In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung einer Phänotyp-Microarray-Technologieplattform (PM), um die metabolischen Anforderungen von Chlamydomonas reinhardtii, einer grünen Mikroalge, zu definieren und ein bestehendes metabolisches Netzwerkmodell zu verfeinern.

Zusammenfassung

Stoffwechselmodelle werden auf der Grundlage der verfügbaren Genomannotation eines Organismus rekonstruiert und bieten prädiktive Werkzeuge, um Stoffwechselprozesse auf Systemebene zu untersuchen. Stoffwechselmodelle im Genommaßstab können sowohl Lücken als auch Reaktionen enthalten, die experimentell nicht verifiziert sind. Rekonstruierte Modelle von neu isolierten Mikroalgenarten werden aufgrund dieser Lücken zu Schwächen führen, da für den Metabolismus solcher Isolate in der Regel spärliche biochemische Beweise vorliegen. Die Phänotyp-Microarray-Technologie (PM) ist eine effektive Hochdurchsatzmethode, die funktionelle Bestimmung der zellulären Stoffwechselaktivitäten als Reaktion auf eine Vielzahl von Eintrittsmetaboliten ermöglicht. Die Kombination der phänotypischen Hochdurchsatz-Assays mit der metabolischen Modellierung kann es ermöglichen, bestehende metabolische Netzwerkmodelle schnell zu rekonstruieren oder zu optimieren, indem biochemische Beweise zur Unterstützung und Erweiterung der genomischen Evidenz bereitgestellt werden. Diese Arbeit wird die Verwendung von PM-Assays für die Untersuchung von Mikroalgen am Beispiel der grünen Mikroalgenmodellspezies Chlamydomonas reinhardtii zeigen. Experimentelle Beweise für über 254 Reaktionen, die durch PM erhalten wurden, wurden in dieser Studie verwendet, um ein genomweites C. reinhardtii-Stoffwechselnetzwerkmodell, iRC1080, um etwa 25 Prozent zu erweitern und zu verfeinern. Das hier erstellte Protokoll kann als Grundlage für die funktionelle Profilierung des Metabolismus anderer Mikroalgen, einschließlich bekannter Mikroalgenmutanten und neuer Isolate, verwendet werden.

Einleitung

Die Optimierung des Algenstoffwechsels für eine verbesserte und stabile Produktion gezielter Metaboliten erfordert die Entwicklung komplexer Metabolic-Engineering-Strategien durch Analysen von Stoffwechselnetzwerken auf Systemebene. Metabolische Netzwerkmodelle können die rationalen Entwürfe für die schnelle Entwicklung von Optimierungsstrategienleiten 1,2,3,4. Obwohl etwa 160 Mikroalgenarten sequenziert wurden5,gibt es nach unserem Wissen nur 44 Algenstoffwechselmodelle4,6,7. Aufgrund der Schwierigkeit, metabolische phänotypische Daten mit hohem Durchsatz für die experimentelle Validierung genomischer Informationen zu erhalten, hinkt die Rekonstruktion hochwertiger Netzwerkmodelle der rasanten Entwicklung der Algengenomsequenzierung hinterher.

C. reinhardtii ist ein attraktives Modellsystem für Algenuntersuchungen. Diese Art kann photoautotroph oder heterotroph wachsen und wurde in der Grundlagen- und angewandten Forschung häufig als Modellorganismus verwendet. Seine Genomsequenz wurde 2007 veröffentlicht8, wobei metabolische Genommodelle anschließend für die Spezies9, 10,11rekonstruiertwurden. Das Genom-Scale-Modell für C. reinhardtii (iRC1080) wurde von Chang et al. rekonstruiert. 10 basierend auf genomischen und literarischen Beweisen (mit ~ 250 Quellen). Es hat 1.706 Metaboliten mit 2.190 Reaktionen10; Die Vollständigkeit des Modells konnte jedoch nicht über die damals verfügbaren veröffentlichten experimentellen Beweise hinaus verifiziert werden.

Die Phänotyp-Microarrays-Technologie (PMs) ist eine Hochdurchsatzplattform, die metabolische Profiling-Informationen für heterotrophe Mikroorganismen sowie Gewebekulturzellen bereitstellen kann. Insbesondere kann es verwendet werden, um die Phänotyp-zu-Genotyp-Wissenslücke bei Mikroalgen zu schließen, wie sie zuerst für Chlamydomonas reinhardtii12 und anschließend für eine Art von Chloroidium13 und Chlorella14berichtet wurde. Durch die Untersuchung von Zellantworten auf Tausende von Metaboliten, Signalmolekülen, Osmolyten und Effektormolekülen können die PM-Assays ein funktionelles metabolisches Profiling liefern und Einblicke in die Funktion, den Stoffwechsel und die Umweltempfindlichkeit geben15,16,17. Insbesondere erkennen PM-Assays die Verwendung von Zellmetaboliten in 96-Well-Mikroplatten mit verschiedenen Nährstoffen, Metaboliten oder Osmolyten, die in jedem Bohrloch enthalten sind. Darüber hinaus ist es auch möglich, bioaktive Moleküle wie Antibiotika und Hormone zu testen. Bestimmt durch die Intensität der Farbproduktion durch die NADH-Reduktion eines Tetrazolium-basierten Redoxfarbstoffs wird die metabolische Verwertung von Substraten in Bezug auf die Zellatmung15,16,17bewertet. Die Experimente in 96-Well-Mikrotiterplatten können im Laufe der Zeit mit der Phänotyp-Microarray-Instrument-Plattform (PMI) überwacht und automatisch bestimmt werden. Zwanzig 96-Well-Mikroplatten sind so konzipiert, dass sie die üblichen Metaboliten darstellen, um zelluläre Phänotypen zu untersuchen, um Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Phosphorquellen sowie verschiedene osmotische / Ionen- und pH-Effekte zu nutzen. Die PM-Technologie wurde erfolgreich zur Aktualisierung und Aktualisierung einer Reihe bestehender Genom-metabolischer Modelle für Mikroorganismeneingesetzt 15,16,17,18.

