Ei-Mikroinjektion und effiziente Mating für die Genombearbeitung im Firebrat Thermobia domestica

Zusammenfassung

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.

Zusammenfassung

Der Feuerbrat Thermobia domestica ist eine ametabolöse, flügellose Art, die sich für die Untersuchung der Entwicklungsmechanismen von Insekten eignet, die zu ihrer erfolgreichen evolutionären Strahlung auf der Erde geführt haben. Die Anwendung genetischer Werkzeuge wie der Genombearbeitung ist der Schlüssel zum Verständnis genetischer Veränderungen, die für evolutionäre Übergänge in einem Evo-Devo-Ansatz verantwortlich sind. In diesem Artikel beschreiben wir unser aktuelles Protokoll zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme von T. domestica. Wir berichten von einer Trockeninjektionsmethode als Alternative zur gemeldeten Nassinjektionsmethode, die es uns ermöglicht, stabil hohe Überlebensraten bei injizierten Embryonen zu erhalten. Wir berichten auch über eine optimierte Umgebungseinstellung, um Erwachsene zu paaren und nachfolgende Generationen mit hoher Effizienz zu erhalten. Unsere Methode unterstreicht, wie wichtig es ist, die einzigartige Biologie jeder Art für die erfolgreiche Anwendung von Genombearbeitungsmethoden auf nicht-traditionelle Modellorganismen zu berücksichtigen. Wir sagen voraus, dass diese Genom-Editing-Protokolle bei der Implementierung von T. domestica als Labormodell helfen und die Entwicklung und Anwendung nützlicher genetischer Werkzeuge in dieser Spezies weiter beschleunigen werden.

Einleitung

Thermobia domestica gehört zu einem der basalsten Insektenorden, Zygentoma, das einen uralten ametabolen und flügellosen Lebenszyklus behält. Eine solche basale phylogenetische Position und Ahneneigenschaften setzen diese Art als ein attraktives Modell für die Untersuchung der Mechanismen, die dem Erfolg von Insekten auf der Erde zugrunde liegen, die über 70% der beschriebenen Tierarten abdecken¹. T. domestica wird seit langem hauptsächlich zur Untersuchung der Urmerkmale der Insektenphysiologie verwendet, da sie als Labormodell geeignet ist, wie z. B. einen relativ kurzen Lebenszyklus (2,5–3,0 Monate vom Embryo bis zum reproduktiven Erwachsenen; Abbildung 1A) und eine einfache Zucht. In den letzten drei Jahrzehnten wurde seine Verwendung erweitert, um ahnende Eigenschaften verschiedener Merkmale wie Körperplan, neuronale Differenzierung und zirkadiane Rhythmen^2,3,4zu untersuchen.

Die Anwendung fortschrittlicher genetischer Werkzeuge in T. domestica könnte solche Beiträge in einem weiten Forschungsgebiet weiter beschleunigen. Erfolgreiche RNA-Interferenz (RNAi)-vermittelter Gen-Knockdown bei Embryonen, Nymphen und Erwachsenen wurde in T. domestica^4,5,6berichtet. Die Effizienz von systemischen RNAi ist immer noch stark artenabhängig – zum Beispiel ist sie in coleoptera im Allgemeinen hoch, während sie in der Lepidoptera-Ordnung⁷niedrig ist. Die Effizienz und Dauer des RNAi-Knockdowns in T. domestica muss noch bewertet werden. Zusätzlich zu RNAi haben wir bereits über einen erfolgreichen CRISPR/Cas9-vermittelten Genknockout in T. domestica⁸berichtet. Das CRISPR/Cas-System wurde häufig für die Genombearbeitung bei Insekten eingesetzt, insbesondere für gezielte Genknockouts. Seine Verwendung könnte für andere Anwendungen wie Genreporter-Assay, Zelllinienverfolgung und Manipulation der Transkriptionsaktivität erweitert werden, indem exogene Konstrukte nach der Einrichtung eines Protokolls zur Bereitstellung von Komponenten des CRISPR/Cas-Systems in Kerne⁹eingeschlagen werden. In Kombination mit der veröffentlichten Genombaugruppe¹⁰würde die breite Nutzung und Weiterentwicklung der CRISPR/Cas-basierten Genombearbeitung in T. domestica Studien erleichtern, die sich auf die evolutionären Mechanismen hinter dem herausragenden adaptiven Erfolg von Insekten konzentrieren. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Embryo-Mikroinjektion und für die Paarung von Adult T. domestica, um einen mutierten Stamm mit CRISPR/Cas9 zu erzeugen. Unter Berücksichtigung dieser neuartigen Methode diskutieren wir, wie wichtig es ist, die einzigartige Biologie nicht-traditioneller Modellarten für erfolgreiche Anwendungen dieser Techniken zu berücksichtigen.

