Яйцо Микроинъекции и эффективного спаривания для редактирования генома в Firebrat Thermobia domestica

Резюме

Мы предоставляем подробный протокол для выращивания, микроинъекции яиц и для эффективного спаривания firebrat Thermobia domestica для генерации и поддержания штаммов мутантов после редактирования генома.

Аннотация

Firebrat Thermobia domestica является аметаболическим, бескрылым видом, который подходит для изучения механизмов развития насекомых, которые привели к их успешному эволюционному излучению на Земле. Применение генетических инструментов, таких как редактирование генома, является ключом к пониманию генетических изменений, которые отвечают за эволюционные переходы в подходе Эво-Дево. В этой статье мы описываем наш текущий протокол для генерации и поддержания мутантных штаммов T. domestica. Мы сообщаем о сухом методе инъекций, в качестве альтернативы зарегистрированного метода мокрой инъекции, который позволяет нам получить невероятно высокие показатели выживаемости в инъекционных эмбрионах. Мы также сообщаем об оптимизированной среде для спаривания взрослых и получения последующих поколений с высокой эффективностью. Наш метод подчеркивает важность учета уникальной биологии каждого вида для успешного применения методов редактирования генома для нетрадиционных модельных организмов. Мы прогнозируем, что эти протоколы редактирования генома помогут реализовать T. domestica в качестве лабораторной модели и еще больше ускорить разработку и применение полезных генетических инструментов в этом виде.

Введение

Thermobia domestica принадлежит к одному из самых базальных заказов насекомых, Зигентоме, который сохраняет предков аметаболический и бескрылый жизненный цикл. Такое базальное филогенетическое положение и родовые характеристики устанавливают этот вид в качестве привлекательной модели для изучения механизмов, лежащих в основе успеха насекомых на Земле, которые охватывают более 70% описанных видов животных¹. T. domestica уже давно используется главным образом для изучения родовых характеристик физиологии насекомых из-за его подходящих особенностей в качестве лабораторной модели, таких как относительно короткий жизненный цикл (2,5-3,0 месяца от эмбриона до репродуктивного взрослого; Рисунок 1A) и легкое разведение. В последние три десятилетия, его использование было расширено для изучения родовых характеристик различных черт, таких как план тела, нейронной дифференциации, и^{циркадные ритмы 2,3,4}.

Применение передовых генетических инструментов в T. domestica могло бы еще больше ускорить такой вклад в широкую область исследований. Успешное РНК-интерференция (РНК) - опосредованное нокдаун гена в эмбрионах, нимфах и взрослых было сообщено в T. domestica^4,5,6. Эффективность системных РНК по-прежнему сильно зависит от видов, например, она, как правило, высока в coleoptera в то время как она низка в порядке lepidoptera⁷. Эффективность и продолжительность нокдауна РНК в T. domestica еще предстоит оценить. В дополнение к РНК, мы ранее сообщали об успешном CRISPR/ Cas9-опосредованном генном нокауте в T. domestica⁸. Система CRISPR/Cas широко применяется для редактирования генома у насекомых, особенно для целевого генного нокаута. Его использование может быть расширено для других приложений, таких как анализ генного репортера, отслеживание клеточной линии и манипуляции транскрипционные действия путем стучать в экзогенных^{конструкций после}создания протокола для доставки компонентов системы CRISPR / Cas в ядра 9 . В сочетании с опубликованной^{сборки генома 10}, широкое использование и дальнейшее развитие CRISPR / Cas основе редактирования генома в T. domestica будет способствовать исследованиям упором на эволюционные механизмы за выдающийся адаптивный успех насекомых. Здесь мы описываем подробный протокол микроинъекции эмбриона и для спаривания взрослого T. domestica для генерации штамма мутантов с помощью CRISPR/Cas9. Рассматривая этот новый метод, мы обсуждаем важность рассмотрения уникальной биологии нетрадиционных видов моделей для успешного применения этих методов.

протокол

1. Обслуживание лабораторных колоний

1. Для поддержания популяций диких животных и мутантов используйте большой пластиковый контейнер (460 мм х 360 мм х 170 мм) с обычной искусственной рыбной пищей, воду в пластиковых стаканчиках с вентиляционным отверстием сверху, сложенную бумагу для укрытия насекомых и многослойный хлопок дляоткладки яиц (рисунок 2А). Храните все культуры T. domestica внутри инкубаторов по 37 градусов по Цельсию и установите относительную влажность (RH) внутри каждого контейнера до 60%-80%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что T. domestica поглощает водяной пар из^{атмосферы 11}, прямое водоснабжение не требуется. Соответствующий RH поддерживается из-за наличия водяного пара из пластиковых стаканчиков, содержащих вентиляционное отверстие на верхней или из чашки без крышки внутри каждого контейнера. Нет необходимости увлажнять внутри целого инкубатора, который содержит культуры. Примерная продолжительность каждого этапа развития при условии, описанное в этом протоколе, показана на рисунке 1. Скорость развития может быть скорректирована путем изменения температуры и / или RH¹².
2. Периодически добавляем пищу. Добавить воду, прежде чем она высохт.
3. Перевод населения в новый чистый контейнер по крайней мере каждые 3 месяца, учитывая, что взрослые перестают откладывать яйца в грязной среде и / или плотной популяции (см. Обсуждение).

