Microinjection d’oeufs et accouplement efficace pour l’édition du génome dans le Firebrat Thermobia domestica

Résumé

Nous fournissons un protocole détaillé pour l’élevage, la microinjection des œufs et pour l’accouplement efficace du firebrat Thermobia domestica pour générer et maintenir des souches mutantes après l’édition du génome.

Résumé

Le firebrat Thermobia domestica est une espèce amétabolique et sans ailes qui convient à l’étude des mécanismes de développement des insectes qui ont mené à leur rayonnement évolutif réussi sur la terre. L’application d’outils génétiques tels que l’édition du génome est la clé pour comprendre les changements génétiques qui sont responsables des transitions évolutionnaires dans une approche Evo-Devo. Dans cet article, nous décrivons notre protocole actuel pour générer et maintenir des souches mutantes de T. domestica. Nous rapportons une méthode d’injection sèche, comme alternative à la méthode d’injection humide rapportée, qui nous permet d’obtenir des taux de survie sensiblement élevés dans les embryons injectés. Nous signalons également un environnement optimisé pour accoupler les adultes et obtenir les générations suivantes avec une grande efficacité. Notre méthode souligne l’importance de tenir compte de la biologie unique de chaque espèce pour l’application réussie des méthodes d’édition du génome aux organismes modèles non traditionnels. Nous prévoyons que ces protocoles d’édition du génome aideront à mettre en œuvre T. domestica en tant que modèle de laboratoire et à accélérer davantage le développement et l’application d’outils génétiques utiles chez cette espèce.

Introduction

Thermobia domestica appartient à l’un des ordres d’insectes les plus basiques, Zygentoma, qui conserve un cycle de vie ancestral amétabolique et sans ailes. Cette position phylogénétique basale et ses caractéristiques ancestrales placent cette espèce comme un modèle attrayant pour l’étude des mécanismes sous-jacents au succès des insectes sur Terre, qui couvrent plus de 70 % des espèces animales^{décrites 1}. T. domestica a longtemps été utilisé principalement pour étudier les caractéristiques ancestrales de la physiologie des insectes en raison de ses caractéristiques appropriées en tant que modèle de laboratoire, comme un cycle de vie relativement court (2,5-3,0 mois de l’embryon à l’adulte reproducteur; Figure 1A) et une reproduction facile. Au cours des trois dernières décennies, son utilisation a été élargie pour étudier les caractéristiques ancestrales de divers traits tels que le plan corporel, la différenciation neuronale et les rythmes^{circadiens 2,3,4}.

L’application d’outils génétiques avancés dans T. domestica pourrait encore accélérer ces contributions dans un vaste domaine de recherche. L’interférence réussie d’ARN (RNAi)-2-2meint le renversement de gène dans les embryons, les nymphes, et les adultes a été rapporté dans T. domestica^4,5,6. L’efficacité de l’ARNi systémique est encore fortement tributaire des espèces — par exemple, elle est généralement élevée chez les coléoptères alors qu’elle est faible dans l’ordre des lépidoptères⁷. L’efficacité et la durée du renversement du RNAi à T. domestica n’ont pas encore été évaluées. En plus de RNAi, nous avons précédemment rapporté un succès CRISPR/Cas9-19-20 knockout gène dans T. domestica⁸. Le système CRISPR/Cas a été largement appliqué pour l’édition du génome chez les insectes en particulier pour les knockout génétiques ciblés. Son utilisation pourrait être étendue pour d’autres applications telles que l’analyse de journaliste de gène, le suivi de lignée cellulaire, et la manipulation de l’activité transcriptionnelle en frappant-dans les constructions exogènes après l’établissement d’un protocole pour livrer des composants du système CRISPR/Cas dans les noyaux^9. Combinée à l’assemblage du^{génome publié 10}, l’utilisation à grande échelle et le développement ultérieur de l’édition du génome crispr/cas dans T. domestica faciliteraient des études axées sur les mécanismes évolutifs derrière le succès adaptatif exceptionnel des insectes. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la microinjection embryonnaire et pour l’accouplement adulte T. domestica pour générer une souche mutante à l’aide de CRISPR/Cas9. Compte tenu de cette nouvelle méthode, nous discutons de l’importance de considérer la biologie unique des espèces modèles non traditionnelles pour des applications réussies de ces techniques.