Das hier gezeigte Protokoll und die Daten basieren auf zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. 12 Die vorgestellte Arbeit beschreibt die Verwendung der PM-Assay-Methode zur Charakterisierung der metabolischen Phänotypen von Mikroalgen und zur Erweiterung eines bestehenden Algen-Stoffwechselmodells von C. reinhardtii sowie zur Anleitung der Rekonstruktion neuer Stoffwechselmodelle.

Protokoll

1. Phänotyp-Microarray-Experimente

  1. Erhalten Sie C. reinhardtii Stamm CC-503 aus dem Chlamydomonas Resource Center an der University of Minnesota, USA (https://www.chlamycollection.org).
  2. Die Zellen werden in frischen Tris-Acetat-Phosphat (TAP)-Medien19 mit Endkonzentrationen von 400 μg/ml Timentin, 50 μg/ml Ampicillin und 100 μg/ml Kanamycin (zur Hemmung des Bakterienwachstums) unter 400 Mikromol Photonen/m2 s bei 25 °C für zwei Tage bis zur mittleren Log-Phase gezüchtet.
  3. Die Kultur bei 2.000 x g für 10 min bei 22 °C herunterdrehen und den Überstand verwerfen, ohne das Pellet zu stören.
  4. Bereiten Sie frische TAP-Medien mit 0,1% Tetrazoliumviolettfarbstoff "D" vor.
    HINWEIS: Modifizieren Sie die TAP-Medien in diesem Schritt, um einige Nährstoffe in Abhängigkeit von der in jeder Platte getesteten Metabolitenkategorie auszuschließen (z. B. Ausschluss von Ammoniumchlorid für Stickstoffquellenplatten).
  5. Resuspendieren Sie das Pellet in frisch hergestellten TAP-Medien (aus Schritt 1.2) auf eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml.
  6. Verwenden Sie chemische Verbindungsarray-Assay-Platten (Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Phosphor- und Schwefelquellenplatten und die Peptidstickstoffquellen).
  7. Impfen Sie ein 100 μL Aliquot zellhaltiger Medien in jede Vertiefung der Testplatten.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Assays duplizieren.
  8. Streifen Sie Zellen auf Hefeextrakt / Peptonplatten und führen Sie eine Grammfärbung durch, wie in Smith et al. 20 vor und nach dem Test zur Überwachung der bakteriellen Kontamination.
  9. Setzen Sie die Assay-Platten für chemische Verbindungen in das Mikroplattenlesesystem ein.
  10. Inkubieren Sie alle Platten bei 30 °C für bis zu 7 Tage und programmieren Sie das Mikroplattenlesesystem so, dass es den Farbstofffarbwechsel alle 15 Minuten ableset.
    HINWEIS: Da die meisten Mikroplattenleser während der Inkubation keine kontinuierliche Lichtquelle liefern, sollten die Algen in der Lage sein, heterotrophe Atmung durchzuführen.

2. Datenanalyse

  1. Exportieren Sie die kinetischen Rohdaten aus dem Mikroplattenleser als CSV-Dateien, die anschließend als Eingabe für das Omnilog Phenotype Microarray (OPM) -Paket in R verwendet werden. Fügen Sie die biologischen Informationen als Metadaten hinzu (z. B. Stammbezeichnung, Wachstumsmedien, Temperatur usw.).
    1. Verwendung der PM Kinetic Datenkonverter-Software; Laden Sie die D5E-Datendateien und konvertieren Sie sie mithilfe der folgenden Befehlszeilen in der kinetischen Analysesoftware PM in OKA-Dateien:
      | Importieren (suchen Sie den Ordner der OKA-Dateien) | Auffüllen von Filtern | | importieren Alle Platten hinzufügen | Schließen.
      | exportieren Wählen Sie gelesene Daten (Kinetic), wählen Sie Format (CSV) (Tabellarische Kopfzeile)und wählen Sie Platten (jede Platte (einzelne Dateien)) | | exportieren Retten.
    2. Um die Phenotype Microarray (PM) Datenanalyse durchzuführen, verwenden Sie das OPM-Softwarepaket21,22, das innerhalb der R-Softwareumgebung ausgeführt wird. Das Paket, das Tutorial und die Referenzdokumentation finden Sie unter: http://www.goeker.org/opm/. Installieren Sie in RStudio, einer grafischen Benutzeroberfläche für R, das opm-Paket und seine Abhängigkeiten mithilfe der folgenden Befehle:
      Quelle (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R)
      Bibliothek (opm)
    3. Navigieren Sie zu dem Verzeichnis, das die CSV-Dateien der kinetischen Daten enthält, und importieren Sie die Daten mit der Funktion read_opm:
      x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
    4. Aggregieren und diskretisieren Sie die kinetischen Daten mithilfe der Kurvenparameterschätzung.
      Für (i in 1 :length(x)) {
      x[[i]]
      x[[i]] <- do_disc(x[[i]], cutoff = FALSE)
      }
      #Collection der Metadaten
      Metadaten <- collect_template(".")
      metadata$Strain <- c("BLANK","CC- 503")
      for (I in 1 :length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = metadaten, replace = TRUE)}
    5. Verwenden Sie die Funktion xy_plot, um die Atmungs- (oder Wachstums-) Messungen (y-Achse) als Funktion der Zeit (x-Achse) für die untersuchten 96-Well-Platten abzubilden.
      print (xy_plot(x[[ 1 ]], include ="Strain", theor.max = FALSE))
    6. Visualisieren Sie die Daten als Heatmap mit der Funktion level_plot, um einen schnellen vergleichenden Überblick über die kinetischen Daten zu ermöglichen.
      level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt("color.borders"), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", space ="Lab", bias = 0.7 , num.colors = 200 L)
    7. Extrahieren Sie wichtige biologische Informationen, die Kurvenparameter, aus den rohen kinetischen Kurven und schließen Sie die Lag-Phase (λ), die Wachstumsrate (μ), die maximale Zellatmung (A) und die Fläche unter der Kurve (AUC)21ein. Um positive Metaboliten zu identifizieren, verwenden Sie die A-Werte der Negativkontrolle, die die abiotische Reaktivität des Farbstoffs mit dem Medium darstellt, zusätzlich zum Rohling jeder Mikrotiterplatten als Hintergrundsubtraktionswerte. Die Extract-Funktion wird verwendet, um den A-Parameter abzurufen.
      opm_opt("curve.param")
      param <- Extrakt (x, as.labels = list("Strain")))

