Microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per l'editing genomico nella Termbia domestica Firebrat

Riepilogo

Forniamo un protocollo dettagliato per l'allevamento, la microiniezione delle uova e per l'accoppiamento efficiente del firebrat Thermobia domestica per generare e mantenere ceppi mutanti dopo l'editing del genoma.

Abstract

Il firebrat Thermobia domestica è una specie ametabolica e senza ali adatta allo studio dei meccanismi di sviluppo degli insetti che hanno portato alla loro riuscita radiazione evolutiva sulla terra. L'applicazione di strumenti genetici come l'editing del genoma è la chiave per comprendere i cambiamenti genetici che sono responsabili delle transizioni evolutive in un approccio Evo-Devo. In questo articolo, descriviamo il nostro attuale protocollo per la generazione e la manutenzione di ceppi mutanti di T. domestica. Riportiamo un metodo di iniezione secca, in alternativa al metodo di iniezione umida riportato, che ci consente di ottenere tassi di sopravvivenza stabilmente elevati negli embrioni iniettati. Reportiamo anche un ambiente ottimizzato per accoppiare gli adulti e ottenere le generazioni successive con alta efficienza. Il nostro metodo sottolinea l'importanza di tenere conto della biologia unica di ciascuna specie per il successo dell'applicazione dei metodi di modifica del genoma agli organismi modello non tradizionali. Prevediamo che questi protocolli di editing del genoma aiuteranno nell'implementazione di T. domestica come modello di laboratorio e accelereranno ulteriormente lo sviluppo e l'applicazione di strumenti genetici utili in questa specie.

Introduzione

Thermobia domestica appartiene a uno degli ordini di insetti più basali, Zygentoma, che conserva un ciclo di vita ancestrale ametabolico e senza ali. Tale posizione filogenetica basale e caratteristiche ancestrali hanno fissato questa specie come un modello attraente per studiare i meccanismi alla base del successo degli insetti sulla Terra, che coprono oltre il 70% della specie animale^{descritta 1}. T. domestica è stato a lungo utilizzato principalmente per studiare le caratteristiche ancestrali della fisiologia degli insetti a causa delle sue caratteristiche adatte come modello di laboratorio, come un ciclo di vita relativamente breve (2,5-3,0 mesi dall'embrione all'adulto riproduttivo; Figura 1A) e un allevamento facile. Negli ultimi tre decenni, il suo uso è stato ampliato per indagare le caratteristiche ancestrali di vari tratti come la pianta corporea, la differenziazione neurale e i ritmi^{circadiani 2,3,4}.

L'applicazione di strumenti genetici avanzati in T. domestica potrebbe accelerare ulteriormente tali contributi in un'ampia area di ricerca. Il successo dell'interferenza dell'RNA (RNAi) mediato dal gene in embrioni, ninfe e adulti è stato riportato in T. domestica^4,5,6. L'efficienza della RNAi sistemica è ancora altamente dipendente dalle specie, ad esempio è generalmente elevata nei coleotteri mentre è bassa nell'ordine dei lepidotteri⁷. L'efficienza e la durata del knockdown RNAi in T. domestica devono ancora essere valutate. Oltre a RNAi, abbiamo precedentemente segnalato un knockout genico mediato da CRISPR / Cas9 di successo in T. domestica⁸. Il sistema CRISPR/Cas è stato ampiamente applicato per l'editing del genoma negli insetti, in particolare per il knockout genico mirato. Il suo uso potrebbe essere ampliato per altre applicazioni come il test gene reporter, il tracciamento del lignaggio cellulare e la manipolazione dell'attività trascrizionale bussando a costrutti esogeni dopo l'istituzione di un protocollo per la consegna di componenti del sistema CRISPR / Cas nei nuclei⁹. In combinazione con l'assemblaggio del genoma^{pubblicato 10}, l'ampio utilizzo e l'ulteriore sviluppo dell'editing del genoma basato su CRISPR /Cas in T. domestica faciliterebbero gli studi incentrati sui meccanismi evolutivi alla base dell'eccezionale successo adattivo degli insetti. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la microiniezione embrionale e per l'accoppiamento di T. domestica adulto per generare un ceppo mutante utilizzando CRISPR / Cas9. Considerando questo nuovo metodo, discutiamo l'importanza di considerare la biologia unica delle specie modello non tradizionali per applicazioni di successo di queste tecniche.