Protokoll

1. Pflege von Laborkolonien

1. Für die Erhaltung von Wildtyp- und Mutantenpopulationen verwenden Sie einen großen Kunststoffbehälter (460 mm x 360 mm x 170 mm) mit regelmäßiger künstlicher Fischnahrung, Wasser in Plastikbechern mit einem Lüftungsloch auf der Oberseite, ein gefaltetes Papier zum Verstecken der Insekten und geschichtete Baumwolle zum Eierlegen(Abbildung 2A). Halten Sie alle T. domestica Kulturen in 37 °C Inkubatoren und stellen Sie die relative Luftfeuchtigkeit (RH) in jedem Behälter auf 60%–80%.
   HINWEIS: Da T. domestica Wasserdampf aus der Atmosphäre¹¹absorbiert, ist eine direkte Wasserversorgung nicht erforderlich. Der entsprechende RH wird durch das Vorhandensein von Wasserdampf aus Kunststoffbechern, die ein Lüftungsloch auf der Oberseite oder von lidlosen Bechern in jedem Behälter enthalten, aufrechterhalten. Es besteht keine Notwendigkeit, in einem ganzen Brutkasten zu befeuchten, der Kulturen enthält. Die ungefähre Dauer jeder Entwicklungsphase unter der in diesem Protokoll beschriebenen Bedingung ist in Abbildung 1dargestellt. Die Entwicklungsgeschwindigkeit könnte durch Änderung der Temperatur und/oder RH¹²eingestellt werden.
2. Fügen Sie Regelmäßig Lebensmittel hinzu. Fügen Sie Wasser hinzu, bevor es austrocknet.
3. Übertragen Sie die Populationen mindestens alle drei Monate in einen neuen sauberen Behälter, da Erwachsene aufhören, Eier in einer schmutzigen Umgebung und/oder einer dichten Bevölkerung zu legen (siehe Diskussion).