Protocole

1. Maintien des colonies de laboratoire

1. Pour le maintien des populations sauvages et mutantes, utilisez un grand contenant en plastique (460 mm x 360 mm x 170 mm) avec des aliments artificiels réguliers pour le poisson, de l’eau dans des tasses en plastique avec un trou de ventilation sur le dessus, un papier plié pour cacher les insectes et du coton superposé pour pondre desœufs ( figure 2A). Gardez toutes les cultures T. domestica à l’intérieur des incubateurs de 37 °C et réglez l’humidité relative (HR) à l’intérieur de chaque récipient à 60%-80%.
   REMARQUE : Étant donné que T. domestica absorbe la vapeur d’eau de l’atmosphère^11,un approvisionnement direct en eau n’est pas nécessaire. L’HR approprié est maintenu en raison de la présence de vapeur d’eau provenant de gobelets en plastique contenant un trou de ventilation sur le dessus ou de tasses sans couvercle à l’intérieur de chaque récipient. Il n’est pas nécessaire d’humidifier à l’intérieur d’un incubateur entier qui contient des cultures. La durée approximative de chaque étape du développement dans la condition décrite dans ce protocole est indiquée à la figure 1. La vitesse de développement pourrait être ajustée en changeant la température et/ou rh^12.
2. Ajouter les aliments périodiquement. Ajouter l’eau avant qu’elle ne sèche.
3. Transférer les populations dans un nouveau contenant propre au moins tous les 3 mois étant donné que les adultes cessent de pondre dans un environnement sale et/ou une population dense (voir Discussion).