Protocollo

1. Mantenimento delle colonie di laboratorio

1. Per il mantenimento di popolazioni di wildtype e mutanti, utilizzare un grande contenitore di plastica (460 mm x 360 mm x 170 mm) con cibo di pesce artificiale regolare, acqua in tazze di plastica con un foro di ventilazione sulla parte superiore, una carta piegata per nascondere gli insetti e cotone stratificato per la deposizione delle uova(Figura 2A). Mantenere tutte le colture T. domestica all'interno di incubatori a 37 °C e impostare l'umidità relativa (RH) all'interno di ciascun contenitore sul 60%-80%.
   NOTA: Poiché T. domestica assorbe il vapore acqueo dall'atmosfera¹¹, non è necessario un approvvigionamento idrico diretto. L'rh appropriato viene mantenuto a causa della presenza di vapore acqueo da tazze di plastica contenenti un foro di ventilazione sulla parte superiore o da tazze senza coperchio all'interno di ogni contenitore. Non è necessario umidificare all'interno di un intero incubatore che contiene colture. La durata approssimativa di ogni fase di sviluppo alle condizioni descritte nel presente protocollo è illustrata nella figura 1. La velocità di sviluppo potrebbe essere regolata modificando la temperatura e/o RH^12.
2. Aggiungere periodicamente del cibo. Aggiungere acqua prima che si aserti.
3. Trasferire le popolazioni in un nuovo contenitore pulito almeno ogni 3 mesi, dato che gli adulti smettono di deporre le uova in un ambiente sporco e/o in una popolazione densa (cfr. discussione).