2. Eiersammlung und Mikroinjektion

1. Entwerfen einer Führungs-RNA (gRNA)
   1. Entwerfen Sie eine gRNA-Sequenz für jedes benötigte Ziel und BLAST die gRNA-Sequenzen gegen die Genombaugruppe, um mögliche Off-Target-Erkennungsstellen zu überprüfen.
   2. Synthesisieren und reinigen Sie die gRNAs gemäß den Anweisungen des Herstellers⁸.
      HINWEIS: Im Falle eines Targetings des weißen AtP-bindenden Kassettentransporters wurde beispielsweise eine Zielsequenz von 20 bp entwickelt und zwei synthetisierte DNA-Oligonukleotide 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTGTGTGGGAC-3' und 5'-TTCTAGCTCTAAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3' bestellt. Die DNA-Vorlage wurde durch Glühen dieser beiden Oligonukleotide, gefolgt von PCR-Amplifikation, hergestellt und die gRNA wird dann in vitro aus der Schablone mit einer T7-RNA-Polymerase transkribiert.
2. Vorbereiten von Eiersammelkolonien
   1. Überführen Sie etwa 20 männliche und 20 weibliche Erwachsene in einen mittelgroßen Behälter (200 mm x 150 mm x 90 mm) mit Nahrung, Wasserversorgung, gefaltetem Papier und einem kleinen Stück geschichteter Baumwolle für die Eiablage(Abbildung 2B).
   2. Richten Sie mehrere Kolonien ein, um eine große Anzahl von inszenierten Embryonen in kurzer Zeit zu erhalten, um für die Genombearbeitung verwendet zu werden.
      HINWEIS: Es wird erwartet, dass nach 8 h bei 37 °C etwa 20 bis 40 Eier aus einer Kolonie gesammelt werden. Es dauert in der Regel ein paar Tage für übertragene Erwachsene, um Eier zu legen, möglicherweise aufgrund der Anpassung an eine neue Umgebung.
3. Ersetzen Sie am Tag der Injektion die Baumwolle in den Behältern durch neue.
4. Legen Sie ein 76 mm x 5 mm doppelseitiges Klebeband auf einen normalen 76 mm x 26 mm Glasschlitten.
5. Acht Stunden später sammeln Sie die Eier aus der geschichteten Baumwolle, indem Sie die Schichten mit Zangen trennen.
6. Richten Sie die Eier auf dem doppelseitigen Klebeband mit einem nassen Pinsel aus und halten Sie einen Abstand von 2 mm zwischen den Eiern. Alle Eier sollten so ausgerichtet sein, dass die Längsachse eines Eis der Injektionsseite gegenübersteht (Abbildung 3A). Drücken Sie die Eier vorsichtig mit einem Pinsel für festes Halten während der Injektion.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wächst Pilz schnell in beschädigten injizierten Eiern unter nassem und warmem Zustand. Es ist wichtig, den Abstand zwischen den Eiern zu halten, um Kreuzkontamination und Ausdehnung des Pilzes zu verhindern.
7. Mischen Sie das gRNA- und Cas9-Protein auf eine Endkonzentration von 100 ng/l bzw. 500 ng/l. Verwenden Sie destilliertes Wasser zur Verdünnung. Inkubieren Sie die Mischung für 10 min bei Raumtemperatur, um Ribonukleoprotein-Komplexbildung zu fördern und dann die Mischung auf Eis zu halten.
   HINWEIS: Neutrales Rot in einer Endkonzentration von 1% könnte der Injektionslösung hinzugefügt werden, um die injizierte Menge zu überwachen.
8. Mit einem Mikrolader 2 l der gRNA/Cas9-Lösung in eine Glasinjektionskapillare einzuladen. Stellen Sie sicher, dass sich vor der Injektion keine Luftblasen in der Lösung befinden. Tippen Sie bei Bedarf auf die Nadel, um die Blasen zu entfernen.
   HINWEIS: In diesem Experiment wird eine fertige Nadel verwendet, um eine feine Nadelspitze zu erhalten (Abbildung 3B). Stattdessen könnte eine selbstgemachte Nadel mit ähnlicher Form verwendet werden.
9. Befestigen Sie die Glasinjektionskapillare, die zuvor mit der gRNA/Cas9-Lösung beladen war, an einem mit einem Manipulator ausgestatteten Halter fest und schließen Sie den Halter an einen elektronischen Mikroinjektor an.
10. Optimieren Sie die Form der Nadelspitze, indem Sie sie leicht mit Zangen brechen, um Verstopfung zu verhindern und eine bessere Haltbarkeit während einer Reihe von Injektionen zu erhalten (ein Beispiel für eine geeignete Nadel ist in Abbildung 3Cdargestellt).
    HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Nadel zu wechseln, wenn sie verstopft ist. Es ist möglich, weiterhin mit der gleichen Nadel zu injizieren, wenn es wieder mit Zange gebrochen wird, aber eine breitere Spitze führt zu mehr Eischaden und senkt ihre Überlebensrate. Da T. domestica Eier weich und zerbrechlich sind, ist das Halten einer feinen Nadelspitze der Schlüssel für eine hohe Überlebensrate nach der Injektion.
11. Setzen Sie die Nadel an der Mitte der Längsachse eines Eis ein und injizieren Sie eine leichte Menge der Lösung (siehe Abbildung 3D-H zur Angabe der Injektionsmenge). Passen Sie die Konfiguration des elektronischen Mikroinjektors während der Injektion an, abhängig von der Form der Nadelspitze.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, während der Injektion einen konstanten Druck aufzutragen, da sonst klebrige Eiinhalte leicht in die Glasnadel fließen und sie verstopfen können. Die Lösung kann sein, entweder mit einem kurzen Druckimpuls oder mit einem konstanten Druck zu injizieren, abhängig von der Menge der injizierten Flüssigkeit. Denken Sie daran, dass, wenn eine Nadelspitze eine breite Öffnung hat, zu viel Lösung in ein Ei injiziert wird, was tödlich enden(Abbildung 3F-H). In diesem Fall einen konstanten Flüssigkeitsfluss durch konstanten Druck aufrecht erhalten, dann die Nadel in ein Ei einsetzen und sofort herausziehen. Wenn es zu viel Überlauf verursacht oder das Ei platzt, ändern Sie die Nadel.
12. Bewahren Sie die injizierten Eier in einem Behälter mit der entsprechenden Größe für die Anzahl der injizierten Eier (<20 Eier: kleine Schale; >20 Eier: mittelgroße Behälter) mit 60%–80% RH und 37 °C auf.