3. Identifizierung von Reaktionen und Genen, die mit neuen Metaboliten assoziiert sind

  1. Durchsuchen Sie KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) und MetaCyc (http://metacyc.org/), um Enzyme Commission Numbers (ECs) für Reaktionen mit Metaboliten aus chemischen Verbindungsarrays zu identifizieren23,2423,24.
  2. Verwenden Sie die identifizierten EC-Nummern als Suchbasis in mehreren verfügbaren Algenannotationsressourcen wie dem Joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) und Peer-Review-Publikationen23,25,26,27.
  3. Wenn eine Abfrage keinen genetischen Nachweis für eine bestimmte EC-Nummer liefert, identifizieren Sie die relevanten assoziierten Proteine in anderen Organismen, beginnend mit Spezies, die dem C. reinhardtiiam nächsten sind , führen Sie dann eine profilbasierte Suche mit dem NCBI PSI-BLAST-Server mit Standardeinstellungen durch und verwenden Sie nicht redundante Proteine (nr) in C. reinhardtii (taxid:3055), um Kandidatengene zu identifizieren, die mit der Reaktion assoziiert sind12.
  4. Manuelles Kuratieren von PSI-BLAST-Treffern mit E-Werten von < 0,05 auf Relevanz für die gesuchte EC-Nummer, indem Sie diese BLAST-Treffer über EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search) oder InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) Proteindomänenvorhersageserver abfragen. Beachten Sie, dass die letzten beiden Scans kritische Schritte sind, um die Identifizierung der korrekten enzymatischen Aktivität für das Protein sicherzustellen.

4. Modellverfeinerung und -bewertung

  1. Verwenden Sie die neueste COBRA Toolbox v.3.028in MATLAB29,30-Plattform, um die folgenden Schritte zur Modellverfeinerung durchzuführen. Die COBRA Toolbox kann installiert werden, indem Sie die folgenden Schritte ausführen: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . Alternativ beachten Sie, dass die COBRA Toolbox auch in anderen Open-Source-Programmiersprachen wie Python (COBRApy) implementiert ist.31) und ist erhältlich unter: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .
    1. Öffnen Sie nach der Installation der COBRA Toolbox v.3.0 MATLAB und führen Sie den folgenden Befehl aus, um die Toolbox zu initialisieren:
      initCobraToolbox;
    2. Fügen Sie die identifizierten Reaktionen mit ihren zugehörigen Genen zum Stoffwechselmodell hinzu, z. B. iRC1080, indem Sie die COBRA Toolbox-Funktionen addReaction und changeGeneAssociationverwenden. Navigieren Sie zu dem Verzeichnis, das das von http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 heruntergeladene iRC1080-Modell enthält, und führen Sie die folgenden Befehle aus, um das Modell zu laden, umzubenennen und eine neue Reaktion und das zugehörige Gen hinzuzufügen.
      Load('iRC 1080 .mat')
      modelNeu = iRC 1080;
      modelNew = addReaction(modelNew, 'D-ALA 2' , ...
      {'d-ala[c]' , 'atp[c]' , ...
      'D-aladata[c]' , 'adp[c]' , 'pi[c]' , ...
      'h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false);
      modelNEW = changeGeneAssociation(modelNeu, ...
      'D-ALA 2','au.g 14655 _t 1');
    3. In einigen Fällen, in denen der Metabolit nicht intrazellulär produziert, sondern aus dem Medium aufgenommen wird, fügen Sie dem Modell Transportreaktionen für die neuen Metaboliten hinzu. Diese Transportreaktionen stellen die passive Diffusion eines Metaboliten aus dem extrazellulären Medium zum Zytosol dar. Fügen Sie außerdem eine entsprechende künstliche Austauschreaktion mit der addExchangeRxn-Funktion hinzu, um den Metaboliten in das extrazelluläre Medium ein- oder auszugeben.
      modelNew = addReaction(modelNew, 'CYCPt' , ...
      {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)'
      modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]' ,- 1000 ,1000 );
    4. Testen Sie das Verhalten des neuen resultierenden Modells, z. B. iBD1106, indem Sie eine Flussbilanzanalyse (FBA) mit der Funktion optimizeCbModel unter hellen und dunklen Bedingungen zur Maximierung der Biomasse als Zielfunktion durchführen. Für das Lichtwachstum stellen Sie die untere und obere Grenze der PRISM Solar-Litho'-Lichtreaktionen auf 646,07 (maximale Rate) ein. Setzen Sie für dunkles Wachstum die Grenzen aller PRISM-Lichtreaktionen auf Null. Verwenden Sie die zuvor definierte Funktion Biomasse10 für das Wachstum unter dunklen und hellen Bedingungen. Die FBA-Lösung gibt zwei Vektoren aus, die den Reaktionsflüssen (solution.v) und den reduzierten Kosten (solution.w) entsprechen, sowie einen Vektor, der den Schattenpreisen der Metaboliten entspricht (solution.y).
      %Wachstum unter Lichtverhältnissen simulieren:
      modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ...
      % "PRISM_solar_litho " , ...
      "PRISM_solar_exo " , ...
      "PRISM_incandescent_ 60 W" , ...
      'PRISM_fluorescent_cool_ 215 W' , ...
      "PRISM_metal_halide " , ...
      "PRISM_high_pressure_sodium " , ...
      "PRISM_growth_room " , ...
      "PRISM_white_LED " , ...
      "PRISM_red_LED_array_ 653 nm" , ...
      "PRISM_red_LED_ 674 nm" , ...
      "PRISM_fluorescent_warm_ 18 W" , ...
      "PRISM_design_growth " , ...
      }, 0, 'b' );
      modelNew = changeObjective(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo');
      FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNew, 'max');
    5. Wiederholen Sie Schritt 4.1.4 für iRC1080, um die für iBD1106 erhaltenen FBA-Lösungen mit denen für iRC1080 zu vergleichen.
    6. Es gibt eine Reihe von COBRA-Methoden, die zum Vergleich von Modellen verwendet werden können (z. B. Flussvariabilitätsanalyse, Gendeletionsstudien, Robustheitsanalysen, Flux-Split-Vorhersagen, FBA, Sampling usw.). Ausführliche Tutorials finden Sie unter https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. Hier wird ein Beispiel gegeben, bei dem das iRC1080-Modell mit seiner verfeinerten Version, iBD1106, verglichen wird, indem die Schattenpreise (Sensitivität der Biomasse-Zielfunktion gegenüber Änderungen der Systemvariablen) der in jedem Modell berücksichtigten Metaboliten ermittelt werden.
      Erhalten Sie die Schattenpreise für die Metaboliten:
      shadowPrices = table(modelNew.mets, ...
      modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);