2. Raccolta delle uova e microiniezione

1. Progettare un RNA guida (gRNA)
   1. Progettare una sequenza di gRNA per ogni bersaglio richiesto e FAR ESPLODERE le sequenze di gRNA rispetto all'assemblaggio del genoma per controllare possibili siti di riconoscimento fuori bersaglio.
   2. Sintetizzare e purificare i gRNA secondo le istruzioni del produttore⁸.
      NOTA: Ad esempio, nel caso del gene bianco del trasportatore di cassette legante ATP, è stata progettata una sequenza target di 20 bp e sono stati ordinati due oligonucleotidi del DNA sintetizzati 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' e 5'-TTCTAGCTAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3'. Il modello di DNA è stato preparato ricotturando questi due oligonucleotidi seguiti dall'amplificazione PCR e il gRNA viene quindi trascritto in vitro dal modello con una T7 RNA polimerasi.
2. Preparare colonie di raccolta delle uova
   1. Trasferire circa 20 adulti maschi e 20 femmine in un contenitore di medie dimensioni (200 mm x 150 mm x 90 mm) con cibo, approvvigionamento idrico, una carta piegata e un piccolo pezzo di cotone stratificato per la deposizione delle uova(Figura 2B).
   2. Creare diverse colonie per ottenere un gran numero di embrioni messi in scena in un breve periodo di tempo da utilizzare per l'editing del genoma.
      NOTA: Si prevede che circa 20-40 uova saranno raccolte da una colonia dopo 8 ore a 37 °C. Di solito ci vogliono alcuni giorni perché gli adulti trasferiti inizino a deporre le uova, probabilmente a causa dell'adattamento a un nuovo ambiente.
3. Il giorno dell'iniezione, sostituire il cotone all'interno dei contenitori con quelli nuovi.
4. Posizionare un nastro 76 mm x 5 mm su un normale scivolo di vetro da 76 mm x 26 mm.
5. Otto ore dopo, raccogli le uova dal cotone stratificato separando gli strati usando le forcep.
6. Allineare le uova sul nastro a doppia parte utilizzando un pennello bagnato e mantenere una distanza di 2 mm tra le uova. Tutte le uova devono essere orientate in modo che l'asse longitudinale di un uovo sia fronte al lato dell'iniezione(figura 3A). Premere delicatamente le uova con un pennello per una tenuta ferma durante l'iniezione.
   NOTA: In questo protocollo, il fungo cresce velocemente nelle uova iniettate danneggiate in condizioni umide e calde. È importante mantenere la distanza tra le uova per prevenire la contaminazione incrociata e l'espansione del fungo.
7. Mescolare la proteina gRNA e Cas9 con una concentrazione finale rispettivamente di 100 ng/μL e 500 ng/μL. Utilizzare acqua distillata per la diluizione. Incubare il mix per 10 minuti a temperatura ambiente per promuovere la formazione complessa di ribonucleoproteina e quindi mantenere il mix sul ghiaccio.
   NOTA: Il rosso neutro a una concentrazione finale dell'1% potrebbe essere aggiunto alla soluzione di iniezione per monitorare la quantità iniettata.
8. Caricare 2 μL della soluzione gRNA/Cas9 in un capillare di iniezione di vetro con un microloader. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella soluzione prima dell'iniezione. Se necessario, toccare l'ago per rimuovere le bolle.
   NOTA: In questo esperimento viene utilizzato un ago già pronto per ottenere una punta dell'ago fine (Figura 3B). Un ago fatto in casa con una forma simile potrebbe invece essere usato.
9. Fissare il capillare di iniezione di vetro, precedentemente caricato con la soluzione gRNA/Cas9, a un supporto dotato di manipolatore e collegare il supporto a un microiniettore elettronico.
10. Ottimizzare la forma della punta dell'ago rompendola leggermente con pini per evitare l'intasamento e ottenere una migliore durata durante una serie di iniezioni (un esempio di ago appropriato è mostrato nella figura 3C).
    NOTA: Si consiglia di cambiare un ago quando è intasato. È possibile continuare a iniettare con lo stesso ago se viene rotto di nuovo con pini, ma una punta più ampia porta a più danni alle uova e abbassa il loro tasso di sopravvivenza. Poiché le uova T. domestica sono morbide e fragili, mantenere una punta dell'ago fine è la chiave per avere un alto tasso di sopravvivenza dopo l'iniezione.
11. Inserire l'ago nel punto centrale dell'asse longitudinale di un uovo e iniettare una leggera quantità della soluzione (vedere figura 3D-H per riferimento sulla quantità di iniezione). Regolare la configurazione del microiniettore elettronico durante l'iniezione, a seconda della forma della punta dell'ago.
    NOTA: Si consiglia di applicare una pressione costante durante l'iniezione, altrimenti il contenuto di uova appiccicoso può facilmente fluire nell'ago di vetro e può ostruirlo. La soluzione può essere iniettare un impulso di pressione breve o con una pressione costante, a seconda della quantità di liquido iniettato. Tenere presente che quando una punta dell'ago ha un'ampia apertura, inietta troppa soluzione in un uovo, il che causa letalità (Figura 3F-H). In tal caso, mantenere un flusso liquido costante a pressione costante, quindi inserire l'ago in un uovo ed estrarlo immediatamente. Se provoca troppo overflow o l'uovo esplode, cambiare l'ago.
12. Conservare le uova iniettate in un contenitore con le dimensioni appropriate per il numero di uova iniettate (<20 uova: piccolo piatto; >20 uova: contenitore di medie dimensioni) con 60%-80% RH e 37 °C.