2. Сбор яиц и микроинъекция

1. Разработка руководства РНК (gRNA)
   1. Разработать последовательность gRNA для каждой требуемой цели и BLAST последовательности гРНК против сборки генома, чтобы проверить возможные внецелегового распознавания сайтов.
   2. Синтезировать и очищать РНК в соответствии с инструкциями производителя⁸.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера, в случае ориентации АТФ-связывающий кассетный транспортер белый ген, 20 bp целевая последовательность была разработана и два синтезированных ДНК олигонуклеотидов 5'-TAATACGACTACTATAGTGTGTGGGAC-3' и 5'-TTCTAGCTCTAAAATCTCCCAACACTTA-3' были заказаны. Шаблон ДНК был подготовлен путем аннальизации этих двух олигонуклеотидов с последующим усилением ПЦР, а затем в пробирке транскрибируется из шаблона с полимеразой T7 РНК.
2. Подготовка колоний сбора яиц
   1. Перенесите около 20 взрослых мужчин и 20 самок в контейнер среднего размера (200 мм х 150 мм х 90 мм) с пищей, водоснабжением, сложенной бумагой и небольшим кусочком многослойного хлопка для укладки яиц(рисунок 2B).
   2. Настройка нескольких колоний для получения большого количества постановочных эмбрионов в течение короткого периода времени, которые будут использоваться для редактирования генома.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Около 20-40 яиц, как ожидается, будут собраны из колонии после 8 ч при 37 градусов по Цельсию. Это обычно занимает несколько дней для перенесенных взрослых, чтобы начать откладывать яйца, возможно, из-за адаптации к новой среде.
3. В день инъекции замените хлопок внутри контейнеров новыми.
4. Поместите двустороннюю ленту диаметром 76 мм х 5 мм на обычную стеклянную горку диаметром 76 мм х 26 мм.
5. Восемь часов спустя, собирать яйца из многослойного хлопка, отделяя слои с помощью типсов.
6. Выровнять яйца на двустороннюю ленту с помощью мокрой кисти краски и держать 2 мм расстояние между яйцами. Все яйца должны быть ориентированы таким образом, чтобы продольная ось яйца столкнулась с инъекционной стороной(рисунок 3A). Аккуратно нажмите яйца с кистью краски для твердого проведения во время инъекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, гриб быстро растет в поврежденных инъекционных яиц под влажным и теплым состоянием. Важно держать расстояние между яйцами, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение и расширение гриба.
7. Смешайте белок гРНК и Cas9 с окончательной концентрацией 100 нг/йл и 500 нг/мл, соответственно. Используйте дистиллированную воду для разбавления. Инкубировать смесь в течение 10 минут при комнатной температуре для содействия рибонуклеопротеин комплексного образования, а затем сохранить смесь на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нейтральный красный при 1% конечной концентрации может быть добавлен в раствор инъекции для мониторинга вводимого количества.
8. Загрузите 2 МКЛ раствора gRNA/Cas9 в стеклянный инъекционный капилляр с микрозагрузчиком. Убедитесь, что перед инъекцией в растворе нет пузырьков воздуха. При необходимости коснитесь иглы, чтобы удалить пузырьки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, готовая игла используется для получения тонкой иглы наконечник (Рисунок 3B). Вместо этого можно использовать самодельную иглу аналогичной формы.
9. Зафиксните капилляр для впрыска стекла, ранее загруженный раствором gRNA/Cas9, к держателю, оснащенного манипулятором, и подключите держатель к электронному микроинъектору.
10. Оптимизируйте форму кончика иглы, слегка сломав его типсами, чтобы предотвратить засорение и лучшую долговечность в течение серии инъекций (пример соответствующей иглы показан на рисунке 3C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется менять иглу, когда она забита. Можно продолжать вводить с той же иглой, если она сломана снова с типсами, но более широкий кончик приводит к более повреждения яйца и снижает их выживаемость. Как T. Domestica яйца мягкие и хрупкие, сохраняя тонкий кончик иглы является ключевым для того, чтобы иметь высокую выживаемость после инъекции.
11. Вставьте иглу в середине продольной оси яйца и ввините небольшое количество раствора (см. Рисунок 3D-H для справки о количестве инъекций). Отрегулируйте конфигурацию электронного микроинъектора во время инъекции, в зависимости от формы кончика иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется применять постоянное давление во время инъекций, в противном случае липкое содержимое яйца может легко поступать в стеклянную иглу и может засорить его. Решение может быть либо вводить с коротким импульсом давления или с постоянным давлением, в зависимости от количества жидкости вводят. Имейте в виду, что, когда кончик иглы имеет широкое отверстие, слишком много раствора вводится в яйцо, которое вызывает летальность (Рисунок 3F-H). В этом случае, поддерживать постоянный поток жидкости при постоянном давлении, а затем вставить иглу в яйцо и вытащить его немедленно. Если это вызывает слишком много переполнения или яйцо очередей, изменить иглу.
12. Храните инъекционные яйца в контейнере с соответствующим размером для количества инъекционных яиц (20 яиц: маленькое блюдо; 20 яиц: контейнер среднего размера) с 60%-80% RH и 37 C.

