLAST as sequências de gRNA contra o conjunto do genoma para verificar possíveis locais de reconhecimento fora do alvo.
   2. Sintetizar e purificar as gRNAs de acordo com as instruções do fabricante⁸.
      NOTA: Como exemplo, no caso de direcionar o gene branco do transportador de de ligação ATP, foi projetada uma sequência de alvos de 20 bps e dois oligonucleotídeos de DNA sintetizados 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' e 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCCACACACACACACTTA-3' foram ordenados. O modelo de DNA foi preparado por annealing esses dois oligonucleotídeos seguidos de amplificação PCR e o gRNA é então in vitro transcrito do modelo com uma polimerase T7 RNA.
2. Prepare colônias de coleta de ovos
   1. Transfira cerca de 20 adultos do sexo masculino e 20 do sexo feminino para um recipiente de tamanho médio (200 mm x 150 mm x 90 mm) com alimentos, abastecimento de água, papel dobrado e um pequeno pedaço de algodão em camadas para a colocação de ovos(Figura 2B).
   2. Configure várias colônias para obter um grande número de embriões encenados em um curto período de tempo para serem usados para a edição de genomas.
      NOTA: Cerca de 20 a 40 ovos devem ser coletados de uma colônia após 8h a 37 °C. Geralmente leva alguns dias para os adultos transferidos começarem a colocar ovos, possivelmente devido à adaptação a um novo ambiente.
3. No dia da injeção, substitua o algodão dentro dos recipientes por novos.
4. Coloque uma fita de 76 mm x 5 mm de dupla face em uma lâmina de vidro normal de 76 mm x 26 mm.
5. Oito horas depois, recolhe os ovos do algodão em camadas separando as camadas usando fórceps.
6. Alinhe os ovos na fita de dois lados usando um pincel de tinta molhada e mantenha uma distância de 2 mm entre os ovos. Todos os ovos devem ser orientados para que o eixo longitudinal de um ovo enfrente o lado da injeção(Figura 3A). Pressione suavemente os ovos com uma escova de tinta para segurar firme durante a injeção.
   NOTA: Neste protocolo, o fungo cresce rapidamente em ovos injetados danificados em condições molhadas e quentes. É importante manter a distância entre os ovos para evitar contaminação cruzada e expansão de fungos.
7. Misture a proteína gRNA e Cas9 a uma concentração final de 100 ng/μL e 500 ng/μL, respectivamente. Use água destilada para diluição. Incubar a mistura por 10 minutos à temperatura ambiente para promover a formação complexa da ribonucleoproteína e, em seguida, manter a mistura no gelo.
   NOTA: O vermelho neutro a uma concentração final de 1% pode ser adicionado à solução de injeção para monitorar a quantidade injetada.
8. Carregue 2 μL da solução gRNA/Cas9 em um capilar de injeção de vidro com um microcarregador. Certifique-se de que não há bolhas de ar na solução antes da injeção. Se necessário, toque na agulha para remover as bolhas.
   NOTA: Neste experimento, uma agulha pronta é usada para obter uma ponta fina de agulha(Figura 3B). Uma agulha caseira com uma forma semelhante poderia ser usada em vez disso.
9. Fixar o capilar de injeção de vidro, previamente carregado com a solução gRNA/Cas9, a um suporte equipado com um manipulador e conectar o suporte a um microinjetor eletrônico.
10. Otimize a forma da ponta da agulha, quebrando-a ligeiramente com fórceps para evitar entupimento e melhor durabilidade ao longo de uma série de injeções (um exemplo de uma agulha apropriada é mostrado na Figura 3C).
    NOTA: Recomenda-se trocar uma agulha quando estiver entupida. É possível continuar injetando com a mesma agulha se for quebrada novamente com fórceps, mas uma ponta mais larga leva a mais danos aos ovos e reduz sua taxa de sobrevivência. Como os ovos T. domestica são macios e frágeis, manter uma ponta fina de agulha é fundamental para ter uma alta taxa de sobrevivência após a injeção.
11. Insira a agulha no ponto médio do eixo longitudinal de um ovo e injete uma pequena quantidade da solução (ver Figura 3D-H para referência sobre a quantidade de injeção). Ajuste a configuração do microinjetor eletrônico durante a injeção, dependendo da forma da ponta da agulha.
    NOTA: Recomenda-se aplicar uma pressão constante durante a injeção, caso contrário, o conteúdo de ovos pegajoso pode facilmente fluir para dentro da agulha de vidro e pode entupi-lo. A solução pode ser injetar com um pulso de pressão curta ou com uma pressão constante, dependendo da quantidade de líquido injetado. Tenha em mente que quando uma ponta de agulha tem uma abertura larga, muita solução é injetada em um ovo, o que causa letalidade(Figura 3F-H). Nesse caso, mantenha um fluxo líquido constante por pressão constante, em seguida, insira a agulha em um ovo e puxe-a imediatamente. Se causar muito transbordamento ou o ovo estourar, troque a agulha.
12. Mantenha os ovos injetados em um recipiente com o tamanho adequado para o número de ovos injetados (<20 ovos: prato pequeno; >20 ovos: recipiente de tamanho médio) com 60%-80% RH e 37 °C.

