Firebrat Thermobia domestica'da Genom Düzenleme için Yumurta Mikroenjeksiyon ve Verimli Çiftleşme

Özet

Genom düzenlemeden sonra mutant suşları oluşturmak ve sürdürmek için yumurtaların yetiştirilmesi, mikroenjeksiyonu ve ateş aşındırıcı Thermobia domestica'nın verimli çiftleşmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

Ateş aşındırıcı Thermobia domestica, yeryüzünde başarılı evrimsel radyasyonlarına yol açan böceklerin gelişim mekanizmalarını incelemek için uygun ametabolous, kanatsız bir türdür. Genom düzenleme gibi genetik araçların uygulanması, Evo-Devo yaklaşımında evrimsel geçişlerden sorumlu olan genetik değişiklikleri anlamanın anahtarıdır. Bu yazıda, T. domestica'nınmutant suşlarını üretmek ve sürdürmek için mevcut protokolümüzü açıklıyoruz. Bildirilen ıslak enjeksiyon yöntemine alternatif olarak, enjekte edilen embriyolarda stably yüksek sağkalım oranları elde etmemizi sağlayan bir kuru enjeksiyon yöntemi rapor ediyoruz. Ayrıca yetişkinleri çiftleşmek ve sonraki nesilleri yüksek verimlilikle elde etmek için optimize edilmiş bir ortam ayarı bildiriyoruz. Yöntemimiz, genom düzenleme yöntemlerinin geleneksel olmayan model organizmalara başarılı bir şekilde uygulanması için her türün benzersiz biyolojisini dikkate almanın öneminin altını çizmektedir. Bu genom düzenleme protokollerinin T. domestica'nın bir laboratuvar modeli olarak uygulanmasına ve bu türdeki yararlı genetik araçların geliştirilmesini ve uygulanmasını daha da hızlandırmaya yardımcı olacağını öngörüyoruz.

Giriş

Thermobia domestica, atalardan kalma ametabolöz ve kanatsız bir yaşam döngüsünü koruyan en bazal böcek emirlerinden biri olan Zygentoma'ya aittir. Bu bazal filogenetik pozisyon ve atasal özellikler, bu türü, tanımlanan hayvan türlerinin% 70'inden fazlasını kapsayan Dünyadaki böceklerin başarısının altında kalan mekanizmaları incelemek için çekici bir model olarak belirledi¹. T. domestica, nispeten kısa bir yaşam döngüsü (embriyodan üreme yetişkinine 2,5-3,0 ay) gibi laboratuvar modeli olarak uygun özellikleri nedeniyle böcek fizyolojisinin ata özelliklerini incelemek için uzun zamandır kullanılmaktadır; Şekil 1A) ve kolay bir üreme. Son otuz yılda, vücut planı, nöral farklılaşma ve sirkadiyen ritimler 2^,3,⁴gibi çeşitli özelliklerin ata özelliklerini araştırmak için kullanımı genişletilmiştir.