3. Accoppiamento

1. Controllare periodicamente le uova iniettate e scartare le uova danneggiate con forcep per evitare la crescita fungina(Figura 3I,J). Nel caso in cui troppo fungo cresce su un uovo, pulire la superficie dell'uovo con il 70% di EtOH.
2. Prima della schiusa (circa 10 giorni a 37 °C dopo la deposizione delle uova), immergere lo scivolo di vetro con le uova iniettate in polvere di talco per rivestire la superficie del nastro a doppia mano. Ciò eviterà l'impilamento di ninfe tratteggiate. Trasferisci i vetri rivestiti di polvere in un contenitore di medie dimensioni con cibo, acqua e una carta piegata per nascondere gli insetti.
3. Rimuovere gli scivoli di vetro dopo che le ninfe si sono schiuse. Fornire periodicamente cibo fino a raggiungere l'età adulta.
   NOTA: Ci vogliono circa 2,0-2,5 mesi perché gli individui raggiungano l'età adulta dopo la schiusa (Figura 1A). Lo stadio adulto è giudicato sulla base di un ovopositore ben sviluppato nelle femmine (Figura 1B).
4. Per accoppiare gli individui, trasferire tutte le adulti femmine di tipo selvatico necessarie da una colonia di laboratorio al contenitore di medie dimensioni e incubarle per almeno 14 giorni a 37 °C per assicurarsi che siano vergini.
   NOTA: Non è necessario raccogliere femmine vergini da una colonia di laboratorio perché l'adulto T. domestica ha un ciclo ripetuto di muta e accoppiamento chiamato "ciclo riproduttivo e muta", durante il quale le femmine gettano via lo sperma con ogni muta e si accoppiano di nuovo nel prossimo ciclo di fecondazione¹³.
5. Trasferire un maschio o una femmina G0 adulto che si è sviluppato da un uovo iniettato e adulto di tipo selvatico a un piccolo piatto di plastica (Ø 100 mm x 40 mm) con cibo, una carta piegata e un piccolo pezzo di cotone per la deposizione delle uova G1(Figura 2C'; piatto di accoppiamento). Conservare i piatti di accoppiamento in un contenitore più grande con 60%-80% RH (Figura 2C).
   NOTA: Più adulti di tipo selvatico possono essere inclusi in un piatto per aumentare le possibilità di accoppiamento di successo, anche se sono stati raggiunti alti tassi di successo con l'accoppiamento uno a uno.

4. Genotipizzazione

1. Progetta coppie di primer PCR per ogni gRNA per amplificare un prodotto da 100 a 200 bp che include il sito preso di mira dal gRNA. BLAST ogni sequenza di primer rispetto all'assemblaggio del genoma per verificarne la specificità (un esempio è mostrato per il targeting del gene bianco nella figura 4A).
2. Controlla la trasformazione germinale degli adulti G0.
   1. Cinque giorni dopo la deposizione delle uova, raccogliere singole uova G1 da ogni coppia adulta G0 in tubi da 0,2 ml (un uovo per tubo; conservare campioni raccolti a -20 °C per una conservazione a lungo termine). Separare gli strati di cotone per raccogliere le uova.
      NOTA: Si consiglia di genotipare almeno 12 ninfe G1 da ogni coppia di accoppiamenti per valutare il successo della trasmissione della linea germinale (vedi Risultati rappresentativi).
   2. Aggiungere 15 μL di una soluzione di Proteinasi K da 0,25 mg/mL (sciolta nel tampone Tris-EDTA) a ciascun tubo, omogeneizzare brevemente i campioni con stuzzicadenti e incubare a 55 °C per 3-16 ore.
   3. Inattivare la Proteinasi K posizionando i campioni a 95 °C per 10 min.
   4. Aggiungere 90 μL di acqua distillata ad ogni tubo e mescolare bene. Utilizzare 2 μL di supernatante in una miscela di reazione PCR da 10 μL contenente i primer progettati nella fase 4.1.
      NOTA: Si consiglia l'uso di una DNA polimerasi ottimizzata per i modelli grezzi per raggiungere un'amplificazione PCR sufficiente.
   5. Per analizzare i prodotti PCR, eseguire un saggio di mobilità eteroduplex (HMA) con un sistema di elettroforesi a microchip(Figura 3B;vedi Ohde et al., 2018)⁸.
      NOTA: Le mutazioni potrebbero essere valutate con due metodi alternativi: (1) HMA con polimeri gel standard, come l'8% di poliacrilammide^14; (2) digestione di prodotti PCR con endonucleasi T7 seguita da elettroforesi del gel di agarosio¹⁵.
   6. Conservare solo le ninfe G1 risultanti da adulti G0 che contengono mutazioni nella loro linea germinale e scartare le altre.
3. Genotipizzazione individuale di ninfe/adulti G1
   1. Isolare le ninfe G1 in piastre da 24 po 'con un aspiratore o un pennello. Posizionare le piastre a 24 pomp poggiamenti in un contenitore più grande (ad esempio, il contenitore di medie dimensioni utilizzato in questo protocollo) con l'approvvigionamento idrico come descritto sopra per mantenere un RH del 60%-80%(Figura 1D). Mantenere l'approvvigionamento di alimenti artificiali regolari a base dipesce (figura 1D').
      NOTA: Sebbene questo passaggio possa essere eseguito in qualsiasi punto delle fasi ninfee e adulte, si consiglia di eseguito dopo aver raggiunto l'età adulta e poco prima dell'accoppiamento (>2,5 mesi dopo l'iniezione; Figura 1B) perché è più facile mantenere i vigili del fuoco in un grande contenitore. L'allevamento individuale è necessario per tracciare il genotipo di ogni ninfa G1 nei seguenti passaggi. Le ninfe G1 dello stesso adulto G0 possono avere mutazioni diverse.
   2. Pizzicare e estrarre i cerci e il filamento caudale da una ninfa/adulto usando le flesse e raccoglierli in un tubo da 0,2 ml contenente 50 μL EtOH (conservare i campioni raccolti a -20 °C per una conservazione a lungo termine).
      NOTA: I campioni di tessuto vengono raccolti in EtOH perché prevengono la perdita di questi piccoli campioni a causa dell'elettricità statica. Se è necessario fermare il movimento degli insetti, anestetizzare la ninfa / adulto sul ghiaccio quando si preleva campioni di tessuto. Poiché T. domestica non può sopravvivere dopo il raffreddamento a lungo termine sul ghiaccio, non anestetizzarli per più di un minuto e spostarli immediatamente a temperatura ambiente. L'ablazione dei cerci e del filamento caudale non causa alcun aumento della mortalità.
   3. Posizionare i tubi campione con i coperchi aperti su un blocco termico per 15 minuti a 70 °C per evaporare l'EtOH.
   4. Ripetere i passaggi da 4.2.2 a 4.2.5 per genotipizzazione.
   5. Inviare i prodotti PCR in cui si osserva un modello di banda mutante a un servizio di sequenziamento Sanger standard.
   6. Mantenere le ninfe/adulti G1 con le mutazioni desiderate e scartare le altre (vedere la figura 4C per un risultato di sequenziamento rappresentativo).
4. Attraversa gli adulti contenenti le mutazioni desiderate in un piatto di accoppiamento e ottieni le generazioni successive per stabilire un ceppo mutante omozigoto.