3. Спаривание

1. Периодически проверяйте инъекционные яйца и выбрасывайте поврежденные яйца типсами, чтобы избежать грибкового роста(рисунок 3I,J). В случае, если слишком много гриба растет на яйцо, очистить поверхность яйца с 70% EtOH.
2. Перед вылуплением (примерно через 10 дней при 37 градусов по Цельсию после откладки яиц) окуните стеклянную горку с вводимыми яйцами в тальк, чтобы покрыть поверхность односторонней ленты. Это позволит избежать укладки вылупившихся нимф. Перенесите стеклянные горки с порошковым покрытием в контейнер среднего размера с пищей, водой и сложенной бумагой для укрытия насекомых.
3. Удалите стеклянные горки после того, как нимфы вылупились. Периодически снабжать продовольствием до достижения ими совершеннолетия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это занимает около 2,0-2,5 месяцев для людей, чтобы достичь совершеннолетия после того, как они люк (Рисунок 1A). Взрослая стадия судят на основе хорошо развитого овипозитора у женщин(рисунок 1B).
4. Чтобы спаривать особей, перенесите столько, сколько необходимо взрослым самкам дикого типа из лабораторной колонии, в контейнер среднего размера и инкубировать их в течение по крайней мере 14 дней при 37 градусов по Цельсию, чтобы убедиться, что они девственницы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это не обязательно собирать девственных женщин из лабораторной колонии, потому что взрослый T. domestica имеют повторный цикл линьки и спаривания называется "репродуктивный и линьки цикла", в ходе которого женщины выбросить сперму с каждой линьки и спариваться снова в следующем цикле^{оплодотворения 13}.
5. Передача либо мужского, либо женского G0 взрослого, который превратился из инъекций яйца и wildtype взрослых (ы) в небольшой пластиковой тарелке (100 мм х 40 мм) с пищей, сложенная бумага, и небольшой кусок хлопка для откладки яиц G1 (Рисунок 2C'; спаривание блюдо). Держите спаривания блюда в большем контейнере с 60%-80% RH (Рисунок 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько взрослых wildtype могут быть включены в блюдо, чтобы увеличить шансы на успешное спаривание, хотя высокие показатели успеха были достигнуты с один-к-одному спаривания.