Ergebnisse

Phänotyp Microarray Screening der Modellalge Chlamydomonas reinhardtii
Die PM-Assays testen die Fähigkeit der Alge, verschiedene Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor in einem minimalen Medium zu nutzen. In dieser Methodenbeschreibung zeigten wir, wie PM-Assays verwendet wurden, um den Kohlenstoff- und Stickstoffstoffwechsel zu identifizieren. Die Kohlenstoff- und Stickstoffnutzungskinetik wurde mit einem Mikrotiterplattenleser gemessen. Die Daten wurden mit einer PMI-Software analysiert. Die zusammenfassende Kinetik ausgewählter PM-Assay-Platten (PM01 und PM03) ist in Abbildung 1 dargestellt. Die "xy-Diagramme" zeigen die Atmungsmessungen im Laufe der Zeit, die für die Assays der 96-Well-Platten gezeichnet wurden, wobei die y-Achse und die x-Achse die Werte der Rohmessungen bzw. der Zeit darstellen. Die Daten wurden in ein Heatmap-Muster umgewandelt, um die Zusammenstellung der kinetischen Daten vergleichend zu analysieren.

Die Pipeline zur Verfeinerung des metabolischen Netzwerks im Genommaßstab unter Verwendung von PM-Daten (Abbildung 2) veranschaulicht die Integration der Hochdurchsatz-PM-Assays mit experimentellen Beweisen aus genomischen Suchen, die ein metabolisches Netzwerkmodell erweitern können.

Um die Reproduzierbarkeit der PM-Daten aus PM01- 04- und PM10-Platten zu bestimmen, wurde eine lineare Regression analysiert, um die Daten aus zwei unabhängigen Replikationsexperimenten gegeneinander darzustellen (Abbildung 3). Abbildung 3 zeigt, dass die Mehrzahl der Daten nahezu ähnlich war, da sie auf die 45°-Linie fallen, wobei nur wenige Ausreißer vorhanden waren und ihr BestimmtheitskoeffizientR2 0,9 betrug. Die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Experimente für die Alge wird durch dieses Diagramm verifiziert.

Identifizierung neuer Metaboliten
Der PM-Assay identifizierte 662 Metaboliten in sieben Platten; PM01-PM04 und PM06-PM08, während die Gaschromatographie Time-Of-Flight (GC-TOF) 77 Metaboliten identifiziert hatte32 (Abbildung 4). Beim Vergleich dieser beiden Sätze mit den 1068 Metaboliten, die im iRC1080 berücksichtigt wurden, überlappten sich nur sechs Metaboliten zwischen den drei Sätzen und 149 überlappten sich zwischen dem iRC1080 und dem PM. Dieses Ergebnis zeigt, dass die metabolische Profiling-Plattform eine bedeutende Quelle für neue metabolische Informationen sein kann.