3. Paarung

1. Überprüfen Sie die injizierten Eier regelmäßig und entsorgen Sie beschädigte Eier mit Zangen, um Pilzwachstum zu vermeiden (Abbildung 3I,J). Falls zu viel Pilz auf einem Ei wächst, reinigen Sie die Oberfläche des Eis mit 70% EtOH.
2. Vor dem Schlüpfen (ca. 10 Tage bei 37 °C nach Eiablage) die Glasrutsche mit den injizierten Eiern in Talkumpulver tauchen, um die Oberfläche des doppelseitigen Bandes zu beschichten. Dies wird das Stapeln von geschlüpften Nymphen vermeiden. Übertragen Sie die pulverbeschichteten Glasrutschen in einen mittelgroßen Behälter mit Nahrung, Wasser und einem gefalteten Papier zum Verstecken der Insekten.
3. Entfernen Sie die Glasgleitet, nachdem die Nymphen geschlüpft sind. Liefern Sie regelmäßig Nahrung, bis sie das Erwachsenenalter erreichen.
   HINWEIS: Es dauert etwa 2,0–2,5 Monate, bis Personen nach dem Schlüpfen das Erwachsenenalter erreichen (Abbildung 1A). Die Erwachsenenstufe wird anhand eines gut entwickelten Eileiters bei Frauen beurteilt (Abbildung 1B).
4. Um die Individuen zu paaren, übertragen Sie so viele wie nötig wilde weibliche Erwachsene aus einer Laborkolonie in den mittelgroßen Behälter und bebrüten sie für mindestens 14 Tage bei 37 °C, um sicherzustellen, dass sie jungfräulich sind.
   HINWEIS: Es ist nicht notwendig, jungfräuliche Weibchen aus einer Laborkolonie zu sammeln, weil erwachsene T. domestica einen wiederholten Zyklus von Molting und Paarung namens "Reproduktiv- und Molting-Zyklus", während der Weibchen werfen Weg Sperma mit jedem Molt und mate wieder in den nächsten Befruchtungszyklus¹³.
5. Übertragen Sie entweder einen männlichen oder einen weiblichen G0-Erwachsenen, der sich aus einem injizierten Ei und Wildtyp-Erwachsenen entwickelt hat, auf eine kleine Plastikschale (ca. 100 mm x 40 mm) mit Nahrung, einem gefalteten Papier und einem kleinen Stück Baumwolle zum Legen von G1-Eiern(Abbildung 2C'; Paarungsschale). Bewahren Sie die Paarungsgerichte in einem größeren Behälter mit 60%–80% RH auf (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Mehrere Wildtyp-Erwachsene können in ein Gericht aufgenommen werden, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Paarung zu erhöhen, obwohl hohe Erfolgsraten mit eins-zu-eins-Paarung erreicht wurden.