T. domestica'da ileri genetik araçların uygulanması, geniş bir araştırma alanında bu tür katkıları daha da hızlandırabilir. Embriyolarda, nimflerde ve yetişkinlerde başarılı RNA paraziti (RNAi)- aracılı gen devrilmesi T. domestica⁴, 5^,6'da bildirilmiştir. Sistemik RNAi'nin verimliliği hala türlere son derece bağımlıdır — örneğin, genellikle coleoptera'da yüksektir, lepidoptera sırasında ise düşüktür⁷. T. domestica'daki RNAi nakavtının etkinliği ve süresi henüz değerlendirilmedi. RNAi'ye ek olarak, daha önce T. domestica^8'debaşarılı bir CRISPR / Cas9 aracılı gen nakavt bildirdik. CRISPR/Cas sistemi, böceklerde genom düzenlemesi için özellikle hedeflenen gen nakavtları için yaygın olarak uygulanmıştır. Kullanımı, CRISPR/ Cas sisteminin bileşenlerini çekirdek^9'ateslim etmek için bir protokol kurulduktan sonra eksojen yapıları devirerek gen muhabiri tahlili, hücre soyu takibi ve transkripsiyonal aktivitenin manipülasyonu gibi diğer uygulamalar için genişletilebilir. Yayınlanan genom derlemesi¹⁰ile birlikte, CRISPR/ Cas tabanlı genom düzenlemenin T. domestica'da geniş kullanımı ve daha da geliştirilmesi, böceklerin olağanüstü adaptif başarısının arkasındaki evrimsel mekanizmalara odaklanan çalışmaları kolaylaştıracaktır. Burada, embriyo mikroenjeksiyonu ve CRISPR/Cas9 kullanarak mutant suşu oluşturmak için yetişkin T. domestica'nın çiftleşmesi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu yeni yöntemi göz önünde bulundurarak, bu tekniklerin başarılı uygulamaları için geleneksel olmayan model türlerinin benzersiz biyolojisini göz önünde bulundurmanın önemini tartışıyoruz.

Protokol

1. Laboratuvar kolonilerinin bakımı

1. Wildtype ve mutant popülasyonlarının bakımı için, düzenli yapay balık maması içeren büyük bir plastik kap (460 mm x 360 mm x 170 mm), üstünde havalandırma deliği bulunan plastik bardaklarda su, böcekleri gizlemek için katlanmış bir kağıt ve yumurta bırakmak için katmanlı pamuk kullanın (Şekil 2A). Tüm T. domestica kültürlerini 37 °C inkübatörlerin içinde tutun ve her kabın içindeki bağıl nemi (RH) %60-%80 olarak ayarlayın.
   NOT: T. domestica atmosferden su buharını emdiği için¹¹, doğrudan su kaynağına gerek yoktur. Uygun RH, üstte havalandırma deliği içeren plastik bardaklardan veya her kabın içindeki kapaksız bardaklardan su buharı bulunması nedeniyle korunur. Kültürleri içeren tüm bir inkübatörün içinde nemlendirmeye gerek yoktur. Bu protokolde açıklanan koşul altındaki her gelişim aşamasının yaklaşık süresi Şekil 1'de gösterilmiştir. Gelişim hızı sıcaklık ve/veya RH¹²değiştirilerek ayarlanabilir.
2. Periyodik olarak yiyecek ekleyin. Kurumadan önce su ekleyin.
3. Yetişkinlerin kirli bir ortamda ve/veya yoğun popülasyonda yumurta bırakmayı bıraktığı göz önüne alındığında, popülasyonları en az 3 ayda bir yeni bir temiz kaba aktarın (bkz. Tartışma).

