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Resumen

Este protocolo demuestra el uso de una plataforma tecnológica de microarrays fenotipos (PM) para definir los requisitos metabólicos de Chlamydomonas reinhardtii, una microalga verde, y refinar un modelo de red metabólica existente.

Resumen

Los modelos metabólicos se reconstruyen en función de la anotación del genoma disponible de un organismo y proporcionan herramientas predictivas para estudiar los procesos metabólicos a nivel de sistemas. Los modelos metabólicos a escala genómica pueden incluir lagunas, así como reacciones que no se han verificado experimentalmente. Los modelos reconstruidos de especies de microalgas recientemente aisladas darán lugar a debilidades debido a estas brechas, ya que generalmente hay escasa evidencia bioquímica disponible para el metabolismo de dichos aislados. La tecnología de microarrays fenotipos (PM) es un método efectivo y de alto rendimiento que determina funcionalmente las actividades metabólicas celulares en respuesta a una amplia gama de metabolitos de entrada. La combinación de los ensayos fenotípicos de alto rendimiento con el modelado metabólico puede permitir que los modelos de redes metabólicas existentes se reconstruyan u optimicen rápidamente al proporcionar evidencia bioquímica para respaldar y expandir la evidencia genómica. Este trabajo mostrará el uso de ensayos de PM para el estudio de microalgas utilizando como ejemplo el modelo de microalgas verdes Chlamydomonas reinhardtii. La evidencia experimental de más de 254 reacciones obtenidas por PM se utilizó en este estudio para expandir y refinar un modelo de red metabólica de C. reinhardtii a escala genómica, iRC1080, en aproximadamente un 25 por ciento. El protocolo creado aquí se puede utilizar como base para perfilar funcionalmente el metabolismo de otras microalgas, incluidos los mutantes de microalgas conocidos y los nuevos aislados.

Introducción

La optimización del metabolismo de las algas para una producción mejorada y estable de metabolitos específicos requiere el desarrollo de estrategias complejas de ingeniería metabólica a través de análisis a nivel de sistemas de redes metabólicas. Los modelos de redes metabólicas pueden guiar los diseños racionales para el rápido desarrollo de estrategias de optimización1,2,3,4. Aunque se han secuenciado aproximadamente 160 especies de microalgas5,sólo hay, hasta donde sabemos, sólo 44 modelos metabólicos de algas disponibles4,6,7. Debido a la dificultad de obtener datos fenotípicos metabólicos de alto rendimiento para la validación experimental de la información genómica, la reconstrucción de modelos de red de alta calidad está rezagada con respecto al rápido desarrollo de la secuenciación del genoma de algas.

C. reinhardtii es un sistema modelo atractivo para estudios basados en algas. Esta especie puede crecer fotoautótrofa o heterótrofamente y ha sido ampliamente utilizada como organismo modelo en investigación básica y aplicada. Su secuencia genómica fue publicada en 20078,con modelos metabólicos a escala genómica posteriormente reconstruidos para las especies9,10,11. El modelo a escala genómica de C. reinhardtii (iRC1080) fue reconstruido por Chang et al. 10 basado en evidencia genómica y bibliográfica (que implica ~ 250 fuentes). Tiene 1.706 metabolitos con 2.190 reacciones10; sin embargo, la integridad del modelo no pudo verificarse más allá de la evidencia experimental publicada disponible en ese momento.

La tecnología de microarrays de fenotipo (PMs) es una plataforma de alto rendimiento que puede proporcionar información de perfiles metabólicos para microorganismos heterótrofos, así como células de cultivo de tejidos. En particular, se puede utilizar para abordar la brecha de conocimiento de fenotipo a genotipo en microalgas, como se informó por primera vez para Chlamydomonas reinhardtii12 y posteriormente para una especie de Chloroidium13 y Chlorella14. Al estudiar las respuestas celulares a miles de metabolitos, moléculas de señalización, osmolitos y moléculas efectoras, los ensayos de PM pueden proporcionar perfiles metabólicos funcionales y ofrecer información sobre la función, el metabolismo y la sensibilidad ambiental15,16,17. Específicamente, los ensayos de PM detectan la utilización de metabolitos celulares en microplacas de 96 pozos con diferentes nutrientes, metabolitos u osmolitos contenidos en cada pozo. Además, también es posible ensayar moléculas bioactivas, como antibióticos y hormonas. Según lo determinado por la intensidad de la producción de color por la reducción de NADH de un colorante redox a base de tetrazolio, la utilización metabólica de los sustratos se evalúa en términos de respiración celular15,16,17. Los experimentos en microplacas de 96 pozos se pueden monitorear y determinar automáticamente a lo largo del tiempo con la plataforma de instrumento de microarrays de fenotipo (PMI). Veinte microplacas de 96 pozos están diseñadas para representar los metabolitos comunes para estudiar fenotipos celulares para utilizar fuentes de carbono, nitrógeno, azufre y fósforo, junto con diferentes efectos osmóticos / iónicos y de pH. La tecnología PM se ha utilizado con éxito para actualizar y actualizar una serie de modelos metabólicos a escala genómica existentes para microorganismos15,16,17,18.

