מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

Summary

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

Abstract

תרמוביה הביתית של האש היא מין אמטבולי וחסר כנפיים המתאים לחקר המנגנונים ההתפתחותיים של חרקים שהובילו לקרינה האבולוציונית המוצלחת שלהם על פני כדור הארץ. היישום של כלים גנטיים כגון עריכת גנום הוא המפתח להבנת שינויים גנטיים האחראים על מעברים אבולוציוניים בגישה Evo-Devo. במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקול הנוכחי שלנו ליצירת ותחזוקה של זנים מוטנטים של T. domestica. אנו מדווחים על שיטת הזרקה יבשה, כחלופה לשיטת ההזרקה הרטובה המדווחת, המאפשרת לנו להשיג שיעורי הישרדות גבוהים ביציבות בעוברים מוזרקים. אנו מדווחים גם על הגדרת סביבה ממוטבת להזדווגות עם מבוגרים ולקבל את הדורות הבאים ביעילות גבוהה. השיטה שלנו מדגישה את החשיבות של התחשבות בביולוגיה הייחודית של כל מין ליישום מוצלח של שיטות עריכת גנום לאורגניזמים מודל לא מסורתיים. אנו צופים כי פרוטוקולי עריכת הגנום הללו יסייעו ביישום T. domestica כמודל מעבדה ולהאיץ עוד יותר את הפיתוח והיישום של כלים גנטיים שימושיים במין זה.

Introduction

Thermobia domestica שייך לאחד ממסדרי החרקים הבסיסיים ביותר, זיג נטומה, השומרת על מחזור חיים אמטבולי וחסר כנפיים של אבות קדמונים. תנוחה פילוגנטית בסיסית כזו ומאפייני אבות מגדירים מין זה כמודל אטרקטיבי לחקר המנגנונים שבבסיס ההצלחה של חרקים על פני כדור הארץ, המכסים מעל 70% ממיני בעלי החיים המתוארים¹. T. domestica שימש זמן רב בעיקר כדי ללמוד מאפיינים אבות של פיזיולוגיה חרקים בגלל המאפיינים המתאימים שלה כמודל מעבדה, כגון מחזור חיים קצר יחסית (2.5-3.0 חודשים מעובר למבוגר הרבייה; איור 1A) ורבייה קלה. בשלושת העשורים האחרונים הורחב השימוש בו כדי לחקור מאפיינים של אבות קדמונים של תכונות שונות כגון תוכנית גוף, בידול עצבי ומקצבים צירקדיים^2,3,4.

יישום כלים גנטיים מתקדמים ב- T. domestica יכול להאיץ עוד יותר תרומות כאלה בתחום מחקר רחב. הפרעה מוצלחת RNA (RNAi)-בתיווך נפילת גנים בעוברים, נימפות, ומבוגרים דווח ב T. domestica^4,5,6. היעילות של RNAi המערכתי עדיין תלויה מאוד במינים - לדוגמה, הוא בדרך כלל גבוה בקולופטרה ואילו הוא נמוך בסדר הלפידופטרה⁷. היעילות ומשך ההפלה של RNAi ב- T. domestica טרם נבדקו. בנוסף ל- RNAi, דיווחנו בעבר על נוקאאוט גנים מוצלח של CRISPR/Cas9 בתיווך T. domestica⁸. מערכת CRISPR/Cas הוחלה באופן נרחב לעריכת גנום בחרקים במיוחד עבור נוקאאוט גנים ממוקדים. השימוש בו יכול להיות מורחב עבור יישומים אחרים כגון בדיקת כתב גנים, מעקב אחר שושלת התא, ומניפולציה של פעילות שעתוק על ידי דפיקות במבנים אקסוגני לאחר הקמת פרוטוקול להעברת רכיבים של מערכת CRISPR / Cas לתוך גרעינים⁹. בשילוב עם הרכבה הגנום שפורסם¹⁰, השימוש הרחב ופיתוח נוסף של עריכת הגנום מבוסס CRISPR / Cas ב T. domestica יקל על מחקרים המתמקדים במנגנונים האבולוציוניים שמאחורי ההצלחה המסתגלת יוצאת הדופן של חרקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור microinjection העובר עבור הזדווגות בוגר T. domestica כדי ליצור זן מוטציה באמצעות CRISPR / Cas9. בהתחשב בשיטה חדשנית זו, אנו דנים בחשיבות של התחשבות בביולוגיה הייחודית של מיני מודלים לא מסורתיים ליישומים מוצלחים של טכניקות אלה.