2. Yumurta toplama ve mikroenjeksiyon

1. Kılavuz RNA (gRNA) tasarlama
   1. Gerekli her hedef için bir gRNA dizisi tasarlayın ve olası hedef dışı tanıma alanlarını kontrol etmek için gRNA dizilerini genom tertibatı ile patlatın.
   2. GRNA'ları üreticinin talimatlarına göre sentezlemek ve arındırmak⁸.
      NOT: Örnek olarak, ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı beyaz geninin hedeflenmesi durumunda, 20 bp hedef dizisi tasarlanmış ve iki sentezlenmiş DNA oligonükleotid 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' ve 5'-TTCTAGCTAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3' sipariş edilmiştir. DNA şablonu, bu iki oligonükleotid ve ardından PCR amplifikasyonu tavlanarak hazırlandı ve gRNA daha sonra şablondan bir T7 RNA polimeraz ile in vitro olarak yazıldı.
2. Yumurta toplama kolonileri hazırlayın
   1. Yaklaşık 20 erkek ve 20 kadın yetişkini yiyecek, su kaynağı, katlanmış kağıt ve yumurtlama için küçük bir katmanlı pamuk parçası ile orta büyüklükteki bir kaba (200 mm x 150 mm x 90 mm) aktarın(Şekil 2B).
   2. Genom düzenleme için kullanılacak kısa bir süre içinde çok sayıda aşamalı embriyo elde etmek için birkaç koloni kurun.
      NOT: 37 °C'de 8 saat sonra bir koloniden yaklaşık 20-40 yumurta toplanması beklenir. Transfer edilen yetişkinlerin, muhtemelen yeni bir ortama adaptasyon nedeniyle yumurta bırakmaya başlamaları genellikle birkaç gün sürer.
3. Enjeksiyon gününde, kapların içindeki pamuğu yenileriyle değiştirin.
4. Normal 76 mm x 26 mm cam kaydırağa 76 mm x 5 mm çift taraflı bant yerleştirin.
5. Sekiz saat sonra, katmanları kümesleri kullanarak ayırarak yumurtaları katmanlı pamuktan toplayın.
6. Yumurtaları ıslak bir boya fırçası kullanarak çift taraflı bantta hizalayın ve yumurtalar arasında 2 mm mesafeyi koruyun. Tüm yumurtalar, bir yumurtanın boyuna ekseni enjeksiyon tarafına bakacak şekilde yönlendirilmelidir (Şekil 3A). Enjeksiyon sırasında sıkıca tutmak için yumurtaları bir boya fırçası ile hafifçe bastırın.
   NOT: Bu protokolde mantar, ıslak ve sıcak durumda hasarlı enjekte edilmiş yumurtalarda hızlı büyür. Çapraz kontaminasyonu ve mantarın genişlemesini önlemek için yumurtalar arasındaki mesafeyi korumak önemlidir.
7. GRNA ve Cas9 proteinini sırasıyla 100 ng/μL ve 500 ng/μL'lik son konsantrasyonda karıştırın. Seyreltme için damıtılmış su kullanın. Ribonucleoprotein kompleks oluşumunu teşvik etmek için karışımı oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından karışımı buzda tutun.
   NOT: Enjekte edilen miktarı izlemek için enjeksiyon çözeltisine % 1 nihai konsantrasyonda nötr kırmızı eklenebilir.
8. GRNA/Cas9 çözeltisinin 2 μL'sini bir mikro doldurucu ile cam enjeksiyon kılcal damarı içine yükleyin. Enjeksiyondan önce çözeltide hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Gerekirse, kabarcıkları çıkarmak için iğneye dokunun.
   NOT: Bu deneyde, ince bir iğne ucu elde etmek için hazır bir iğne kullanılır (Şekil 3B). Bunun yerine benzer şekle sahip ev yapımı bir iğne kullanılabilir.
9. Daha önce gRNA/Cas9 çözeltisi ile yüklenen cam enjeksiyon kılcal damarını manipülatörle donatılmış bir tutucuya sabitleyin ve tutucuyu elektronik bir mikroinjektöre bağlayın.
10. Bir dizi enjeksiyon boyunca tıkanmasını ve daha iyi dayanıklılık elde edilmesini önlemek için iğne ucunun şeklini biraz kırarak optimize edin (Şekil 3C'deuygun bir iğne örneği gösterilmiştir).
    NOT: Bir iğne tıkandığında değiştirilmesi önerilir. Yine tokalarla kırılırsa aynı iğne ile enjekte etmeye devam etmek mümkündür, ancak daha geniş bir uç daha fazla yumurta hasarına yol açar ve hayatta kalma oranını düşürür. T. domestica yumurtaları yumuşak ve kırılgan olduğundan, ince bir iğne ucu tutmak enjeksiyondan sonra yüksek hayatta kalma oranına sahip olmak için anahtardır.
11. İğneyi bir yumurtanın boyuna ekseninin orta noktasına yerleştirin ve çözeltinin hafif bir miktarını enjekte edin (enjeksiyon miktarına referans için Şekil 3D-H'ye bakın). İğne ucunun şekline bağlı olarak enjeksiyon sırasında elektronik mikroenjektörün konfigürasyonunu ayarlayın.
    NOT: Enjeksiyon sırasında sabit bir basınç uygulanması önerilir, aksi takdirde yapışkan yumurta içeriği cam iğneye kolayca akabilir ve tıkayabilir. Çözüm, enjekte edilen sıvı miktarına bağlı olarak kısa bir basınç darbesi veya sabit bir basınçla enjekte etmek olabilir. Bir iğne ucu geniş bir açıklığa sahip olduğunda, bir yumurtaya çok fazla çözelti enjekte edildiğini ve bunun ölümcülliğe neden olduğunu unutmayın (Şekil 3F-H). Bu durumda, sabit basınçla sabit bir sıvı akışı sağlayın, ardından iğneyi bir yumurtaya yerleştirin ve hemen çekin. Çok fazla taşma veya yumurta patlamasına neden olursa, iğneyi değiştirin.
12. Enjekte edilen yumurtaları% 60-80 RH ve 37 ° C ile enjekte edilen yumurta sayısına uygun boyutta bir kapta tutun (<20 yumurta: küçük tabak; >20 yumurta: orta boy kap).