2. Collecte et microinjection d’oeufs

1. Concevoir un guide ARN (gRNA)
   1. Concevoir une séquence d’ARNg pour chaque cible requise et BLAST les séquences d’ARN g contre l’assemblage du génome pour vérifier les sites de reconnaissance hors cible possibles.
   2. Synthétiser et purifier les ARN selon les instructions du fabricant⁸.
      REMARQUE : À titre d’exemple, dans le cas du ciblage du gène blanc du transporteur de cassettes liant l’ATP, une séquence cible de 20 points de base a été conçue et deux oligonucléotides d’ADN synthétisés 5'-TAATACGACTCACTATAGTGTGTGTGTGGGAC-3' et 5'-TTCTAGCTTATAAAACATCGGTCCCAACACTTA-3' ont été commandés. Le modèle d’ADN a été préparé en annelant ces deux oligonucléotides suivis de l’amplification de PCR et le gRNA est alors transcrit in vitro du modèle avec une polymésexase d’ARN T7.
2. Préparer des colonies de collecte d’œufs
   1. Transférer environ 20 adultes mâles et 20 femelles dans un récipient de taille moyenne (200 mm x 150 mm x 90 mm) avec de la nourriture, de l’approvisionnement en eau, un papier plié et un petit morceau de coton superposé pour la ponte (figure 2B).
   2. Mettre en place plusieurs colonies pour obtenir un grand nombre d’embryons mis en scène dans un court laps de temps à utiliser pour l’édition du génome.
      REMARQUE : On s’attend à ce qu’environ 20 à 40 œufs soient prélevés dans une colonie après 8 h à 37 °C. Il faut habituellement quelques jours aux adultes transférés pour commencer à pondre des œufs, peut-être en raison de l’adaptation à un nouvel environnement.
3. Le jour de l’injection, remplacer le coton à l’intérieur des contenants par de nouveaux.
4. Placez une bande à double face de 76 mm x 5 mm sur une glissière en verre ordinaire de 76 mm x 26 mm.
5. Huit heures plus tard, recueillir les œufs du coton en couches en séparant les couches à l’aide de forceps.
6. Alignez les œufs sur le ruban à double face à l’aide d’un pinceau humide et gardez une distance de 2 mm entre les œufs. Tous les oeufs doivent être orientés de sorte que l’axe longitudinal d’un œuf fait face au côté injection (figure 3A). Presser doucement les œufs à l’aide d’un pinceau pour tenir fermement pendant l’injection.
   REMARQUE : Dans ce protocole, le champignon pousse rapidement dans les œufs injectés endommagés dans un état humide et chaud. Il est important de garder la distance entre les œufs pour prévenir la contamination croisée et l’expansion du champignon.
7. Mélanger l’ARN et la protéine Cas9 à une concentration finale de 100 ng/μL et 500 ng/μL, respectivement. Utilisez de l’eau distillée pour la dilution. Incuber le mélange pendant 10 min à température ambiante pour favoriser la formation complexe de ribonucléoprotéines, puis garder le mélange sur la glace.
   REMARQUE : Un rouge neutre à une concentration finale de 1 % pourrait être ajouté à la solution d’injection pour surveiller la quantité injectée.
8. Chargez 2 μL de la solution gRNA/Cas9 dans un capillaire d’injection de verre à l’aide d’un microchargeur. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la solution avant l’injection. Si nécessaire, appuyez sur l’aiguille pour enlever les bulles.
   REMARQUE : Dans cette expérience, une aiguille prête à l’herbe est utilisée pour obtenir une pointe d’aiguille fine (figure 3B). Une aiguille maison avec une forme similaire pourrait être utilisée à la place.
9. Fixez le capillaire d’injection de verre, précédemment chargé de la solution gRNA/Cas9, à un support équipé d’un manipulateur et connectez le support à un microinjecteur électronique.
10. Optimisez la forme de la pointe de l’aiguille en la cassant légèrement avec des forceps pour éviter l’engorgement et obtenir une meilleure durabilité tout au long d’une série d’injections (un exemple d’aiguille appropriée est indiqué dans la figure 3C).
    REMARQUE : Il est recommandé de changer une aiguille lorsqu’elle est obstruée. Il est possible de continuer à injecter avec la même aiguille si elle est brisée à nouveau avec des forceps, mais une pointe plus large conduit à plus de dommages aux œufs et abaisse leur taux de survie. Comme les œufs de T. domestica sont mous et fragiles, il est essentiel de garder une pointe d’aiguille fine pour avoir un taux de survie élevé après l’injection.
11. Insérez l’aiguille au milieu de l’axe longitudinal d’un œuf et injectez une légère quantité de la solution (voir la figure 3D-H pour référence sur la quantité d’injection). Ajustez la configuration du microinjecteur électronique pendant l’injection, en fonction de la forme de la pointe de l’aiguille.
    REMARQUE : Il est recommandé d’appliquer une pression constante pendant l’injection, sinon le contenu collant d’oeuf peut facilement couler dans l’aiguille en verre et peut l’obstruer. La solution peut être soit d’injecter avec une impulsion de pression courte ou avec une pression constante, selon la quantité de liquide injecté. Gardez à l’esprit que lorsqu’une pointe d’aiguille a une ouverture large, trop de solution est injectée dans un œuf, ce qui provoque la létalité (Figure 3F-H). Dans ce cas, maintenez un flux liquide constant par pression constante, puis insérez l’aiguille dans un œuf et retirez-la immédiatement. S’il provoque trop de débordement ou que l’œuf éclate, changer l’aiguille.
12. Gardez les oeufs injectés dans un récipient avec la taille appropriée pour le nombre d’oeufs injectés (<20 oeufs: petit plat; >20 oeufs: récipient de taille moyenne) avec 60%-80% RH et 37 °C.