El protocolo y los datos que se muestran aquí se basan en el trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12 El trabajo presentado detalla el uso del método de ensayo PM para caracterizar los fenotipos metabólicos de las microalgas y ampliar un modelo metabólico de algas existente de C. reinhardtii, así como para guiar la reconstrucción de nuevos modelos metabólicos.

Protocolo

1. Experimentos de microarrays de fenotipo

  1. Obtenga la cepa CC-503 de C. reinhardtii del Centro de Recursos de Chlamydomonas de la Universidad de Minnesota, EE. UU. (https://www.chlamycollection.org).
  2. Cultive las células en medios frescos de Tris-Acetato-Fosfato (TAP)19 con concentraciones finales de 400 μg/ml de timentina, 50 μg/ml de ampicilina y 100 μg/ml de kanamicina (para inhibir el crecimiento bacteriano) por debajo de 400 fotones micromol/m2s, a 25 °C, durante dos días hasta la mitad de la fase logarítmica.
  3. Girar el cultivo a 2.000 x g durante 10 min a 22 °C y desechar el sobrenadante sin molestar el pellet.
  4. Preparar medios TAP frescos que contengan un colorante violeta de tetrazolio al 0,1% "D".
    NOTA: Modifique los medios TAP en este paso para excluir algunos nutrientes dependiendo de la categoría de metabolitos probada en cada placa (por ejemplo, excluya el cloruro de amonio para las placas fuente de nitrógeno).
  5. Resuspend el pellet en medios TAP frescos preparados (a partir del paso 1.2) a una concentración final de 1 x 106 células/ml.
  6. Utilice placas de ensayo de matriz de compuestos químicos (fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, placas de fuentes de fósforo y azufre, y las fuentes de nitrógeno peptídico).
  7. Inocular una alícuota de 100 μL de medios que contienen células en cada pozo de las placas de ensayo.
    NOTA: Asegúrese de duplicar los ensayos.
  8. Rayar las células en las placas de extracto de levadura / peptona y realizar tinción de gram, como en Smith et al. 20 antes y después del ensayo para controlar la contaminación bacteriana.
  9. Inserte las placas de ensayo de la matriz de compuestos químicos en el sistema lector de microplacas.
  10. Incubar todas las placas a 30 °C durante un total de 7 días y programar el sistema lector de microplacas para leer el cambio de color del tinte cada 15 min.
    NOTA: Como la mayoría de los lectores de microplacas no proporcionan una fuente de luz continua durante la incubación, las algas deben poder llevar a cabo la respiración heterótrofa.

2. Análisis de datos

  1. Exporte los datos cinéticos sin procesar del lector de microplacas como archivos CSV, que posteriormente se utilizarán como entrada al paquete Omnilog Phenotype Microarray (OPM) en R. Agregue la información biológica como metadatos (por ejemplo, designación de cepa, medios de crecimiento, temperatura, etc.).
    1. Uso del software de conversión de datos PM Kinetic; cargue los archivos de datos D5E y conviértalos en archivos OKA utilizando las siguientes líneas de comandos en el software de análisis cinético PM:
      Cargar | Importar (localice la carpeta de los archivos OKA) | Rellenar filtros | Importar | Añadir todas las placas | Cerrar.
      exportación | elija leer datos (Cinético), elija formato (CSV) (Encabezado tabulado)y elija placas (cada placa (Archivos individuales)) | Exportar datos | Salvar.
    2. Para llevar a cabo el análisis de datos de Phenotype Microarray (PM), utilice el paquete de software OPM21,22 que se ejecuta dentro del entorno de software R. El paquete, el tutorial y la documentación de referencia están disponibles en: http://www.goeker.org/opm/. En RStudio, una interfaz gráfica de usuario para R, instale el paquete opm y sus dependencias mediante los siguientes comandos:
      fuente (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R)
      biblioteca (opm)
    3. Navegue hasta el directorio que contiene los archivos CSV de los datos cinéticos e importe los datos utilizando la funciónread_ opm:
      x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
    4. Agregue y discretize los datos cinéticos utilizando la estimación de parámetros de curva.
      Para (i en 1 :length(x)) {
      x[[i]]
      x[[i]] <- do_disc(x[[i]], cutoff = FALSE)
      }
      #Collection de los metadatos
      metadatos <- collect_template(".")
      metadata$Strain <- c("BLANK","CC- 503")
      for (I in 1 :length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = metadata, replace = TRUE)}
    5. Utilice la función xy_plot para mapear las mediciones de respiración (o crecimiento) (eje y) en función del tiempo (eje x) para las placas de 96 pociones ensayadas.
      print (xy_plot(x[[ 1 ]], include ="Strain", theor.max = FALSE))
    6. Visualice los datos como un mapa de calor utilizando la función level_plot para permitir una visión comparativa rápida de los datos cinéticos.
      level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt("color.borders"), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", space ="Lab", bias = 0.7 , num.colors = 200 L)
    7. Extraer información biológica importante, los parámetros de la curva, de las curvas cinéticas crudas e incluir la fase de retraso (λ), la tasa de crecimiento (μ), la respiración celular máxima (A) y el área bajo la curva (AUC)21. Para identificar metabolitos positivos, utilice los valores A del control negativo, que representa la reactividad abiótica del colorante con el medio, además del espacio en blanco de cada placa de microojo como valores de resta de fondo. La función de extracción se utiliza para obtener el parámetro A.
      opm_opt("curve.param")
      param <- extract (x, as.labels = list("Strain")))