Protocol

1. תחזוקת מושבות מעבדה

1. לשמירה על אוכלוסיות של דגים מלאכותיים ומוטנטים, השתמשו במיכל פלסטיק גדול (460 מ"מ x 360 מ"מ x 170 מ"מ) עם מזון דגים מלאכותי רגיל, מים ב כוסות פלסטיק עם חור אוורור בחלקו העליון, נייר מקופל להסתרת החרקים וכותנה שכבתית להטלת ביצים (איור 2A). שמור את כל תרבויות T. domestica בתוך 37 °C (70 °F) חממות ולהגדיר את הלחות היחסית (RH) בתוך כל מיכל ל 60%-80%.
   הערה: מכיוון ש- T. domestica סופג אדי מים מהאטמוספירה¹¹, אין צורך באספקת מים ישירה. RH המתאים נשמר בשל נוכחות של אדי מים מכוסות פלסטיק המכיל חור אוורור בחלק העליון או כוסות lidless בתוך כל מיכל. אין צורך לחות בתוך אינקובטור שלם המכיל תרבויות. משך הזמן המשוער של כל שלב התפתחותי בתנאי המתואר בפרוטוקול זה מוצג באיור 1. המהירות ההתפתחותית יכולה להיות מותאמת על ידי שינוי הטמפרטורה ו / או RH¹².
2. מוסיפים אוכל מעת לעת. מוסיפים מים לפני שהם מתייבשים.
3. להעביר את האוכלוסיות למיכל נקי חדש לפחות כל 3 חודשים בהתחשב בכך שמבוגרים מפסיקים להטיל ביצים בסביבה מלוכלכת ו / או אוכלוסייה צפופה (ראה דיון).