4. Генотипирование

1. Дизайн ПЦР грунтовка пары для каждой гРНК, чтобы усилить 100-200 bp продукт, который включает в себя сайт, ориентированный на gRNA. BLAST каждой последовательности грунтовки против сборки генома, чтобы проверить его специфичность (пример показан для ориентации белого гена на рисунке 4A).
2. Проверьте преобразование зародышевой линии взрослых G0.
   1. Через пять дней после того, как яйца откладываются, соберите отдельные яйца G1 из каждой взрослой пары G0 в трубки объемом 0,2 мл (одно яйцо на трубку; храните собранные образцы при -20 градусах цельсия для длительного хранения). Отделить хлопчатобумажные слои для сбора яиц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется генотип по крайней мере 12 G1 нимфы из каждой пары спаривания для оценки успеха передачи зародышевой (см. Представитель Результаты).
   2. Добавьте 15 л раствора протеиназы K 0,25 мг/мл (растворенный в буфере Tris-EDTA) к каждой трубке, кратко гомогенизируйте образцы зубочисткой и инкубируйте при 55 градусах по Цельсию на 3-16 ч.
   3. Инактивировать Proteinase K, поместив образцы на 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
   4. Добавьте 90 мкл дистиллированной воды в каждую трубку и хорошо перемешайте. Используйте 2 МКЛ супернатанта в смеси реакции ПЦР 10 йл, содержащей грунтовки, разработанные в шаге 4.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование полимеразы ДНК, оптимизированной для грубых шаблонов, рекомендуется для достижения достаточного усиления ПЦР.
   5. Для анализа продуктов ПЦР выполните анализ мобильности гететеродуплекса (HMA) с помощью системы электрофореза микрочипа(рисунок 3B;см. Ohde et al., 2018)⁸.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мутации могут быть оценены двумя альтернативными методами: (1) HMA со стандартными полимерами геля, такими как 8% полиакриламид^14; (2) переваривание продуктов ПЦР с эндонуклеазой T7 с последующим электрофорезом агарозного^{геля 15}.
   6. Храните только G1 нимфы в результате G0 взрослых, которые содержат мутации в их зародышевой линии и отказаться от других.
3. Индивидуальный генотипирование нимф G1/взрослых
   1. Изолировать G1 нимфы в 24-хорошо пластин с аспиратором или кистью краски. Поместите 24-ну пластины в больший контейнер (например, среднего размера контейнер, используемый в этом протоколе) с водоснабжением, как описано выше, чтобы сохранить RH 60% -80% (Рисунок 1D). Поддержание поставок искусственной обычной рыбной пищи(рисунок 1D').
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя этот шаг может быть выполнен в любой точке нимфальной и взрослой стадии, рекомендуется выполнять его после достижения совершеннолетия и незадолго до спаривания (nogt;2.5 месяцев после инъекции; Рисунок 1B) потому что легче поддерживать firebrats в большом контейнере. Индивидуальное воспитание требуется для отслеживания генотипа каждой нимфы G1 на следующих шагах. Нимфы G1 от одного и того же взрослого G0 могут иметь различные мутации.
   2. Pinch и тянуть cerci и хвостовой нити из нимфы / взрослых с помощью щипцов и собирать их в 0,2 мл трубки, содержащей 50 йл EtOH (хранить собранные образцы при -20 градусов по Цельсию для длительного хранения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы тканей собираются в EtOH, потому что это предотвращает потерю этих небольших образцов из-за статического электричества. Если нужно остановить движение насекомых, анестезировать нимфу / взрослых на льду при приеме образцов тканей. Поскольку T. domestica не может выжить после длительного охлаждения на льду, не обезболивать их более минуты и немедленно переместить их обратно к комнатной температуре. Абляция cerci и каудальной нити не вызывает увеличения смертности.
   3. Поместите пробные трубки с открытыми крышками на тепловой блок в течение 15 минут при 70 градусов по Цельсию, чтобы испарять EtOH.
   4. Повторите шаги 4.2.2-4.2.5 для генотипирования.
   5. Отправить продукты PCR, в которых шаблон мутантной полосы наблюдается в стандартную службу последовательности Sanger.
   6. Держите нимф G1 /взрослых с желаемыми мутациями и отбросьте остальные (см. рисунок 4C для репрезентативного результата последовательности).
4. Пересеките взрослых, содержащих желаемые мутации в спаривания блюдо и получить следующие поколения, чтобы установить гомозиготный штамм мутантов.

Результаты

В наших руках, около 100 яиц могут быть хорошо введены с одной инъекции капилляров, когда он имеет адекватный кончик(рисунок 3C). Инъекция гРНК/Cas9 рибонуклеопротеин комплекса в эмбрионах в течение первых 8 ч после откладки яйцеклеток приводит к indels на gRNA целевого сайта. Это ?...

Обсуждение

Для успешного поколения желаемого T. domestica мутант с CRISPR/Cas9, в первую очередь важно собрать достаточное количество постановочных эмбрионов для инъекций. Для постоянного сбора достаточного количества яиц T. domestica, ключ должен выбрать соответствующий размер контейнера, чтобы имет...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg	Integrated DNA Technologies	1081060
Anti-static cleaner	Hozan	Z-292	for removing static electricity from a 24-well plate
Barrier Box 20.7L	AS ONE	4-5606-01	Large container
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000013	Electronic microinjector
Femtotip II, injection capillary	Eppendorf	5242957000	Glass injection capillary
High Pack 2440mL	AS ONE	5-068-25	Middle-sized container
Incubator	Panasonic	MIR-554-PJ	for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator.
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.
Magnetic stand	Narishige	GJ-8	for holding the micromanipulator
Microloader	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MM-3
Microscope	Olympus	SZX12	for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
MultiNA	Shimadzu	MCE-202	Microchip electrophoresis system
NiceTac	Nichiban	NW-5	Double-sided tape to place eggs on a glass slide
Paint brush (horse hair)	Pentel	ZBS1-0
Plant culture dish	SPL Life Sciences	310100	Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris	Roche	3115836001
SZX 12 microscope	Olympus	SZX 12	More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
Talcum powder	Maruishi	877113
Tetra Goldfish Gold Growth	Spectrum Brands		Artificial regular fish food