3. Identificación de reacciones y genes asociados a nuevos metabolitos

  1. Búsqueda keGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) y MetaCyc (http://metacyc.org/) para identificar números de la Comisión de Enzimas (CE) para reacciones utilizando metabolitos encontrados en matrices de compuestos químicos23,2423,24.
  2. Utilice los números CE identificados como base de búsqueda en múltiples recursos de anotación de algas disponibles, como Joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) y publicaciones revisadas por pares23,25,26,27.
  3. Si una consulta no devuelve evidencia genética para un número CE dado, identifique las proteínas asociadas relevantes en otros organismos, comenzando con las especies más cercanas a C. reinhardtii,luego realice una búsqueda basada en perfiles utilizando el servidor NCBI PSI-BLAST con la configuración predeterminada y use proteínas no redundantes (nr) en C. reinhardtii (taxid: 3055) para identificar genes candidatos asociados a la reacción12.
  4. Seleccionar manualmente los éxitos PSI-BLAST con valores E de < 0,05 para determinar la relevancia del número EC buscado mediante la consulta de esos aciertos BLAST a través de los servidores de predicción de dominios de proteínas EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search) o InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/). Tenga en cuenta que los dos últimos escaneos son pasos críticos para garantizar la identificación de la actividad enzimática correcta para la proteína.

4. Refinamiento y evaluación del modelo

  1. Utilice la última versión de COBRA Toolbox v.3.028en MATLAB29,30plataforma para llevar a cabo los siguientes pasos para el refinamiento del modelo. COBRA Toolbox se puede instalar siguiendo los pasos de: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . Alternativamente, tenga en cuenta que COBRA Toolbox también se implementa en otros lenguajes de programación de código abierto, como Python (COBRApy31) y está disponible en: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .
    1. Después de instalar COBRA Toolbox v.3.0, abra MATLAB y ejecute el siguiente comando para inicializar la caja de herramientas:
      initCobraToolbox;
    2. Agregue las reacciones identificadas con sus genes asociados al modelo metabólico, como iRC1080, utilizando las funciones cobra Toolbox addReaction y changeGeneAssociation. Navegue hasta el directorio que contiene el modelo iRC1080, descargado de http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 y ejecute los siguientes comandos para cargar el modelo, cambiarle el nombre y agregar una nueva reacción y su gen asociado.
      Carga('iRC 1080 .mat')
      modelNew = iRC 1080;
      modelNew = addReaction(modelNew, 'D-ALA 2' , ...
      {'d-ala[c]' , 'atp[c]', ...
      'D-aladata[c]' , 'adp[c]' , 'pi[c]' , ...
      «h[c]» },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false);
      modelNEW = changeGeneAssociation(modelNew, ...
      «D-ALA 2», «au.g 14655 _t 1»);
    3. En algunos casos, cuando el metabolito no se produce intracelularmente, sino que se toma del medio, agregue reacciones de transporte para los nuevos metabolitos al modelo. Estas reacciones de transporte representan la difusión pasiva de un metabolito desde el medio extracelular al citosol. Además, agregue una reacción de intercambio artificial correspondiente utilizando la función addExchangeRxn para ingresar o emitir el metabolito en el medio extracelular.
      modelNew = addReaction(modelNew, 'CYCPt' , ...
      {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)'
      modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]' ,- 1000 ,1000 );
    4. Pruebe el comportamiento del nuevo modelo resultante, por ejemplo, iBD1106, realizando un análisis de balance de flujo (FBA) utilizando la función optimizeCbModel en condiciones de luz y oscuridad para la maximización de la biomasa como función objetivo. Para el crecimiento de la luz, establezca los límites inferior y superior de las reacciones de luz de la litografía solar PRISM en 646.07 (velocidad máxima). Para el crecimiento oscuro, establezca los límites de todas las reacciones de luz PRISM en cero. Utilice la función Biomasa definida previamente10 para el crecimiento en condiciones de oscuridad y luz. La solución de Logística de Amazon producirá dos vectores correspondientes a flujos de reacción (solution.v) y costes reducidos (solution.w), así como un vector correspondiente a los precios sombra de los metabolitos (solution.y).
      %Simular el crecimiento en condiciones de luz:
      modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ...
      % «PRISM_solar_litho» , ...
      'PRISM_solar_exo', ...
      'PRISM_incandescent_ 60 W', ...
      'PRISM_fluorescent_cool_ 215 W' , ...
      'PRISM_metal_halide', ...
      'PRISM_high_pressure_sodium', ...
      'PRISM_growth_room', ...
      'PRISM_white_LED', ...
      'PRISM_red_LED_array_ 653 nm' , ...
      'PRISM_red_LED_ 674 nm' , ...
      'PRISM_fluorescent_warm_ 18 W' , ...
      'PRISM_design_growth', ...
      }, 0, 'b' );
      modelNew = changeObjective(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo');
      FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNew, 'max');
    5. Repita el paso 4.1.4 para iRC1080 para comparar las soluciones de Logística de Amazon obtenidas para iBD1106 con las obtenidas para iRC1080.
    6. Hay una gama de métodos COBRA disponibles que se pueden utilizar para comparar modelos (por ejemplo, análisis de variabilidad de flujo, estudios de deleción de genes, análisis de robustez, predicciones de división de flujo, FBA, muestreo, etc.). Los tutoriales detallados se pueden encontrar en https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. Aquí, se proporciona un ejemplo donde se compara el modelo iRC1080 con su versión refinada, iBD1106, obteniendo los precios sombra (sensibilidad de la función objetivo de biomasa a los cambios en la variable del sistema) de los metabolitos contabilizados en cada modelo.
      Obtener los precios sombra para los metabolitos:
      shadowPrices = table(modelNew.mets, ...
      modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);