3. Acasalamento

1. Verifique periodicamente os ovos injetados e descarte ovos danificados com fórceps para evitar o crescimento fúngico(Figura 3I,J). No caso de muito fungo está crescendo em um ovo, limpe a superfície do ovo com 70% de EtOH.
2. Antes de eclodir (aproximadamente 10 dias a 37 °C após a colocação do ovo), mergulhe o deslizamento de vidro com os ovos injetados em pó de talco para revestir a superfície da fita de dois lados. Isso evitará o empilhamento de ninfas eclodidas. Transfira os slides de vidro revestidos em pó para um recipiente de tamanho médio com comida, água e um papel dobrado para esconder os insetos.
3. Remova as lâminas de vidro depois que as ninfas chocarem. Forneça periodicamente alimentos até chegarem à idade adulta.
   NOTA: Leva cerca de 2,0-2,5 meses para os indivíduos chegarem à idade adulta após a eclosão(Figura 1A). A fase adulta é julgada com base em um ovipositor bem desenvolvido em fêmeas(Figura 1B).
4. Para acasalar os indivíduos, transfira quantos adultos fêmeas precisam de uma colônia de laboratório para o recipiente de tamanho médio e incuba-os por pelo menos 14 dias a 37 °C para ter certeza de que são virgens.
   NOTA: Não é necessário coletar fêmeas virgens de uma colônia de laboratório porque a T. domestica adulta tem um ciclo repetido de molting e acasalamento chamado "ciclo reprodutivo e de fusão", durante o qual as fêmeas jogam fora esperma com cada molt e mate novamente no próximo ciclo de fertilização¹³.
5. Transfira um macho ou uma fêmea G0 adulto que se desenvolveu de um ovo injetado e um adulto wildtype(s) para um pequeno prato plástico (Ø 100 mm x 40 mm) com alimentos, um papel dobrado e um pequeno pedaço de algodão para a colocação de ovos G1(Figura 2C'; prato de acasalamento). Mantenha os pratos de acasalamento em um recipiente maior com 60%-80% RH(Figura 2C).
   NOTA: Vários adultos selvagens podem ser incluídos em um prato para aumentar a chance de acasalamento bem sucedido, embora altas taxas de sucesso tenham sido alcançadas com um par.