2. איסוף ביצים ומיקרו-יין

1. עיצוב RNA מדריך (gRNA)
   1. תכנן רצף gRNA עבור כל מטרה נדרשת ופוצץ את רצפי gRNA נגד הרכבת הגנום כדי לבדוק אתרי זיהוי אפשריים מחוץ ליעד.
   2. לסנתז ולטהר את gRNAs על פי הוראות היצרן⁸.
      הערה: כדוגמה, במקרה של מיקוד הגן הלבן טרנספורטר קלטת מחייב ATP, רצף יעד 20 bp תוכנן ושני אוליגונוקלאוטידים DNA מסונתז 5 '-TAATACGACTCACTACTTAGTAGTGTGGGAC-3' ו 5'-TTCTAGCTCTAAAAכתא-3' הוזמנו. תבנית הדנ"א הוכנה על ידי חישול שני אוליגונוקלאוטידים אלה ואחריו הגברה PCR ואת gRNA הוא אז במבחנה מתמלל מן התבנית עם פולימראז T7 RNA.
2. הכנת מושבות איסוף ביצים
   1. העבירו כ-20 גברים ו-20 נשים מבוגרים למיכל בגודל בינוני (200 מ"מ x 150 מ"מ x 90 מ"מ) עם מזון, אספקת מים, נייר מקופל וחתיכת כותנה שכבתית קטנה להנחת ביצים (איור 2B).
   2. להקים מספר מושבות כדי לקבל מספר גדול של עוברים מבוימים בפרק זמן קצר כדי לשמש לעריכת גנום.
      הערה: כ-20-40 ביצים צפויות להיאסף ממושבה לאחר 8 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. בדרך כלל לוקח כמה ימים למבוגרים שהועברו להתחיל להטיל ביצים, אולי בגלל הסתגלות לסביבה חדשה.
3. ביום ההזרקה, להחליף את הכותנה בתוך המיכלים עם חדשים.
4. הנח סרט דו-צדדי בגודל 76 מ"מ x 5 מ"מ על שקופית זכוכית רגילה של 76 מ"מ x 26 מ"מ.
5. שמונה שעות לאחר מכן, לאסוף את הביצים מן הכותנה שכבתית על ידי הפרדת השכבות באמצעות מלקחיים.
6. מיישרים את הביצים על הסרט הדו-צדדי באמצעות מברשת צבע רטובה ושומרים על מרחק של 2 מ"מ בין הביצים. יש לכוון את כל הביצים כך שציר הביצה האורך יפונה לצד ההזרקה(איור 3A). לחץ בעדינות על הביצים עם מברשת צבע להחזקה מוצקה במהלך ההזרקה.
   הערה: בפרוטוקול זה, הפטרייה גדלה במהירות בביצים מוזרקות פגומות במצב רטוב וחם. חשוב לשמור על המרחק בין הביצים כדי למנוע זיהום צולב והתרחבות הפטרייה.
7. מערבבים את חלבון gRNA ו- Cas9 לריכוז סופי של 100 ננוגרם/μL ו- 500 ng/μL, בהתאמה. השתמש במים מזוקקים לדילול. דגירה את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקדם היווצרות מורכבת ריבונוקלאופרוטאין ולאחר מכן לשמור את התערובת על הקרח.
   הערה: אדום ניטרלי בריכוז סופי של 1% ניתן להוסיף לפתרון ההזרקה כדי לפקח על הכמות מוזרקת.
8. טען 2 μL של פתרון gRNA / Cas9 נימי הזרקת זכוכית עם microloader. ודא שאין בועות אוויר בתמיסה לפני ההזרקה. במידת הצורך, הקש על המחט כדי להסיר את הבועות.
   הערה: בניסוי זה, מחט מוכנה משמשת לקבלת קצה מחט עדין (איור 3B). מחט תוצרת בית עם צורה דומה יכול לשמש במקום.
9. לתקן את נימי הזרקת זכוכית, טעון בעבר עם הפתרון gRNA / Cas9, למחזיק מצויד מניפולטור ולחבר את המחזיק microinjector אלקטרונית.
10. מטב את צורת קצה המחט על ידי שבירתו מעט במלקחיים כדי למנוע סתימה ועמידות טובה יותר לאורך סדרה של זריקות (דוגמה למחט מתאימה מוצגת באיור 3C).
    הערה: מומלץ להחליף מחט כאשר היא סתומה. אפשר להמשיך להזריק עם אותה מחט אם הוא שבור שוב עם מלקחיים, אבל טיפ רחב יותר מוביל יותר נזק לביצה ומוריד את שיעור ההישרדות שלהם. כמו T. ביצים מקומיות הם רכים ושבירים, שמירה על קצה מחט בסדר הוא המפתח שיש שיעור הישרדות גבוה לאחר הזרקה.
11. הכנס את המחט לנקודת האמצע של ציר האורך של ביצה והזרק כמות קלה של הפתרון (ראה איור 3D-H לעיון בכמות ההזרקה). להתאים את התצורה של microinjector אלקטרונית במהלך ההזרקה, בהתאם לצורת קצה המחט.
    הערה: מומלץ להפעיל לחץ מתמיד במהלך ההזרקה, אחרת תכולת ביצה דביקה יכולה בקלות לזרום לתוך מחט הזכוכית ועלולה לסתום אותו. הפתרון עשוי להיות גם להזריק עם דופק לחץ קצר או עם לחץ מתמיד, בהתאם לכמות הנוזל מוזרק. זכור שכאשר לקצה המחט יש פתח רחב, יותר מדי פתרון מוזרק לביצה, מה שגורם לקטלניות (איור 3F-H). במקרה זה, לשמור על זרימה נוזלית מתמדת על ידי לחץ מתמיד, ולאחר מכן להכניס את המחט לתוך ביצה ולמשוך אותו מיד. אם זה גורם יותר מדי גלישה או פרצי הביצה, לשנות את המחט.
12. שמור את הביצים המוזרקות במיכל עם הגודל המתאים למספר הביצים המוזרקות (<20 ביצים: צלחת קטנה; >20 ביצים: מיכל בגודל בינוני) עם 60%-80% RH ו 37 °C (67 °F).