Essigsäure war die einzige Kohlenstoffquelle, die in der Platte PM01 als Unterstützender Kohlenstoff nachgewiesen wurde, nachdem das Hintergrundsignal subtrahiert wurde. Dieser Befund stimmt mit der Literatur33 überein und zeigt die Spezifität der PM-Assays. Die PM-Assays zeigten neue Schwefel-, Phosphor- und Stickstoffquellen, die C. reinhardtii für das Wachstum nutzen kann. Die Schwefelmetaboliten waren Sulfat, Thiosulfat, Tetrathionat und DL-Lipoamid. Die Phosphorquellen waren Thiophosphat, Dithiophosphat, D-3-Phospho-Glycerinsäure und Cysteamin-S-Phosphat. Die Stickstoffquellenmetaboliten waren L-Amino- und D-Aminosäuren, einschließlich weniger häufiger Aminosäuren; L-Homoserin, L-Pyroglutamin, Methylamin, Ethylamin, Ethanolamin und D, L-α-Aminobuttersäure und 108 Dipeptide und fünf Tripeptide (Tabelle 1). Alle 128 neu identifizierten Metaboliten wurden in KEGG und MetaCyc auf ihre assoziierten Reaktionen, EC-Nummern und Signalwege untersucht.

Die neuen 128 Metaboliten waren mit 49 eindeutigen EC-Nummern assoziiert. Von diesen wurden 15 ECs mit ihren genomischen Beweisen in Verbindung gebracht, indem sie fünf Quellen verwendeten, darunter: Phytozome Version 10.0.234 JGI Version 435, AUGUSTUS 5.0 und 5.210 Anmerkungen von Manichaikul et al. 36 und KEGG13. Metaboliten ohne genomische Evidenz wurden in die Universal Protein Resource Website (UniProt, http://www.uniprot.org/)37,38 eingegeben, wo ihre verwandten Sequenzen in anderen Organismen gefunden wurden. Homologe Sequenzen in C. reinhardtii wurden durch Ausführen von positionsspezifischem iteriertem BLAST (PSI-BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) von der NCBI-Website identifiziert, wobei nur Sequenzen berücksichtigt wurden, die signifikante Alignments erzeugten (E-Wert <0,005).

Modellverfeinerung
Reaktionen, die mit den neuen 128 Metaboliten assoziiert sind, wurden zusammen mit ihren kodierten Genen dem iRC1080-Modell hinzugefügt, wodurch das Netzwerk erweitert wurde. Das resultierende Modell iBD1106 umfasst 2.444 Reaktionen, 1.959 Metaboliten und 1.106 Gene (Tabelle 2). Die neuen 254 hinzugefügten Reaktionen waren 20 Aminosäureoxidationsreaktionen, 108 Dipeptidhydrolysereaktionen, fünf Tripeptidhydrolysereaktionen und 120 Transportreaktionen, kodiert von vier Genen (Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3).

Insgesamt 113 hinzugefügte neue Reaktionen sind für die Hydrolyse von Dipeptiden und Tripeptiden verantwortlich. Die Hydrolyse von Dipeptiden und Tripeptiden ist mit zwei Genen assoziiert, einem für Dipeptide (Cre02.g078650.t1.3) und einem für Tripeptide (Cre16.g675350.t1.3).

In Bezug auf Phosphorquellen wurde eine Reaktion zur Hydrolyse von Cysteamin-S-Phosphat in Cysteamin und Phosphat hinzugefügt, die mit dem Gen JLM_162926 assoziiert ist.

Das WoLF PSORT-Tool39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) und die von Ghamsari et al. berichteten Ergebnisse. 35 wurden angewendet, um die Spezifikation der zellulären Kompartimente zu erhalten, in denen die neuen Reaktionen stattfinden. Durch die Analyse von Proteinsequenzen, die mit den neuen Reaktionen assoziiert sind, sagte WoLF PSORT Zytosol als zelluläres Kompartiment für die Reaktionen voraus.

Ein generiertes Stoffwechselmodell kann Lücken enthalten, wenn die biochemischen Informationen unvollständig sind. In solchen Fällen wird gapFind, ein COBRA-Befehl, verwendet. Es listet Wurzellücken auf und ermöglicht die Identifizierung neuer Lücken, die in das neue Modell eingeführt werden. Die Metaboliten, die in einem Stoffwechselmodell nicht produziert werden können, werden als Wurzellücken40,41bezeichnet. Die Analyse der Wurzellücke ergab, dass sowohl die Modelle iRC1080 als auch iBD1106 die gleichen 91 Lücken enthalten. Dies zeigt, dass die Zugabe der neuen Metaboliten und der damit verbundenen Reaktionen keine zusätzlichen Wurzellücken verursachte. Es sollte beachtet werden, dass die in diesem Protokoll verwendete Phänotypisierungsmethode keine Wurzellücken schließt, da den ursprünglichen Wurzellückenmetaboliten Transport- oder Produktionsmechanismen fehlen, die in den Phänotypisierungsassays nicht behandelt wurden. Die Flussbilanzanalyse wurde durchgeführt, um das Stoffwechselverhalten von iBD1106 unter hellen und dunklen Bedingungen zu testen; (kein Acetat) bzw. (mit Acetat). Der Algorithmus maximiert die Biomasse-Vorläuferreaktionen für eine objektive Funktion (Biomassewachstum). Um die Beteiligung jedes Metaboliten an der eingestellten Zielfunktion zu bewerten, wurden "Schattenpreise" für alle Metaboliten berechnet. Die Änderung der Zielfunktion bezüglich der Flussänderungen des Metaboliten definiert den Schattenpreis eines Metaboliten30,42. Der Hinweis, ob ein Metabolit die Zielfunktion "überzählig" oder "einschränkt", kann durch Schattenpreisanalyse, z.B. Biomasseproduktion, bestimmt werden. Negative oder positive Schattenpreiswerte zeigen Metaboliten, die bei Addition die Zielfunktion verringern oder erhöhen. Nullwerte von Schattenpreisen zeigen Metaboliten, die die Zielfunktion nicht beeinflussen. Der Vergleich der Schattenpreise zwischen iBD1106 und iRC1080 in Abbildung 5 zeigt, dass bei den meisten Metaboliten keine signifikante Veränderung beobachtet wird; Unterschiede finden sich jedoch in 105 bzw. 70 Fällen unter hellen bzw. dunklen Wachstumsbedingungen. Tabelle 4 enthält Beispiele für solche Metaboliten.