4. Genotipagem

1. Design pcr primer pares para cada gRNA para amplificar um produto de 100-200 bp que inclui o site visado pelo gRNA. BLAST cada sequência de primer contra o conjunto do genoma para verificar sua especificidade (um exemplo é mostrado para o direcionamento do gene branco na Figura 4A).
2. Verifique a transformação germinal dos adultos G0.
   1. Cinco dias após a colocação dos ovos, colete ovos G1 individuais de cada par adulto G0 em tubos de 0,2 mL (um ovo por tubo; armazene amostras coletadas a -20 °C para um armazenamento a longo prazo). Separe as camadas de algodão para coletar os ovos.
      NOTA: Recomenda-se genótipo pelo menos 12 ninfas G1 de cada par de acasalamento para avaliar o sucesso da transmissão germinal (ver Resultados Representativos).
   2. Adicione 15 μL de uma solução Proteinase K de 0,25 mg/mL (dissolvida em tampão Tris-EDTA) a cada tubo, homogeneize brevemente amostras com palitos de dente e incubar a 55 °C por 3 a 16 h.
   3. Inative o Proteinase K colocando as amostras a 95 °C por 10 minutos.
   4. Adicione 90 μL de água destilada em cada tubo e misture bem. Use 2 μL de supernasário em uma mistura de reação PCR de 10 μL contendo os primers projetados na etapa 4.1.
      NOTA: Recomenda-se o uso de uma polimerase de DNA otimizada para modelos brutos para atingir amplificação pcr suficiente.
   5. Para analisar os produtos PCR, realize um ensaio de mobilidade heteroduplex (HMA) com um sistema de eletroforese de microchip(Figura 3B; ver Ohde et al., 2018)⁸.
      NOTA: As mutações podem ser avaliadas com dois métodos alternativos: (1) HMA com polímeros de gel padrão, como 8% poliacrilamida¹⁴; (2) digestão de produtos PCR com endonuclease T7 seguida de eletroforese de gel agarose¹⁵.
   6. Mantenha apenas as ninfas G1 resultantes de adultos G0 que contêm mutações em sua germe e descarte as outras.
3. Genotipagem individual de ninfas/adultos do G1
   1. Isole as ninfas G1 em placas de 24 poços com um aspirador ou um pincel de tinta. Coloque as placas de 24 poços em um recipiente maior (por exemplo, o recipiente de tamanho médio utilizado neste protocolo) com abastecimento de água conforme descrito acima para manter um RH de 60%-80%(Figura 1D). Manter o fornecimento de alimentos de peixe regulares artificiais(Figura 1D)..
      NOTA: Embora esta etapa possa ser realizada em qualquer ponto de estágios ninfais e adultos, recomenda-se realizá-la após atingir a idade adulta e pouco antes do emparelhamento (>2,5 meses após a injeção; Figura 1B) porque é mais fácil manter os focos de incêndio em um recipiente grande. A criação individual é necessária para rastrear o genótipo de cada ninfa G1 nas etapas a seguir. Ninfas G1 do mesmo G0 adulto podem ter mutações diferentes.
   2. Aperte e puxe cerci e o filamento caudal de uma ninfa/adulto usando fórceps e colete-os em um tubo de 0,2 mL contendo 50 μL EtOH (armazene as amostras coletadas a -20 °C para um armazenamento a longo prazo).
      NOTA: As amostras de tecido são coletadas em EtOH porque evita a perda dessas pequenas amostras devido à eletricidade estática. Se for preciso parar o movimento dos insetos, anestesia a ninfa/adulto no gelo ao colher amostras de tecido. Como T. domestica não pode sobreviver após o resfriamento a longo prazo no gelo, não anestesia-os por mais de um minuto e imediatamente movê-los de volta à temperatura ambiente. A ablação do cerci e do filamento caudal não causa aumento da mortalidade.
   3. Coloque tubos de amostra com as tampas abertas em um bloco térmico por 15 minutos a 70 °C para evaporar o EtOH.
   4. Repetir passos 4.2.2-4.2.5 para genotipagem.
   5. Envie os produtos PCR nos quais um padrão de banda mutante é observado para um serviço padrão de sequenciamento Sanger.
   6. Mantenha as ninfas/adultos do G1 com as mutações desejadas e descarte as outras (ver Figura 4C para um resultado de sequenciamento representativo).
4. Cruze os adultos contendo as mutações desejadas em um prato de acasalamento e obtenha as próximas gerações para estabelecer uma cepa mutante homozigosa.

Resultados

Em nossas mãos, cerca de 100 ovos podem ser bem injetados com uma única injeção capilar quando tem a ponta adequada(Figura 3C). Injeção de complexo de ribonucleoproteína gRNA/Cas9 em embriões nas primeiras 8h após a colocação de ovos resulta em indels no local alvo do gRNA. Isso causa mutações bialólicas em algumas células da geração injetada (G0) e, portanto, fenótipos de mosaico mutantes são geralmente obtidos em G0. Por exemplo, quando este protocolo foi usado para inje...

Discussão

Para a geração bem sucedida do mutante T. domestica desejado com CRISPR/Cas9, é primeiro importante coletar um número suficiente de embriões encenados para injeção. Para uma coleta constante de um número suficiente de ovos T. domestica, a chave é selecionar um tamanho apropriado do recipiente para ter uma densidade populacional menor, pois ajudaria a conclusão bem sucedida de uma série de comportamentos complexos de acasalamento, que se repete após cada molt^{adulto 13}....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg	Integrated DNA Technologies	1081060
Anti-static cleaner	Hozan	Z-292	for removing static electricity from a 24-well plate
Barrier Box 20.7L	AS ONE	4-5606-01	Large container
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000013	Electronic microinjector
Femtotip II, injection capillary	Eppendorf	5242957000	Glass injection capillary
High Pack 2440mL	AS ONE	5-068-25	Middle-sized container
Incubator	Panasonic	MIR-554-PJ	for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator.
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.
Magnetic stand	Narishige	GJ-8	for holding the micromanipulator
Microloader	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MM-3
Microscope	Olympus	SZX12	for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
MultiNA	Shimadzu	MCE-202	Microchip electrophoresis system
NiceTac	Nichiban	NW-5	Double-sided tape to place eggs on a glass slide
Paint brush (horse hair)	Pentel	ZBS1-0
Plant culture dish	SPL Life Sciences	310100	Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris	Roche	3115836001
SZX 12 microscope	Olympus	SZX 12	More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
Talcum powder	Maruishi	877113
Tetra Goldfish Gold Growth	Spectrum Brands		Artificial regular fish food