Resultados

Cribado de fenotipo Microarrays de alga modelo Chlamydomonas reinhardtii
Los ensayos de PM prueban la capacidad del alga para utilizar varias fuentes de carbono, nitrógeno, azufre y fósforo en un medio mínimo. En esta descripción de los métodos, demostramos cómo se utilizaron los ensayos de PM para identificar el metabolismo del carbono y el nitrógeno. La cinética de utilización de carbono y nitrógeno se midió con un lector de microplacas. Los datos se analizaron mediante el software PMI. La cinética resumida de las placas de ensayo de PM seleccionadas (PM01 y PM03) se muestra en la Figura 1. Los "gráficos xy" muestran las mediciones de respiración a lo largo del tiempo trazadas para los ensayos de placas de 96 pomos, donde el eje y y el eje x representan los valores de las mediciones en bruto y el tiempo, respectivamente. Los datos se convirtieron en un patrón de mapa de calor para analizar comparativamente el ensamblaje de los datos cinéticos.

La tubería de refinación de la red metabólica a escala genómica utilizando datos de PM(Figura 2)ilustra la integración de los ensayos de PM de alto rendimiento con la evidencia experimental proporcionada por búsquedas genómicas que puede expandir un modelo de red metabólica.

Para determinar la reproducibilidad de los datos de PM obtenidos de las placas PM01 - 04 y PM10, se analizó una regresión lineal para trazar los datos de dos experimentos de réplica independientes entre sí(Figura 3). La Figura 3 muestra que la mayoría de los datos fueron casi similares, ya que caen en la línea de 45°, con solo unos pocos valores atípicos presentes, y su coeficiente de determinación R2 fue de 0,9. La consistencia y reproducibilidad de los experimentos para el alga son verificadas por esta gráfica.

Identificación de nuevos metabolitos
El ensayo PM identificó 662 metabolitos en siete placas; PM01-PM04 y PM06-PM08, mientras que la Cromatografía de Gases Tiempo de Vuelo (GC-TOF) había identificado 77 metabolitos32 (Figura 4). Al comparar estos dos conjuntos con los 1068 metabolitos contabilizados en el iRC1080, solo seis metabolitos se superpusieron entre los tres conjuntos, y 149 se superpusieron entre el iRC1080 y el PM. Este resultado demuestra que la plataforma de perfiles metabólicos puede ser una fuente significativa de nueva información metabólica.