3. Çiftleşme

1. Enjekte edilen yumurtaları periyodik olarak kontrol edin ve mantar büyümesini önlemek için hasarlı yumurtaları tokmaklarla atın (Şekil 3I,J). Bir yumurtada çok fazla mantar yetişmesi durumunda, yumurtanın yüzeyini% 70 EtOH ile temizleyin.
2. Kuluçkadan önce (yumurtlamadan sonra 37 °C'de yaklaşık 10 gün), çift taraflı bandın yüzeyini kaplamak için enjekte edilen yumurtalarla cam kaydırağı talk tozuna batırın. Bu, yumurtadan çıkmış nimflerin istiflenerek önlenmesini önleyecektir. Toz kaplı cam slaytları, böceklerin saklanması için yiyecek, su ve katlanmış bir kağıt içeren orta büyüklükte bir kaba aktarın.
3. Nimfler yumurtadan çıktıktan sonra cam slaytları çıkarın. Yetişkinliğe ulaşana kadar periyodik olarak yiyecek tedarik edin.
   NOT: Bireylerin yumurtadan çıktıktan sonra yetişkinliğe ulaşması yaklaşık 2,0-2,5 ay sürer (Şekil 1A). Yetişkin aşaması kadınlarda iyi gelişmiş bir ovipozitöre göre değerlendirilmektedir (Şekil 1B).
4. Bireyleri çiftleşmek için, bir laboratuvar kolonisinden orta büyüklükteki kaba gerektiği kadar wildtype kadın yetişkin aktarın ve bakir olduklarından emin olmak için 37 ° C'de en az 14 gün kuluçkaya yatırın.
   NOT: Bir laboratuvar kolonisinden bakire dişileri toplamak gerekli değildir, çünkü yetişkin T. domestica"üreme ve kalıplama döngüsü" adı verilen tekrarlanan bir kalıplama ve çiftleşme döngüsüne sahiptir, bu sırada dişiler her eriyikle spermleri atar ve bir sonraki döllenme döngüsünde tekrar çiftleşir¹³.
5. Enjekte edilmiş bir yumurta ve wildtype yetişkin(ler) ile geliştirilen bir erkek veya dişi G0 yetişkinini yiyecek, katlanmış kağıt ve G1 yumurtalarını döşemek için küçük bir pamuk parçası(Şekil 2C'; çiftleşme kabı) ile küçük bir plastik tabağa aktarın. Çiftleşme yemeklerini% 60-% 80 RH (Şekil 2C)ile daha büyük bir kapta tutun.
   NOT: Bire bir eşleştirme ile yüksek başarı oranları elde edilmiş olmasına rağmen, başarılı çiftleşme şansını artırmak için bir yemeğe birden fazla wildtype yetişkin dahil edilebilir.