3. הזדווגות

1. בדקו את הביצים המוזרקות מעת לעת והשליכו ביצים פגומות במלקחיים כדי למנוע צמיחה פטרייתית(איור 3I,J). במקרה יותר מדי פטרייה גדל על ביצה, לנקות את פני השטח של הביצה עם 70% EtOH.
2. לפני הבקיעה (כ 10 ימים ב 37 מעלות צלזיוס לאחר הטלת ביצה), לטבול את שקופית הזכוכית עם הביצים מוזרק לתוך אבקת טלק כדי לצפות את פני השטח של הסרט דו צדדי. זה ימנע את הערימה של נימפות בקעו. מעבירים את מגלשות הזכוכית מצופות האבקה למיכל בגודל בינוני עם מזון, מים ונייר מקופל להסתרת החרקים.
3. הסר את מגלשות הזכוכית לאחר שהנימפות בקעו. מעת לעת לספק מזון עד שהם מגיעים לבגרות.
   הערה: לוקח בערך חודשיים וחצי עד שאנשים מגיעים לבגרות אחרי שהם בוקעים (איור 1A). הבמה הבוגרת נשפטת על סמך אוביפוסטור מפותח אצל נקבות (איור 1B).
4. כדי להזדווג עם הפרטים, להעביר כמה שיותר מבוגרים נקבות בר הדרושים ממושבת מעבדה למיכל בגודל בינוני ולהדגיר אותם לפחות 14 ימים ב 37 מעלות צלזיוס כדי לוודא שהם בתולים.
   הערה: אין צורך לאסוף נקבות בתולה ממושבת מעבדה כי למבוגרים T. domestica יש מחזור חוזר ונשנה של הזדווגות והזדווגות שנקרא "מחזור הרבייה וההזדווגות", שבמהלכו הנקבות זורקות זרע עם כל molt ומזדווגות שוב במחזור ההפריה הבא¹³.
5. העבירו זכר או נקבה בוגר G0 שהתפתח מביצה מוזרקת ומבוגרים מסוג פראי לצלחת פלסטיק קטנה (100 מ"מ x 40 מ"מ) עם אוכל, נייר מקופל וחתיכת כותנה קטנה להטלת ביצי G1(איור 2C'; צלחת הזדווגות). שמור את מנות ההזדווגות במיכל גדול יותר עם 60%-80% RH(איור 2C).
   הערה: ניתן לכלול בצלחת מספר מבוגרים מסוג פראי כדי להגדיל את הסיכוי להזדווגות מוצלחת, אם כי שיעורי הצלחה גבוהים הושגו עם זיווג אחד לאחד.

4. גנוטיפינג

1. עיצוב זוגות פריימר PCR עבור כל gRNA כדי להגביר מוצר 100-200 bp הכולל את האתר ממוקד על ידי gRNA. BLAST כל רצף פריימר מול מכלול הגנום כדי לבדוק את הספציפיות שלו (דוגמה מוצגת למיקוד הגן הלבן באיור 4A).
2. בדוק את טרנספורמציית הנבט של מבוגרי G0.
   1. חמישה ימים לאחר הטלת הביצים, אוספים ביצי G1 בודדות מכל זוג בוגרים G0 לצינורות 0.2 מ"ל (ביצה אחת לכל צינור; חנות אספה דגימות ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך). להפריד את שכבות כותנה כדי לאסוף את הביצים.
      הערה: מומלץ לגנוטיפ לפחות 12 נימפות G1 מכל זוג הזדווגות כדי להעריך את ההצלחה של העברת הנבט (ראה תוצאות מייצגות).
   2. הוסף 15 μL של 0.25 מ"ג / מ"ל Proteinase K פתרון (מומס במאגר Tris-EDTA) לכל צינור, בקצרה הומוגניזציה דגימות עם קיסמים, ואת הדגירה ב 55 °C (70 °F) עבור 3 עד 16 שעות.
   3. להשבית את Proteinase K על ידי הצבת הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
   4. מוסיפים 90 μL של מים מזוקקים לכל צינור ומערבבים היטב. השתמש 2 μL של supernatant בתמהיל תגובת PCR μL 10 μL המכיל את פריימרים תוכנן בשלב 4.1.
      הערה: מומלץ להשתמש בפולימראז DNA המותאם לתבניות גולמיות כדי להגיע למספיק הגברה של PCR.
   5. כדי לנתח את מוצרי PCR, בצע בדיקת ניידות הטרודופלקס (HMA) עם מערכת אלקטרופורזה של שבב זעיר (איור 3B; ראה Ohde et al., 2018)⁸.
      הערה: מוטציות ניתן להעריך עם שתי שיטות חלופיות: (1) HMA עם פולימרים ג'ל סטנדרטי, כגון 8% polyacrylamide¹⁴; (2) עיכול של מוצרי PCR עם אנדונוקלאאז T7 ואחריו אלקטרופורזה ג'ל agarose¹⁵.
   6. שמור רק את נימפות G1 הנובעות מבוגרים G0 המכילים מוטציות בנבט שלהם להשליך את האחרים.
3. גנוטיפינג אישי של נימפות G1 / מבוגרים
   1. בודדו את נימפות G1 ללוחות של 24 בארות עם שאיפה או מברשת צבע. הנח את לוחות 24 הבאר במיכל גדול יותר (למשל, המיכל הבינוני המשמש בפרוטוקול זה) עם אספקת מים כמתואר לעיל כדי לשמור על RH של 60%-80%(איור 1D). שמרו על אספקת מזון דגים מלאכותי רגיל(איור 1D).
      הערה: למרות שלב זה יכול להתבצע בכל נקודה של שלבי נימפה ומבוגרים, מומלץ לבצע אותו לאחר שהגיע לבגרות ורגע לפני הזיווג (>2.5 חודשים לאחר ההזרקה; איור 1B) כי קל יותר לתחזק כבאיות במיכל גדול. גידול אישי נדרש כדי לעקוב אחר הגנוטיפ של כל נימפה G1 על השלבים הבאים. נימפות G1 מאותו מבוגר G0 יכול להיות מוטציות שונות.
   2. צבוט ומשוך cerci ואת חוט caudal מנימפה / מבוגר באמצעות מלקחיים ולאסוף אותם לתוך צינור 0.2 מ"ל המכיל 50 μL EtOH (לאחסן את הדגימות שנאספו ב -20 °C (70 °F) עבור אחסון לטווח ארוך).
      הערה: דגימות רקמה נאספות ב- EtOH מכיוון שהיא מונעת אובדן של דגימות קטנות אלה עקב חשמל סטטי. אם אדם צריך לעצור את התנועה של חרקים, המרדים נימפה / מבוגר על קרח בעת לקיחת דגימות רקמה. כי T. domestica לא יכול לשרוד לאחר קירור לטווח ארוך על קרח, לא להרדים אותם במשך יותר מדקה ומיד להעביר אותם בחזרה לטמפרטורת החדר. אבלציה של cerci ואת חוטי caudal גורם ללא עלייה בתמותה.
   3. מניחים צינורות מדגם עם העפעפיים פתוחים על בלוק תרמי במשך 15 דקות ב 70 מעלות צלזיוס כדי לאדות את EtOH.
   4. חזור על שלבים 4.2.2–4.2.5 עבור genotyping.
   5. שלח את מוצרי ה- PCR שבהם תבנית רצועת מוטנטים נצפתה לשירות רצף סנגר סטנדרטי.
   6. שמרו על הנימפות/מבוגרים של G1 עם המוטציות הרצויות והשליכו את האחרים (ראו איור 4C לקבלת תוצאת רצף מייצגת).
4. חוצים את המבוגרים המכילים את המוטציות הרצויות בצלחת הזדווגות ומשיגים את הדורות הבאים כדי ליצור זן מוטנט הומוזיגי.