El ácido acético fue la única fuente de carbono detectada en la placa PM01 como carbono de soporte después de restar la señal de fondo. Este hallazgo es consistente con la literatura33 y muestra la especificidad de los ensayos de PM. Los ensayos de PM revelaron nuevas fuentes de azufre, fósforo y nitrógeno que C. reinhardtii puede utilizar para el crecimiento. Los metabolitos del azufre fueron sulfato, tiosulfato, tetrationato y DL-lipoamida. Las fuentes de fósforo fueron tiofosfato, ditiofosfato, ácido D-3-fosfo-glicérico y cisteamina-S-fosfato. Los metabolitos fuente de nitrógeno fueron L-amino y D-aminoácidos, incluyendo aminoácidos menos comunes; L-homoserina, L-piroglutámico, metilamina, etilamina, etanolamina y D,L-α-amino-butírico, y 108 Dipéptidos y cinco tripéptidos (Tabla 1). Se buscaron en KEGG y MetaCyc sus reacciones asociadas, números de CE y vías, los números de EC y las vías.

Los nuevos 128 metabolitos se asociaron con 49 números EC únicos. De estos, 15 EC se vincularon a su evidencia genómica utilizando cinco fuentes, entre ellas; Phytozome Versión 10.0.234 JGI Versión 435, AUGUSTUS 5.0 y 5.210 anotaciones de Manichaikul et al. 36 y KEGG13. Los metabolitos sin evidencia genómica se ingresaron en el sitio web de Universal Protein Resource (UniProt, http://www.uniprot.org/)37,38 donde se encontraron sus secuencias relacionadas en otros organismos. Las secuencias homólogas en C. reinhardtii se identificaron ejecutando Position-Specific Iterated BLAST (PSI-BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) del sitio web del NCBI considerando solo secuencias que produjeron alineaciones significativas (valor E <0.005).

Refinamiento del modelo
Las reacciones asociadas con los nuevos metabolitos 128, junto con sus genes codificados, se agregaron al modelo iRC1080, expandiendo la red. El modelo resultante iBD1106, da cuenta de 2.444 reacciones, 1.959 metabolitos y 1.106 genes (Tabla 2). Las nuevas 254 reacciones añadidas fueron 20 reacciones de oxidación de aminoácidos, 108 reacciones de hidrólisis de dipéptidos, cinco reacciones de hidrólisis de tripéptidos y 120 reacciones de transporte, codificadas por cuatro genes (Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3).

Un total de 113 nuevas reacciones añadidas explican la hidrólisis de dipéptidos y tripéptidos. La hidrólisis de dipéptidos y tripéptidos se asocia con dos genes, uno para dipéptidos (Cre02.g078650.t1.3) y otro para tripéptidos (Cre16.g675350.t1.3).

En cuanto a las fuentes de fósforo, se agregó una reacción para la hidrólisis de cisteamina-S-fosfato en cisteamina y fosfato asociada con el gen JLM_162926.

La herramienta WoLF PSORT39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) y los resultados reportados por Ghamsari et al. Se aplicaron 35 para obtener la especificación de los compartimentos celulares donde tienen lugar las nuevas reacciones. Al analizar las secuencias de proteínas asociadas con las nuevas reacciones, WoLF PSORT predijo el citosol como el compartimento celular para las reacciones.

Un modelo metabólico generado puede contener lagunas cuando la información bioquímica es incompleta. En tales casos, se utiliza gapFind,un comando COBRA. Enumera las brechas de raíz y permite la identificación de nuevas brechas de introducción en el nuevo modelo. Los metabolitos que no se pueden producir en un modelo metabólico se conocen como brechasradiculares 40,41. El análisis de la brecha de raíz indicó que los modelos iRC1080 e iBD1106 contienen las mismas 91 brechas. Esto muestra que la adición de los nuevos metabolitos y sus reacciones asociadas no introdujo ningún hueco radicular adicional. Cabe señalar que el método de fenotipado utilizado en este protocolo no cierra las brechas de la raíz, porque los metabolitos de la brecha de la raíz original carecen de mecanismos de transporte o producción, que no se abordaron en los ensayos de fenotipado. Se realizó un análisis del balance de flujo para probar el comportamiento metabólico de iBD1106 en condiciones de luz y oscuridad; (sin acetato) y (con acetato), respectivamente. El algoritmo maximiza las reacciones precursoras de biomasa para una función objetiva (crecimiento de biomasa). Para evaluar la participación de cada metabolito en la función objetiva establecida, se calcularon los "precios sombra" para todos los metabolitos. El cambio en la función objetiva con respecto a los cambios de flujo del metabolito define el precio sombra de un metabolito30,42. La indicación de si un metabolito está en "exceso" o está "limitando" la función objetiva puede determinarse mediante el análisis de precios sombra, por ejemplo, la producción de biomasa. Los valores de precios sombra negativos o positivos revelan metabolitos que, al sumarse, disminuirán o aumentarán la función objetiva. Los valores cero de los precios sombra revelan metabolitos que no afectarán a la función objetiva. La comparación de los precios sombra entre iBD1106 e iRC1080 en la Figura 5 muestra que, para la mayoría de los metabolitos, no se observa un cambio significativo; sin embargo, las diferencias se encuentran en 105 y 70 casos en condiciones de crecimiento claro y oscuro, respectivamente. La Tabla 4 incluye ejemplos de tales metabolitos.