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Abbildung 1: Phänotypische Microarray-Profilierung von C. reinhardtii. Atmungs-XY-Plots und Level-Plots der PM01 (Kohlenstoffquellen; A, C) und PM03 (Stickstoffquellen; B, D) Assay-Platten werden gezeigt. Die Abbildung ist ein 8x12-Array, bei dem jede Zelle eine Well-Plate und damit einen gegebenen Metaboliten oder eine Wachstumsumgebung darstellt. Innerhalb jeder Zell- oder Vertiefungsdarstellung stellen Kurven die Farbstoffumwandlung durch Reduktion (y-Achse) als Funktion der Zeit (x-Achse) dar. PM-Atmungskurven aus dem CC-503 und den rohen Vertiefungen sind in jeder Zelle dargestellt und werden durch Farbe angezeigt (türkisfarbene Farbe steht für leere Vertiefungen und violette Farbe für CC-503). Das Level-Diagramm stellt jede Atmungskurve als dünne horizontale Linie dar, die sich im Laufe der Zeit verfärbt (oder unverändert bleibt). Heatmap-Farbänderungen reichen von hellgelb (wenig bis keine Atmung hat stattgefunden) zu dunkelorange oder braun (signifikante Atmung hat stattgefunden). Die von C. reinhardtii (CC-503) verwendeten Metaboliten und die leeren Platten sind dargestellt. Diese Abbildung stammt aus einer zuvor veröffentlichten Arbeit von Chaiboonchoe et al. 12Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

figure-results-10657
Abbildung 2:Genom-dimensionale metabolische Netzwerkverfeinerungspipeline unter Verwendung von PM-Daten. Nachdem eine neue Verbindung in einem PM-Assay positiv getestet wurde, werden ihre Enzymkommissionsnummer (EC), reaktion und ihr Signalweg aus verfügbaren Datenbanken, z. B. KEGG und MetaCyc, identifiziert. Genomische Beweise werden dann aus Genom- und Annotationsressourcen extrahiert, sofern verfügbar und stellen eine Verbindung zwischen Genotyp und Phänotyp dar. Wenn der direkte genomische Nachweis nicht verfügbar ist, wird die Proteinsequenz anhand der EC-Nummern identifiziert und der genetische Nachweis wird über PSI-Blast identifiziert. Das rekonstruierte Stoffwechselnetzwerk wird dann auf Basis neu identifizierter Verbindungen verfeinert, jedoch erst nach einem Qualitätskontrollschritt, bei dem die Proteindomänen anhand relevanter Datenbanken abgefragt werden. Diese Zahl wurde gegenüber zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. 12Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

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Abbildung 3: Reproduzierbarkeit von PM-Tests. Die PMI-Werte wurden über einen Zeitraum von 168 Stunden gesammelt und die maximalen PMI-Werte wurden für zwei Wiederholungsstudien aufgetragen. Jede Achse stellt die maximalen PMI-Werte für jede Studie dar (die x-Achse ist eine Replikatstudie und die y-Achse eine andere). Reproduzierte Werte sind von jeder Achse gleich weit entfernt. Jeder Punkt stellt einen einzelnen Maximalwert dar. Die lineare Regression wurde von einer Tabellenkalkulationssoftware durchgeführt, und der resultierende Bestimmtheitskoeffizient(R2)wird angezeigt. Diese Zahl wurde gegenüber zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. 12Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