4. Genotypisierung

1. Entwerfen Sie PCR-Primerpaare für jede gRNA, um ein 100–200 bp Produkt zu verstärken, das die von der gRNA angestrebte Site enthält. BLAST jede Primersequenz gegen die Genombaugruppe, um ihre Spezifität zu überprüfen (ein Beispiel für die Ausrichtung des weißen Gens in Abbildung 4A).
2. Überprüfen Sie die Keimbahntransformation von G0-Erwachsenen.
   1. Fünf Tage nach dem Legen der Eier einzelne G1-Eier von jedem G0-Erwachsenenpaar in 0,2 ml-Röhrchen (ein Ei pro Tube; gesammelte Proben bei -20 °C für eine Langzeitlagerung lagern). Trennen Sie die Baumwollschichten, um die Eier zu sammeln.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, mindestens 12 G1-Nymphen aus jedem Paar zu genotypisieren, um den Erfolg der Keimbahnübertragung zu bewerten (siehe Repräsentative Ergebnisse).
   2. Fügen Sie jeder Tube 15 l einer 0,25 mg/ml Proteinase-K-Lösung (gelöst in Tris-EDTA-Puffer) hinzu, homogenisieren Sie Proben kurz mit Zahnstochern und inkubieren Sie bei 55 °C für 3 bis 16 h.
   3. Inaktivieren Sie die Proteinase K, indem Sie die Proben 10 min bei 95 °C platzieren.
   4. Fügen Sie 90 l destilliertes Wasser in jedes Rohr und mischen Sie gut. Verwenden Sie 2 l Überstand in einem 10-L-PCR-Reaktionsmix, der die in Schritt 4.1 entworfenen Primer enthält.
      HINWEIS: Die Verwendung einer DNA-Polymerase, die für rohe Schablonen optimiert ist, wird empfohlen, um eine ausreichende PCR-Verstärkung zu erreichen.
   5. Um die PCR-Produkte zu analysieren, führen Sie einen Heteroduplex Mobility Assay (HMA) mit einem Mikrochip-Elektrophorese-System durch (Abbildung 3B; siehe Ohde et al., 2018)⁸.
      ANMERKUNG: Mutationen könnten mit zwei alternativen Methoden bewertet werden: (1) HMA mit Standard-Gelpolymeren, wie z. B. 8% Polyacrylamid^14; (2) Vergärung von PCR-Produkten mit T7-Endonuklease, gefolgt von Agarose-Gel-Elektrophorese¹⁵.
   6. Bewahren Sie nur die G1-Nymphen auf, die von G0-Erwachsenen stammen, die Mutationen in ihrer Keimbahn enthalten, und entsorgen Sie die anderen.
3. Individuelle Genotypisierung von G1-Nymphen/Erwachsenen
   1. Isolieren Sie G1-Nymphen in 24-Well-Platten mit einem Aspirator oder einem Pinsel. Legen Sie die 24-Well-Platten in einen größeren Behälter (z. B. den in diesem Protokoll verwendeten mittelgroßen Behälter) mit Wasserversorgung, wie oben beschrieben, um einen RH von 60 % bis 80 % zu halten(Abbildung 1D). Die Versorgung mit künstlichen regelmäßigen Fischfuttern aufrechtzuerhalten(Abbildung 1D').
      HINWEIS: Obwohl dieser Schritt an jedem Punkt der Nymphen- und Erwachsenenstadien durchgeführt werden kann, wird empfohlen, ihn nach Erreichen des Erwachsenenalters und kurz vor der Paarung durchzuführen (>2,5 Monate nach der Injektion; Abbildung 1B) weil es einfacher ist, Feuerratten in einem großen Behälter zu warten. Die individuelle Aufzucht ist erforderlich, um den Genotyp jeder G1-Nymphe auf den folgenden Schritten zu verfolgen. G1 Nymphen aus dem gleichen G0-Erwachsenen können unterschiedliche Mutationen haben.
   2. Cerci und das kaudale Filament einer Nymphe/Erwachsenen mit Zangen kneifen und ziehen und in ein 0,2 ml-Rohr mit 50 L EtOH einsammeln (die gesammelten Proben bei -20 °C für eine Langzeitlagerung lagern).
      HINWEIS: Gewebeproben werden in EtOH gesammelt, da es den Verlust dieser kleinen Proben durch statische Elektrizität verhindert. Wenn man die Bewegung von Insekten stoppen muss, befeuchten Nymphe/Erwachsener auf Eis, wenn man Gewebeproben nimmt. Da T. domestica nach einer langzeitigen Abkühlung auf Eis nicht überleben kann, befeuchten Sie sie nicht länger als eine Minute und bringen Sie sie sofort wieder auf Raumtemperatur. Die Ablation von Cerci und dem kaudalen Filament führt nicht zu einer Erhöhung der Sterblichkeit.
   3. Probenrohre mit geöffneten Deckeln auf einem Thermoblock 15 min bei 70 °C aufstellen, um den EtOH zu verdampfen.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.2–4.2.5 für die Genotypisierung.
   5. Übermitteln Sie die PCR-Produkte, bei denen ein mutiertes Bandmuster beobachtet wird, an einen Standardmäßigen Sanger-Sequenzierungsdienst.
   6. Halten Sie die G1 Nymphen/Erwachsenen mit den gewünschten Mutationen und verwerfen Sie die anderen (siehe Abbildung 4C für ein repräsentatives Sequenzierungsergebnis).
4. Überqueren Sie die Erwachsenen, die die gewünschten Mutationen in einer Paarungsschale enthalten, und erhalten Sie die nächsten Generationen, um einen homozygoten mutierten Stamm zu etablieren.