figure-results-8837
Figura 1: Perfil de microarrays fenotípicos de C. reinhardtii. Respiración XY-plots y diagramas de nivel del PM01 (Fuentes de carbono; A, C) y PM03 (Fuentes de nitrógeno; B, D) se muestran las placas de ensayo. La figura es una matriz de 8x12 donde cada célula representa una placa de pozo y, por lo tanto, un metabolito o entorno de crecimiento dado. Dentro de cada representación de celda o pozo, las curvas representan la conversión de tinte por reducción (eje y) en función del tiempo (eje x). Las curvas de respiración PM del CC-503 y los pomos en blanco se muestran en cada celda y se indican por color (el color verde azulado representa los pomos en blanco y el color púrpura representa CC-503). La gráfica de nivel representa cada curva de respiración como una delgada línea horizontal que cambia de color (o permanece sin cambios) a lo largo del tiempo. Los cambios de color del mapa de calor son de amarillo claro (se ha producido poca o ninguna respiración) a naranja oscuro o marrón (se ha producido una respiración significativa). Se muestran los metabolitos utilizados por C. reinhardtii (CC-503) y las placas en blanco. Esta cifra es de un trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

figure-results-10495
Figura 2:Canalización de refinamiento de la red metabólica a escala genómica utilizando datos de PM. Después de que un nuevo compuesto da positivo en un ensayo de PM, su número de Comisión de Enzimas (CE), reacción y vía se identifican a partir de las bases de datos disponibles, por ejemplo, KEGG y MetaCyc. La evidencia genómica se extrae de los recursos genómicos y de anotación cuando está disponible y constituye un vínculo entre el genotipo y el fenotipo. Cuando la evidencia genómica directa no está disponible, la secuencia de proteínas se identifica a partir de los números EC, y la evidencia genética se identifica a través de PSI-Blast. La red metabólica reconstruida se refina en función de los compuestos recién identificados, pero solo después de un paso de control de calidad que implica consultar los dominios de proteínas utilizando bases de datos relevantes. Esta figura ha sido modificada a partir de trabajos publicados previamente por Chaiboonchoe et al. 12Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

figure-results-11867
Figura 3: Reproducibilidad de las pruebas de PM. Los valores de PMI se recopilaron durante un período de 168 horas, y los valores máximos de PMI se trazaron para dos estudios de réplica. Cada eje representa los valores máximos de PMI para cada estudio (el eje x es un estudio replicado y el eje y otro). Los valores reproducidos son equidistantes de cada eje. Cada punto representa un único valor máximo. La regresión lineal fue realizada por un software de hoja de cálculo, y se muestra el coeficiente de determinación resultante (R2). Esta figura ha sido modificada a partir de trabajos publicados previamente por Chaiboonchoe et al. 12Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