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Abbildung 4: Venn-Diagramm der Metaboliten. Das Venn-Diagramm listet Metaboliten auf, diedurch PM-Platten, das i RC1080-Stoffwechselmodell und Gaschromatographie-Time-of-Flight-Experimente (GC-TOF) identifiziert wurden. Jeder Kreis gibt die Gesamtzahl der Metaboliten an, die in der jeweiligen Untersuchungsmethode vorhanden sind. Gleichzeitig stellen die überlappenden Regionen die Anzahl der Metaboliten dar, die zwischen diesen Methoden geteilt werden. Das iRC1080 Stoffwechselmodell enthält insgesamt 1.068 einzigartige Metaboliten. Der GC-TOF identifizierte insgesamt 77 Metaboliten32, während insgesamt 662 Metaboliten mit den PM-Platten identifiziert wurden. Diese Zahl stammt aus zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. 12Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-14314
Abbildung 5: Schattenpreise von Metaboliten in iRC1080 und iBD1106 unter verschiedenen Bedingungen für die Biomassemaximierung. Jeder Kreis auf den "Radardiagrammen" entspricht einem Schattenpreiswert, während jede Linie, die sich von der Mitte eines Diagramms erstreckt, einen Metaboliten anzeigt. (A) Schattenpreise und Stoffwechselverhalten von iRC1080 und iBD1106 unter leichten Wachstumsbedingungen; (B), unterschiedliche Stoffwechselverhalten von iRC1080 und iBD1106 unter einer dunklen Wachstumsbedingung. Diese Zahl stammt aus zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. 12Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Biologie ChemieEG* Gen-AnnotationPSI-BLAST
Cysteamin-S-Phosphat3.1.3.1JLM_1629261,2,3,4
Tetrathionat1.8.2.2unbedeutender E-Wert
1.8.5.2unbedeutender E-Wert
D-Alanin1.4.1.1XP_001700222.1
1.5.1.22fehlgeschlagene manuelle QC
2.1.2.7unbedeutender E-Wert
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
2.3.2.10unbedeutender E-Wert
2.3.2.14unbedeutender E-Wert
2.3.2.16unbedeutender E-Wert
2.3.2.17unbedeutender E-Wert
2.3.2.18unbedeutender E-Wert
2.6.1.21fehlgeschlagene manuelle QC
3.4.13.22XP_001698572.1, XP_001693532.1, XP_001701890.1, XP_001700930.1
3.4.16.4Chlre2_kg gerüst_ 140000391,2,3
3.4.17.8fehlgeschlagene manuelle QC
3.4.17.13unbedeutender E-Wert
3.4.17.14unbedeutender E-Wert
4.5.1.2unbedeutender E-Wert
6.1.1.13fehlgeschlagene manuelle QC
6.1.2.1fehlgeschlagene manuelle QC
6.3.2.4au.g14655_t11,2,3
6.3.2.10fehlgeschlagene manuelle QC
6.3.2.16unbedeutender E-Wert
6.3.2.35unbedeutender E-Wert
D-Asparagin1.4.5.1unbedeutender E-Wert
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
3.1.1.96unbedeutender E-Wert
2.3.1.36unbedeutender E-Wert
1.4.99.1XP_001692123.1
3.5.1.77e_gwW.1.243.11,2
3.5.1.81unbedeutender E-Wert
5.1.1.10fehlgeschlagene manuelle QC
D-Asparaginsäure6.3.1.12unbedeutender E-Wert
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
D-Glutaminsäure1.4.3.7unbedeutender E-Wert
1.4.3.3unbedeutender E-Wert
D-Lysin5.4.3.4unbedeutender E-Wert
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
6.3.2.37fehlgeschlagene manuelle QC
D-Serin2.7.11.8unbedeutender E-Wert
2.7.11.17Cre12.g486350.t1.31,2,3,4
3.4.21.78fehlgeschlagene manuelle QC
3.4.21.104fehlgeschlagene manuelle QC
4.3.1.18g6244.t14 fehlgeschlagene manuelle QC
6.3.2.35unbedeutender E-Wert
6.3.3.5unbedeutender E-Wert
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
D-Valin1.21.3.1fehlgeschlagene manuelle QC
6.3.2.26fehlgeschlagene manuelle QC
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
L-Pyroglutaminsäure
Thiophosphat
Dithiophosphat
Ethylamin6.3.1.6
D,L-a-Amino-Buttersäure2.1.1.49unbedeutender E-Wert
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
Dipeptid3.4.13.18Cre02.g078650.t1.31
Tripeptid3.4.11.4Cre16.g675350.t1.31

Tabelle 1: Liste der identifizierten Metaboliten zur positiven Substratverwertung (C, P, S, N), die im metabolischen Modell iRC1080 nicht vorhanden sind.  *Die Reaktion war nicht eingeschlossen, wenn kein Gen identifiziert wurde.  1. Phytozom Version 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii).   arabische Ziffer JGI Version 4 35.  Nr. 3 Augustus Version 510.  Nr. 4 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html).  Nr. 5 JGI Version 3.136.  Diese Tabelle stammt aus zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. Nr. 12

ModellReaktionenMetabolitenGene
iRC10802,1911,7061,086
iBD11062,4451,9591,106

Tabelle 2: Inhalt von iRC1080 und iBD1106.  Diese Tabelle stammt aus zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. Nr. 12

Kategorie oder Klasse von ReaktionenAnzahl der Reaktionen
Aminosäuren20
Dipeptide108
Tripeptide5
Transportreaktion120

Tabelle 3: Zusammenfassung der neuen Reaktionen in iBD1106. Diese Tabelle stammt aus zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. Nr. 12

WachstumsbedingungMetabolitNameiRC1080iBD1106
4r5au4-(1-D-Ribitylamino)-5-Aminouracil00.168
5aprbu5-Amino-6-(5'-phosphoribitylamino)uracil-0.0090.158
Lichtpa1819Z18111Z1-(9Z)-Octadecenoyl,2-(11Z)-Octadecenoyl-sn-glycerin3-phosphat-0.009-0.65
Dunkel4abut4-Aminobutanoat0.18-0.05

Tabelle 4: Beispiel für signifikante Schattenpreise für iRC1080 und iBD1106. Diese Tabelle stammt aus zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. Nr. 12

Diskussion

Die metabolische Phänotypisierung der grünen Mikroalge, C. reinhardtii,wurde hier unter Verwendung von Hochdurchsatz-PM-Assay-Platten und einem unveränderten PMI beschrieben. Die Assays wurden für insgesamt 190 Kohlenstoffquellen (PM01 und PM02), 95 Stickstoffquellen (PM03), 59 Phosphorquellen und 35 Schwefelquellen (PM04) sowie Peptidstickstoffquellen (PM06-08) verwendet. Eine positive Atmung wurde für 148 Nährstoffe beobachtet (ein positiver Assay für die C-Source-Nutzung, vier positive Assays für jede S-Source- und P-Source-Nutzung und 139 positive Assays für die N-Source-Nutzung). Die Substrate oder Nährstoffe (Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor oder Schwefel) des Mediums sollten dem definierten Medium nicht zugesetzt werden, wenn sie auf die relevanten PM-Mikroplatten aufgetragen werden, die für jede dieser Quellen getestet werden.