Ergebnisse

In unseren Händen können etwa 100 Eier gut mit einer einzigen Injektionskapillare injiziert werden, wenn sie die entsprechende Spitze hat (Abbildung 3C). Die Injektion des gRNA/Cas9-Ribonukleoprotein-Komplexes in Embryonen innerhalb der ersten 8 h nach Eiablage führt zu Indels an der gRNA-Zielstelle. Dies führt dazu, dass biallelic Mutationen in einigen Zellen der injizierten Generation (G0) und damit mutierte Mosaik-Phänotypen werden in der Regel in G0 erhalten. Wenn dieses Protokoll b...

Diskussion

Für die erfolgreiche Erzeugung der gewünschten T. domestica Mutante mit CRISPR/Cas9 ist es zunächst wichtig, eine ausreichende Anzahl von inszenierten Embryonen zur Injektion zu sammeln. Für eine konstante Sammlung einer ausreichenden Anzahl von T. domestica Eiern ist der Schlüssel, eine geeignete Größe des Behälters zu wählen, um eine geringere Bevölkerungsdichte zu haben, da es zum erfolgreichen Abschluss einer Reihe von komplexen Paarungsverhalten beitragen würde, die nach jedem Erwachsene...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg	Integrated DNA Technologies	1081060
Anti-static cleaner	Hozan	Z-292	for removing static electricity from a 24-well plate
Barrier Box 20.7L	AS ONE	4-5606-01	Large container
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000013	Electronic microinjector
Femtotip II, injection capillary	Eppendorf	5242957000	Glass injection capillary
High Pack 2440mL	AS ONE	5-068-25	Middle-sized container
Incubator	Panasonic	MIR-554-PJ	for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator.
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.
Magnetic stand	Narishige	GJ-8	for holding the micromanipulator
Microloader	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MM-3
Microscope	Olympus	SZX12	for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
MultiNA	Shimadzu	MCE-202	Microchip electrophoresis system
NiceTac	Nichiban	NW-5	Double-sided tape to place eggs on a glass slide
Paint brush (horse hair)	Pentel	ZBS1-0
Plant culture dish	SPL Life Sciences	310100	Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris	Roche	3115836001
SZX 12 microscope	Olympus	SZX 12	More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
Talcum powder	Maruishi	877113
Tetra Goldfish Gold Growth	Spectrum Brands		Artificial regular fish food