4. Genotipleme

1. GRNA tarafından hedeflenen siteyi içeren 100-200 bp'lik bir ürünü yükseltmek için her gRNA için PCR astar çiftleri tasarlayın. Özgüllüğünü kontrol etmek için genom tertibatının her astar dizisini PATLATIN (Şekil 4A'da beyaz genin hedeflenmesi için bir örnek gösterilmiştir).
2. G0 yetişkinlerinin mikrop çizgisi dönüşümlerini kontrol edin.
   1. Yumurtalar bırakıldıktan beş gün sonra, her G0 yetişkin çiftinden ayrı G1 yumurtalarını 0,2 mL tüplere toplayın (tüp başına bir yumurta; toplanan örnekleri uzun süreli bir depolama için -20 ° C'de saklayın). Yumurtaları toplamak için pamuk katmanlarını ayırın.
      NOT: Germline iletiminin başarısını değerlendirmek için her çiftleşme çiftinden en az 12 G1 nimf genotiplenmesi önerilir (bkz. Temsili Sonuçlar).
   2. Her tüpe 15 μL 0,25 mg/mL Proteinaz K çözeltisi (Tris-EDTA tamponunda çözünmüş) ekleyin, örnekleri kürdanla kısaca homojenize edin ve 55 °C'de 3 ila 16 saat kuluçkaya yatırın.
   3. Numuneleri 10 dakika boyunca 95 °C'ye yerleştirerek Proteinaz K'yi devre dışı bırak.
   4. Her tüpe 90 μL damıtılmış su ekleyin ve iyice karıştırın. Adım 4.1'de tasarlanan astarları içeren 10 μL PCR reaksiyon karışımında 2 μL süpernatant kullanın.
      NOT: Yeterli PCR amplifikasyonuna ulaşmak için ham şablonlar için optimize edilmiş bir DNA polimerazının kullanılması önerilir.
   5. PCR ürünlerini analiz etmek için mikroçip elektroforez sistemi ile heteroduplex hareketlilik tahlili (HMA) gerçekleştirin (Şekil 3B; bkz. Ohde vd., 2018)⁸.
      NOT: Mutasyonlar iki alternatif yöntemle değerlendirilebilir: (1) %8 poliakrilamid¹⁴gibi standart jel polimerli HMA; (2) T7 endonucleaz ile PCR ürünlerinin sindirimi ve ardından agarose jel elektroforez¹⁵.
   6. Sadece mikroplarında mutasyon içeren G0 yetişkinlerinden kaynaklanan G1 nimflerini saklayın ve diğerlerini atın.
3. G1 nimflerinin/yetişkinlerinin bireysel genotiplemi
   1. G1 nimflerini bir aspiratör veya boya fırçası ile 24 kuyulu plakalarda izole edin. %60–80 RH(Şekil 1D)tutmak için 24 kuyu plakalarını yukarıda açıklandığı gibi su kaynağı olan daha büyük bir kaba (örneğin, bu protokolde kullanılan orta büyüklükteki kap) yerleştirin. Yapay düzenli balık yemi tedarikini koruyun(Şekil 1D').
      NOT: Bu adım nem ve yetişkin aşamalarının herhangi bir noktasında yapılabilmesine rağmen, yetişkinliğe ulaştıktan sonra ve eşleştirmeden hemen önce (enjeksiyondan 2,5 ay sonra) yapılması önerilir; Şekil 1B) çünkü ateş aşındırıcıları büyük bir kapta tutmak daha kolaydır. Aşağıdaki adımlarda her G1 nimfinin genotipini izlemek için bireysel yetiştirme gereklidir. Aynı G0 yetişkininden G1 nimfleri farklı mutasyonlara sahip olabilir.
   2. Cerci ve kaudal filamenti forseps kullanarak bir nimf / yetişkinden kıstırın ve çekin ve 50 μL EtOH içeren 0,2 mL'lik bir tüpe toplayın (toplanan numuneleri uzun süreli bir depolama için -20 ° C'de saklayın).
      NOT: Doku örnekleri EtOH'da toplanır, çünkü statik elektrik nedeniyle bu küçük numunelerin kaybını önler. Böceklerin hareketini durdurması gerekiyorsa, doku örnekleri alırken nemsiz / yetişkini buz üzerinde uyuşturun. T. domestica buz üzerinde uzun süreli soğudktan sonra hayatta kalamayacağından, onları bir dakikadan fazla uyuşturmayın ve hemen oda sıcaklığına geri taşıyın. Cerci ablasyon ve kaudal filament mortalite artışına neden olmaz.
   3. EtOH'u buharlaşmak için kapakları açık olan numune tüplerini 70 °C'de 15 dakika boyunca bir termal blok üzerine yerleştirin.
   4. Genotipleme için 4.2.2–4.2.5 adımlarını yineleyin.
   5. Mutant bant deseninin gözlendiği PCR ürünlerini standart bir Sanger sıralama hizmetine gönderin.
   6. G1 nimflerini/yetişkinlerini istenen mutasyonlarla tutun ve diğerlerini atın (temsili bir sıralama sonucu için Şekil 4C'ye bakın).
4. Bir çiftleşme kabında istenen mutasyonları içeren yetişkinleri geçin ve homozigöz bir mutant suşu oluşturmak için sonraki nesilleri elde edin.