Die hier gezeigte Methode ist wirksam für die Charakterisierung von metabolischen Mikroalgen-Phänotypen, die verwendet werden können, um bestehende metabolische Netzwerkmodelle zu erweitern oder die Rekonstruktion neuer Modelle zu steuern. Da die Ernährungsbedürfnisse der meisten Mikroalgen nicht bekannt sind, kann diese Plattform verwendet werden, um diese schnell zu definieren. Nelson et al. 43 hatte diese Methoden erfolgreich angewendet, um neue Verbindungen zu identifizieren, die das Wachstum der Mikroalge Chloroidium sp. UTEX 3007 unterstützen, und die erhaltenen Informationen verwendet, um die Spezieseintrittsmetaboliten zu definieren, die im Gegensatz zu Chlamydomonas 40 verschiedene Kohlenstoffquellen umfassen.

Eine wesentliche Einschränkung des PM für die Profilierung von Mikroalgen besteht darin, dass das PMI in der Inkubationskammer keine Beleuchtung hat und die Mikroalgen in der Lage sein müssen, einen heterotrophen Stoffwechsel durchzuführen. Die Abwesenheit von Licht könnte die Interpretation von Modellen beeinflussen, die Licht zur Berechnung von Stoffwechselflüssen einbeziehen. Genpaare mit koordinierenden Funktionen haben sich zu metabolischen Netzwerkknotenpunkten entwickelt, und die Unterscheidung zwischen photosynthetischen und nicht-photosynthetischen Netzwerkknotenpunkten kann vorgenommen werden44. Im Allgemeinen würden photosynthetische Netzwerk-Hubs (d. H. Stark verbundene Knoten im Modell) aus heterotrophen Modellen ausgeschlossen. Aus praktischen Gründen sollte die Modellierung des Heterotrophismus in mixotrophen Spezies Reaktionen auslassen, von denen bekannt ist, dass sie durch Licht angetrieben werden, und die Energiebilanzunterschiede zwischen den Bedingungen berücksichtigen. Somit ist die Modellierung des lichtabhängigen und lichtunabhängigen Stoffwechsels Standardpraxis in der Chlamydomonas Stoffwechselmodellierung6,45.

Einige grüne Mikroalgen, wie Trebouxiophyten, sind dafür bekannt, eine Vielzahl von Kohlenstoffmolekülen für das Wachstum zu assimilieren, und es wird angenommen, dass dies aus ihrer langen Evolutionsgeschichte als Mitglieder von Flechten46entstanden ist. Während Chlorophyten wie Chlamydomonas Acetat für das Wachstum verwenden können, kann die braune marine Mikroalge Tisochrysis lutea, die für ihr Potenzial bekannt ist, sehr langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren (VLC-PUFAs) kommerziell zu produzieren, kein Acetat verwenden, kann aber Glycerin für das Wachstum verwenden47. Die Biomassekonzentration von mehr als 100 g l−1 Trockenzellgewicht wurde mit Chlorella unter optimierter Zugabe organischer Kohlenstoffquellen in einem Fed-Batch-Modus48erreicht. Darüber hinaus kann die Zugabe von Zucker zu Chlorellavulgaris seine Bindung von CO2erhöhenund so einen additiven Nutzen während des photosynthetischen Wachstumsbieten 49. Die meisten heterotrophen Mikroalgen können auch mixotroph wachsen, aber es wurde gezeigt, dass der Chlorophyt Chromochloris zofingiensis die Photosynthese bei Zugabe von Zuckerabschaltet 50.

Kieselalgen, die zur Abteilung Bacillariophyta gehören, sind eine Hauptgruppe des Phytoplanktons. Obwohl die meisten Kieselalgen nur photoautotroph wachsen können, können einige von ihnen mixotroph oder heterotroph kultiviert werden51. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass Glycerin das Wachstum im Licht in Abwesenheit von CO2 in einigen Kieselalgen unterstützt, einschließlich der Modellspezies Phaeodactylum tricornutum52. Auch einige benthische Kieselalgen wie Nitzschia linearis können auf Kohlenhydraten im Dunkeln wachsen53. Es ist wahrscheinlich, dass die PM-Assays auf Kieselalgen und andere Algengruppen ausgedehnt werden, indem geeignete organische Kohlenstoffquellen ergänzt werden, damit die Zellen heterotroph wachsen können, und eine Mixotrophiestrategie kann möglicherweise auch für die obligat autotrophen Mikroalgen verwendet werden, die eine minimal erforderliche Lichtversorgung bereitstellen.

Um die Reproduzierbarkeit der Daten zu beurteilen, wird dringend empfohlen, für alle Platten Doppelteinassays durchzuführen. Ein Assay kann nur dann als positiv angesehen werden, wenn nach Subtraktion von der Negativkontrolle und den jeweiligen Blindbohrungen die Absorption (PMI-Wert) positiv ist. Diese Beschreibung ist in Gegenwart der getesteten Verbindung ein Spiegelbild der abiotischen Reaktion des Farbstoffs mit dem Medium.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Maßgeblich unterstützt wurde diese Arbeit durch das NYUAD Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), das von Tamkeen im Rahmen des Stipendiums des New York University Abu Dhabi Research Institute (73 71210 CGSB9) und der NYU Abu Dhabi Faculty Research Funds (AD060) finanziert wurde. W.F. wurde zusätzlich durch das Hundred Talents Program der Zhejiang University unterstützt. Wir danken Ashish Jaiswal für die Hilfe bei der Aufnahme des Videos. Wir danken Hong Cai für die Generierung der metabolischen Phänotypdaten.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinVWR97062-796
Biolog assay plates [ PM01-08]Biolog, Hayward, CA, USA
Biolog Omnilog InstrumentBiolog, Hayward, CA, USA
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.Regents of the University of Minnesota
KanamycinVWR0408-EU-10G
Tetrazolium Violet Dye “D”Biolog, Hayward, CA, USA
TimentinGlaxoSmithKline Australia Pty Ltd42010012-2

Referenzen

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