3. Accouplement

1. Vérifiez périodiquement les œufs injectés et jetez les œufs endommagés avec des forceps pour éviter la croissancefongique( Figure 3I,J). Dans le cas où trop de champignon pousse sur un œuf, nettoyer la surface de l’œuf avec 70% EtOH.
2. Avant l’éclosion (environ 10 jours à 37 °C après la ponte), tremper la glissade de verre avec les œufs injectés dans de la poudre de talc pour enrober la surface du ruban adhésif à double face. Cela permettra d’éviter l’empilement de nymphes écloses. Transférez les glissières en verre enduites de poudre dans un récipient de taille moyenne avec de la nourriture, de l’eau et un papier plié pour cacher les insectes.
3. Retirez les glissières de verre après l’éclosion des nymphes. Fournissez périodiquement de la nourriture jusqu’à ce qu’ils atteignent l’âge adulte.
   REMARQUE : Il faut environ 2,0 à 2,5 mois pour que les individus atteignent l’âge adulte après leur éclosion (figure 1A). Le stade adulte est jugé sur la base d’un ovipositeur bien développé chez les femelles (Figure 1B).
4. Pour accoupler les individus, transférez autant d’adultes femelles de type sauvage que nécessaire d’une colonie de laboratoire au récipient de taille moyenne et incubez-les pendant au moins 14 jours à 37 °C pour s’assurer qu’ils sont vierges.
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de recueillir les femelles vierges d’une colonie de laboratoire parce que les T. domestica adultes ont un cycle répété de mue et d’accouplement appelé « cycle reproducteur et muant », au cours duquel les femelles jettent le sperme avec chaque mue et s’accouplent à nouveau dans le prochain cycle de fécondation¹³.
5. Transférer un adulte G0 mâle ou femelle qui s’est développé à partir d’un œuf injecté et d’un adulte sauvage à un petit plat en plastique (Ø 100 mm x 40 mm) avec de la nourriture, un papier plié et un petit morceau de coton pour pondre des œufs G1(figure 2C'; plat d’accouplement). Gardez les plats d’accouplement dans un plus grand récipient avec 60%-80% RH (Figure 2C).
   REMARQUE : Plusieurs adultes de type sauvage peuvent être inclus dans un plat pour augmenter les chances de succès de l’accouplement, bien que des taux de réussite élevés aient été atteints avec l’appariement en un à un.

4. Genotyping

1. Concevoir des paires d’amorce PCR pour chaque rRNA pour amplifier un produit de 100-200 bp qui inclut le site ciblé par l’ARNm. BLAST chaque séquence d’amorce contre l’assemblage du génome pour vérifier sa spécificité (un exemple est montré pour le ciblage du gène blanc dans la figure 4A).
2. Vérifiez la transformation germinale des adultes G0.
   1. Cinq jours après la ponte, recueillir les œufs G1 individuels de chaque paire adulte G0 dans des tubes de 0,2 mL (un œuf par tube; conserver les échantillons recueillis à -20 °C pour un stockage à long terme). Séparer les couches de coton pour recueillir les œufs.
      REMARQUE : Il est recommandé de génotyper au moins 12 nymphes G1 de chaque paire d’accouplement pour évaluer le succès de la transmission germinale (voir Résultats représentatifs).
   2. Ajouter 15 μL d’une solution Proteinase K de 0,25 mg/mL (dissoute dans le tampon Tris-EDTA) à chaque tube, homogénéiser brièvement les échantillons avec des cure-dents et incuber à 55 °C pendant 3 à 16 h.
   3. Inactivez la Proteinase K en plaçant les échantillons à 95 °C pendant 10 min.
   4. Ajouter 90 μL d’eau distillée à chaque tube et bien mélanger. Utilisez 2 μL de supernatant dans un mélange de réaction PCR de 10 μL contenant les amorces conçues à l’étape 4.1.
      REMARQUE : L’utilisation d’une polymése d’ADN optimisée pour les modèles bruts est recommandée pour atteindre suffisamment d’amplification PCR.
   5. Pour analyser les produits PCR, effectuez un test de mobilité hétéroduplexe (HMA) avec un système d’électrophoresis à micropuces(figure 3B; voir Ohde et coll., 2018)⁸.
      REMARQUE : Les mutations pourraient être évaluées avec deux méthodes alternatives : (1) HMA avec des polymères de gel standard, tels que 8% polyacrylamide¹⁴; (2) digestion des produits PCR avec endonuclease T7 suivie d’électrophoresis gel agarose¹⁵.
   6. Ne gardez que les nymphes G1 résultant d’adultes G0 qui contiennent des mutations dans leur lignée germinale et jetez les autres.
3. Génotypage individuel des nymphes/adultes G1
   1. Isoler les nymphes G1 dans des assiettes de 24 puits à l’aide d’un aspirateur ou d’un pinceau. Placez les plaques de 24 puits dans un récipient plus grand (p. ex., le contenant de taille moyenne utilisé dans ce protocole) avec l’approvisionnement en eau tel que décrit ci-dessus pour maintenir une HR de 60 % à 80 %(figure 1D). Maintenir l’approvisionnement en nourriture artificielle de poisson ordinaire(figure 1D').
      NOTE : Bien que cette étape puisse être exécutée à n’importe quel point des étapes nymphales et adultes, il est recommandé de l’exécuter après avoir atteint l’âge adulte et juste avant l’appariement (>2.5 mois après injection ; Figure 1B) parce qu’il est plus facile de maintenir les firebrats dans un grand récipient. L’élevage individuel est nécessaire pour suivre le génotype de chaque nymphe G1 sur les étapes suivantes. Les nymphes G1 du même adulte G0 peuvent avoir des mutations différentes.
   2. Pincez et tirez le cerci et le filament caudal d’une nymphe/adulte à l’aide de forceps et recueillez-les dans un tube de 0,2 mL contenant 50 μL EtOH (stockez les échantillons recueillis à -20 °C pour un stockage à long terme).
      REMARQUE : Des échantillons de tissus sont prélevés dans EtOH parce qu’ils empêchent la perte de ces petits échantillons en raison de l’électricité statique. Si l’on a besoin d’arrêter le mouvement des insectes, anesthésier nymphe / adulte sur la glace lors de la prise d’échantillons de tissus. Comme T. domestica ne peut survivre après un refroidissement à long terme sur la glace, ne les anesthésiez pas pendant plus d’une minute et déplacez-les immédiatement à la température ambiante. L’ablation du cerci et du filament caudal ne provoque aucune augmentation de la mortalité.
   3. Placez les tubes d’échantillon avec les couvercles ouverts sur un bloc thermique pendant 15 min à 70 °C pour évaporer l’EtOH.
   4. Répétez les étapes 4.2.2-4.2.5 pour le génotypage.
   5. Soumettez les produits PCR dans lesquels un modèle de bande mutante est observé à un service de séquençage Sanger standard.
   6. Gardez les nymphes/adultes G1 avec les mutations désirées et jetez les autres (voir la figure 4C pour un résultat représentatif de séquençage).
4. Croisez les adultes contenant les mutations désirées dans un plat d’accouplement et obtenez les générations suivantes pour établir une souche mutante homozygote.