figure-results-12910
Figura 4: Diagrama de Venn de metabolitos. El diagrama de Venn enumera los metabolitos identificados por las placas PM, el modelo metabólico iRC1080 y los experimentos de tiempo de vuelo de cromatografía de gases (GC-TOF). Cada círculo indica el número total de metabolitos que existen en cada método de estudio respectivo. Al mismo tiempo, las regiones superpuestas representan el número de metabolitos compartidos entre esos métodos. El modelo metabólico iRC1080 contiene un total de 1.068 metabolitos únicos. El GC-TOF identificó un total de 77 metabolitos32,mientras que hay un total de 662 metabolitos identificados utilizando las placas PM. Esta cifra es de un trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-14068
Figura 5: Precios sombra de los metabolitos en iRC1080 e iBD1106 en diferentes condiciones para la maximización de la biomasa. Cada círculo en las "gráficas de radar" corresponde a un valor de precio sombra, mientras que cada línea que se extiende desde el centro de una gráfica indica un metabolito. (A) Precios sombra y comportamientos metabólicos de iRC1080 e iBD1106 bajo una condición de crecimiento ligero; (B), diferentes comportamientos metabólicos de iRC1080 e iBD1106 bajo una condición de crecimiento oscuro. Esta cifra es de un trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Biolog QuímicoCE* Anotación de genesPSI-BLAST
Cisteamina-S-Fosfato3.1.3.1JLM_1629261,2,3,4
Tetrationato1.8.2.2valor E insignificante
1.8.5.2valor E insignificante
D-Alanina1.4.1.1XP_001700222.1
1.5.1.22CONTROL de calidad manual fallido
2.1.2.7valor E insignificante
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
2.3.2.10valor E insignificante
2.3.2.14valor E insignificante
2.3.2.16valor E insignificante
2.3.2.17valor E insignificante
2.3.2.18valor E insignificante
2.6.1.21CONTROL de calidad manual fallido
3.4.13.22XP_001698572.1, XP_001693532.1, XP_001701890.1 XP_001700930.1
3.4.16.4Chlre2_kg.andamio_ 140000391,2,3
3.4.17.8CONTROL de calidad manual fallido
3.4.17.13valor E insignificante
3.4.17.14valor E insignificante
4.5.1.2valor E insignificante
6.1.1.13CONTROL de calidad manual fallido
6.1.2.1CONTROL de calidad manual fallido
6.3.2.4au.g14655_t11,2,3
6.3.2.10CONTROL de calidad manual fallido
6.3.2.16valor E insignificante
6.3.2.35valor E insignificante
D-Asparagina1.4.5.1valor E insignificante
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
3.1.1.96valor E insignificante
2.3.1.36valor E insignificante
1.4.99.1XP_001692123.1
3.5.1.77e_gwW.1.243.11,2
3.5.1.81valor E insignificante
5.1.1.10CONTROL de calidad manual fallido
Ácido D-aspártico6.3.1.12valor E insignificante
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
Ácido D-glutámico1.4.3.7valor E insignificante
1.4.3.3valor E insignificante
D-lisina5.4.3.4valor E insignificante
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
6.3.2.37CONTROL de calidad manual fallido
D-Serina2.7.11.8valor E insignificante
2.7.11.17Cre12.g486350.t1.31,2,3,4
3.4.21.78CONTROL de calidad manual fallido
3.4.21.104CONTROL de calidad manual fallido
4.3.1.18g6244.t14 CONTROL de calidad manual fallido
6.3.2.35valor E insignificante
6.3.3.5valor E insignificante
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
D-Valina1.21.3.1CONTROL de calidad manual fallido
6.3.2.26CONTROL de calidad manual fallido
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
Ácido L-piroglutámico
Tiofosfato
Ditiofosfato
Etilamina6.3.1.6
Ácido D,L-a-amino-butírico2.1.1.49valor E insignificante
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
Dipéptido di3.4.13.18Cre02.g078650.t1.31
Tripéptido3.4.11.4Cre16.g675350.t1.31

Tabla 1: Lista de metabolitos de utilización de sustrato positivos identificados (C, P, S, N) no presentes en el modelo metabólico iRC1080.   *La reacción no se incluyó si no se identificó ningún gen.  1 Phytozome versión 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii).   número arábigo JGI versión 4 35.  3 Augusto versión 510.  4 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html).  5 JGI versión 3.136.  Esta tabla es de un trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12

ModeloReaccionesMetabolitosGenes
iRC10802,1911,7061,086
iBD11062,4451,9591,106

Tabla 2: Contenido de iRC1080 e iBD1106.  Esta tabla es de un trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12

Categoría o clase de reaccionesNúmero de reacciones
Aminoácidos20
Dipéptidos108
Tripéptidos5
Reacción del transporte120

Tabla 3: Resumen de las nuevas reacciones en iBD1106. Esta tabla es de un trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12

Condición de crecimientoMetabolitoNombreiRC1080iBD1106
4r5au4-(1-D-Ribitylamino)-5-aminouracilo00.168
5aprbu5-Amino-6-(5'-fosforibitylamino)uracilo-0.0090.158
Luzpa1819Z18111Z1-(9Z)-octadecenil,2-(11Z)-octadecenil-sn-glicerol3-fosfato-0.009-0.65
Oscuro4abut4-aminobutanoato0.18-0.05

Cuadro 4: Ejemplo de precios sombra significativos para iRC1080 e iBD1106. Esta tabla es de un trabajo publicado previamente por Chaiboonchoe et al. 12

Discusión

El fenotipado metabólico de la microalga verde, C. reinhardtii,se describió aquí utilizando placas de ensayo de PM de alto rendimiento y un PMI no modificado. Los ensayos se utilizaron para un total de 190 fuentes de carbono (PM01 y PM02), 95 fuentes de nitrógeno (PM03), 59 fuentes de fósforo y 35 fuentes de azufre (PM04), junto con fuentes de nitrógeno peptídico (PM06-08). Se observó respiración positiva para 148 nutrientes (un ensayo positivo para la utilización de la fuente C, cuatro ensayos positivos para cada utilización de la fuente S y la fuente P, y 139 ensayos positivos para la utilización de la fuente N). Los sustratos o nutrientes (carbono, nitrógeno, fósforo o azufre) del componente del medio no deben agregarse al medio definido cuando se aplican a las microplacas PM pertinentes que prueban cada una de esas fuentes.