Sonuçlar

Elimizde, yeterli ipucuna sahip olduğunda yaklaşık 100 yumurta tek bir enjeksiyon kılcal damarı ile iyi enjekte edilebilir (Şekil 3C). Yumurtlamadan sonraki ilk 8 saat içinde embriyolarda gRNA/Cas9 ribononiklioprotein kompleksi enjeksiyonu gRNA hedefli bölgede indels ile sonuçlanır. Bu, enjekte edilen neslin (G0) bazı hücrelerinde biallelik mutasyonlara neden olur ve bu nedenle mutant mozaik fenotipleri genellikle G0'de elde edilir. Örneğin, bu protokol beyaz geni hede...

Tartışmalar

CRISPR/Cas9 ile istenen T. domestica mutantının başarılı bir şekilde üretilmesi için öncelikle enjeksiyon için yeterli sayıda aşamalı embriyo toplanması önemlidir. Yeterli sayıda T. domestica yumurtasının sürekli toplanması için anahtar, daha düşük bir nüfus yoğunluğuna sahip olmak için kabın uygun bir boyutunu seçmektir, çünkü her yetişkin eriyikten sonra tekrarlanan bir dizi karmaşık çiftleşme davranışının başarılı bir şekilde tamamlanmasına yardımcı ol...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg	Integrated DNA Technologies	1081060
Anti-static cleaner	Hozan	Z-292	for removing static electricity from a 24-well plate
Barrier Box 20.7L	AS ONE	4-5606-01	Large container
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000013	Electronic microinjector
Femtotip II, injection capillary	Eppendorf	5242957000	Glass injection capillary
High Pack 2440mL	AS ONE	5-068-25	Middle-sized container
Incubator	Panasonic	MIR-554-PJ	for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator.
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.
Magnetic stand	Narishige	GJ-8	for holding the micromanipulator
Microloader	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MM-3
Microscope	Olympus	SZX12	for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
MultiNA	Shimadzu	MCE-202	Microchip electrophoresis system
NiceTac	Nichiban	NW-5	Double-sided tape to place eggs on a glass slide
Paint brush (horse hair)	Pentel	ZBS1-0
Plant culture dish	SPL Life Sciences	310100	Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris	Roche	3115836001
SZX 12 microscope	Olympus	SZX 12	More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
Talcum powder	Maruishi	877113
Tetra Goldfish Gold Growth	Spectrum Brands		Artificial regular fish food