Résultats

Dans nos mains, environ 100 oeufs peuvent être bien injectés avec un capillaire à injection unique quand il a la pointe adéquate (Figure 3C). L’injection du complexe de ribonucleoprotein de gRNA/Cas9 dans les embryons dans les 8 premières h après la ponte a comme résultat des indélébiles au site visé de gRNA. Cela provoque des mutations bialéliques dans certaines cellules de la génération injectée (G0) et donc des phénotypes de mosaïque mutante sont généralement obtenus e...

Discussion

Pour la génération réussie du mutant T. domestica désiré avec CRISPR/Cas9, il est d’abord important de recueillir un nombre suffisant d’embryons mis en scène pour injection. Pour une collecte constante d’un nombre suffisant d’œufs T. domestica, la clé est de sélectionner une taille appropriée du récipient pour avoir une densité de population inférieure, car elle aiderait à l’achèvement réussi d’une série de comportements complexes d’accouplement, qui se répète après cha...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg	Integrated DNA Technologies	1081060
Anti-static cleaner	Hozan	Z-292	for removing static electricity from a 24-well plate
Barrier Box 20.7L	AS ONE	4-5606-01	Large container
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000013	Electronic microinjector
Femtotip II, injection capillary	Eppendorf	5242957000	Glass injection capillary
High Pack 2440mL	AS ONE	5-068-25	Middle-sized container
Incubator	Panasonic	MIR-554-PJ	for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator.
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.
Magnetic stand	Narishige	GJ-8	for holding the micromanipulator
Microloader	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MM-3
Microscope	Olympus	SZX12	for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
MultiNA	Shimadzu	MCE-202	Microchip electrophoresis system
NiceTac	Nichiban	NW-5	Double-sided tape to place eggs on a glass slide
Paint brush (horse hair)	Pentel	ZBS1-0
Plant culture dish	SPL Life Sciences	310100	Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris	Roche	3115836001
SZX 12 microscope	Olympus	SZX 12	More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
Talcum powder	Maruishi	877113
Tetra Goldfish Gold Growth	Spectrum Brands		Artificial regular fish food