El método que se muestra aquí es eficaz para caracterizar fenotipos de microalgas metabólicas que se pueden utilizar para ampliar los modelos de redes metabólicas existentes o dirigir la reconstrucción de nuevos modelos. Además, como no se conocen los requisitos nutricionales de la mayoría de las microalgas, esta plataforma se puede utilizar para definirlos rápidamente. Nelson et al. 43 había aplicado con éxito estos métodos para identificar nuevos compuestos que apoyan el crecimiento de la microalga Chloroidium sp. UTEX 3007 y utilizó la información obtenida para definir los metabolitos de entrada de especies, que, a diferencia de Chlamydomonas, incluyen 40 fuentes de carbono diferentes.

Una limitación importante del PM para perfilar microalgas es que el PMI no tiene iluminación en la cámara de incubación, y las microalgas deben poder llevar a cabo el metabolismo heterótrofo. La ausencia de luz podría afectar a la interpretación de modelos que incorporan luz para calcular los flujos metabólicos. Los pares de genes con funciones de coordinación han coevolucionado para constituir centros de redes metabólicas, y la distinción entre centros de red fotosintéticos y no fotosintéticos se puede hacer44. En general, los centros de red fotosintéticos (es decir, los nodos altamente conectados en el modelo) se dejarían fuera de los modelos heterótrofos. A efectos prácticos, el modelado del heterotrofio en especies mixotróficas debe omitir las reacciones que se sabe que son impulsadas por la luz y tener en cuenta las diferencias de equilibrio energético entre las condiciones. Por lo tanto, el modelado del metabolismo dependiente de la luz e independiente de la luz es una práctica estándar en el modelado metabólico de Chlamydomonas6,45.

Se sabe que algunas microalgas verdes, como Trebouxiophytes, asimilan una variedad de moléculas de carbono para el crecimiento, y se cree que esto surgió de su larga historia evolutiva como miembros de los líquenes46. Mientras que los clorofitos como Chlamydomonas pueden usar acetato para el crecimiento, la microalga marina marrón Tisochrysis lutea, conocida por su potencial para producir comercialmente ácidos grasos poliinsaturados de cadena muy larga (VLC-PUFA), no puede usar acetato pero puede usar glicerol para el crecimiento47. La concentración de biomasa de más de 100 g l−1 peso de celda seca se ha logrado con Chlorella con adición optimizada de fuentes de carbono orgánico en un modo de lote alimentado48. Además, la adición de azúcar a Chlorellavulgaris puede elevar su secuestro de CO2, proporcionando así un beneficio aditivo durante el crecimiento fotosintético49. La mayoría de las microalgas heterótrofas también pueden crecer mixotróficamente, pero se ha demostrado que el clorofito Chromochloris zofingiensis apaga la fotosíntesis tras la adición de azúcar50.

Las diatomeas, pertenecientes a la división Bacillariophyta, son un grupo importante de fitoplancton. Aunque la mayoría de las diatomeas solo pueden crecer fotoautotróficamente, algunas de ellas se pueden cultivar mixotróficamente o heterótrofamente51. Por ejemplo, se encontró que el glicerol apoya el crecimiento en la luz en ausencia de CO2 en algunas diatomeas, incluida la especie modelo Phaeodactylum tricornutum52. Además, algunas diatomeas bentónicas como Nitzschia linearis pueden crecer con carbohidratos en la oscuridad53. Es probable que extienda los ensayos de PM a diatomeas y otros grupos de algas complementando fuentes de carbono orgánico adecuadas para permitir que las células crezcan heterótrofamente, y también se puede usar potencialmente una estrategia de mixotrofia para las microalgas autótrofas obligadas que proporcionan un suministro de luz mínimamente requerido.

Para evaluar la reproducibilidad de los datos, es muy recomendable realizar ensayos duplicados para todas las placas. Un ensayo sólo puede considerarse positivo si, después de restar el control negativo y los respectivos pozos en blanco, la absorbancia (valor PMI) es positiva. Esta descripción, en presencia del compuesto probado, es un reflejo de la reacción abiótica del colorante con el medio.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El mayor apoyo para este trabajo fue proporcionado por el Centro NYUAD de Genómica y Biología de Sistemas (CGSB), financiado por Tamkeen bajo la subvención del Instituto de Investigación abu Dhabi de la Universidad de Nueva York (73 71210 CGSB9) y los Fondos de Investigación de la Facultad de NYU Abu Dhabi (AD060). W.F. también fue apoyado por el Programa de los Cien Talentos de la Universidad de Zhejiang. Agradecemos a Ashish Jaiswal por su ayuda en la grabación del video. Agradecemos a Hong Cai por generar los datos del fenotipo metabólico.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinVWR97062-796
Biolog assay plates [ PM01-08]Biolog, Hayward, CA, USA
Biolog Omnilog InstrumentBiolog, Hayward, CA, USA
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.Regents of the University of Minnesota
KanamycinVWR0408-EU-10G
Tetrazolium Violet Dye “D”Biolog, Hayward, CA, USA
TimentinGlaxoSmithKline Australia Pty Ltd42010012-2

Referencias

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