Risultati

Nelle nostre mani, circa 100 uova possono essere ben iniettate con un singolo capillare di iniezione quando ha la punta adeguata(Figura 3C). L'iniezione di gRNA/Cas9 complesso di ribonucleoproteina negli embrioni entro le prime 8 ore dopo la deposizione delle uova provoca indeli nel sito mirato al gRNA. Ciò causa mutazioni bialleliche in alcune cellule della generazione iniettata (G0) e quindi i fenotipi di mosaico mutante sono solitamente ottenuti in G0. Ad esempio, quando questo protocoll...

Discussione

Per la generazione di successo del mutante T. domestica desiderato con CRISPR / Cas9, è prima importante raccogliere un numero sufficiente di embrioni messi in scena per l'iniezione. Per una raccolta costante di un numero sufficiente di uova T. domestica, la chiave è selezionare una dimensione appropriata del contenitore per avere una densità di popolazione inferiore perché aiuterebbe il completamento di una serie di complessi comportamenti di accoppiamento, che viene ripetuto dopo ogni muta adulta<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg	Integrated DNA Technologies	1081060
Anti-static cleaner	Hozan	Z-292	for removing static electricity from a 24-well plate
Barrier Box 20.7L	AS ONE	4-5606-01	Large container
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000013	Electronic microinjector
Femtotip II, injection capillary	Eppendorf	5242957000	Glass injection capillary
High Pack 2440mL	AS ONE	5-068-25	Middle-sized container
Incubator	Panasonic	MIR-554-PJ	for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator.
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.
Magnetic stand	Narishige	GJ-8	for holding the micromanipulator
Microloader	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MM-3
Microscope	Olympus	SZX12	for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
MultiNA	Shimadzu	MCE-202	Microchip electrophoresis system
NiceTac	Nichiban	NW-5	Double-sided tape to place eggs on a glass slide
Paint brush (horse hair)	Pentel	ZBS1-0
Plant culture dish	SPL Life Sciences	310100	Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris	Roche	3115836001
SZX 12 microscope	Olympus	SZX 12	More than 35X magnification is sufficient for the microinjection
Talcum powder	Maruishi	877113
Tetra Goldfish Gold Growth	Spectrum Brands		Artificial regular fish food