תוצאות

בידינו, כ -100 ביצים ניתן להזריק היטב עם נימי הזרקה אחת כאשר יש לו את הקצה המתאים(איור 3C). הזרקה של gRNA / Cas9 ריבונוקלאופרוטאין קומפלקס בעוברים בתוך 8 h הראשון לאחר הטלת ביצה תוצאות indels באתר ממוקד gRNA. זה גורם מוטציות biallelic בתאים מסוימים של הדור מוזרק (G0) ולכן פנוטיפים פסיפס מוטציה מ?...

Discussion

עבור הדור המוצלח של מוטציית T. domestica הרצויה עם CRISPR/Cas9, חשוב תחילה לאסוף מספר מספיק של עוברים מבוימים להזרקה. עבור אוסף קבוע של מספר מספיק של ביצי T. domestica, המפתח הוא לבחור גודל מתאים של המיכל יש צפיפות אוכלוסין נמוכה יותר כי זה יעזור להשלים בהצלחה סדרה של התנהגויות הזדווגות מורכבות, א...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg	Integrated DNA Technologies	1081060
Anti-static cleaner	Hozan	Z-292	for removing static electricity from a 24-well plate
Barrier Box 20.7L	AS ONE	4-5606-01	Large container
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000013	Electronic microinjector
Femtotip II, injection capillary	Eppendorf	5242957000	Glass injection capillary
High Pack 2440mL	AS ONE	5-068-25	Middle-sized container
Incubator	Panasonic	MIR-554-PJ	for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator.
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.
Magnetic stand	Narishige	GJ-8	for holding the micromanipulator
Microloader	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MM-3
Microscope	Olympus	SZX12	for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
MultiNA	Shimadzu	MCE-202	Microchip electrophoresis system
NiceTac	Nichiban	NW-5	Double-sided tape to place eggs on a glass slide
Paint brush (horse hair)	Pentel	ZBS1-0
Plant culture dish	SPL Life Sciences	310100	Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris	Roche	3115836001
SZX 12 microscope	Olympus	SZX 12	More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
Talcum powder	Maruishi	877113
Tetra Goldfish Gold Growth	Spectrum Brands		Artificial regular fish food