Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בפלטפורמת טכנולוגיית microarray פנוטיפ (PM) כדי להגדיר דרישות מטבוליות של כלמידומונס ריינהרדטי, מיקרו-ריאלגה ירוקה, ולחדד מודל רשת מטבולית קיים.

Abstract

מודלים מטבוליים משוחזרים על בסיס ביאור הגנום הזמין של אורגניזם ומספקים כלים חזויים לחקר תהליכים מטבוליים ברמת המערכות. מודלים מטבוליים בקנה מידה גנומי עשויים לכלול פערים, כמו גם תגובות שאינן מאומתות באופן ניסיוני. מודלים משוחזרים של מינים מיקרו-גלגליים מבודדים חדשים יגרמו לחולשות בשל פערים אלה, שכן בדרך כלל יש ראיות ביוכימיות דלילות זמינות לחילוף החומרים של מבודדים כאלה. טכנולוגיית הפנוטיפ microarray (PM) היא שיטה יעילה, תפוקה גבוהה הקובעת פונקציונלית פעילויות מטבוליות הסלולר בתגובה למגוון רחב של מטבוליטים כניסה. שילוב של בדיקות פנוטיפיות בתפוקה גבוהה עם מידול מטבולי יכול לאפשר מודלים קיימים של רשת מטבולית להיות משוחזרים במהירות או ממוטבים על ידי מתן ראיות ביוכימיות כדי לתמוך ולהרחיב ראיות גנומיות. עבודה זו תציג את השימוש בבדיקות PM לחקר אצות מיקרו באמצעות מינים מודל מיקרו-גלרי ירוק Chlamydomonas reinhardtii כדוגמה. ראיות ניסיוניות עבור מעל 254 תגובות שהושגו על ידי PM שימש במחקר זה כדי להרחיב ולזקק מודל רשת מטבולית בקנה מידה גנום C. reinhardtii, iRC1080, על ידי כ 25 אחוזים. הפרוטוקול שנוצר כאן יכול לשמש כבסיס ליצירת פרופיל תפקודי של חילוף החומרים של מיקרו-אצות אחרות, כולל מוטציות מיקרו-אצות ידועות ומבודדים חדשים.

Introduction

אופטימיזציה של חילוף החומרים האצות לייצור משופר ויציב של מטבוליטים ממוקדים דורש פיתוח של אסטרטגיות הנדסיות מטבוליות מורכבות באמצעות ניתוחים ברמת המערכות של רשתות מטבוליות. מודלים של רשת מטבולית יכולים להנחות את העיצובים הרציונליים לפיתוח מהיר של אסטרטגיותאופטימיזציה 1,2,3,4. למרות כ 160 מינים microalgal כבררצף 5, יש, למיטב ידיעתנו, רק 44 מודלים מטבוליים אצות זמין4,6,7. בשל הקושי להשיג נתונים פנוטיפיים מטבוליים בעלי תפוקה גבוהה לאימות ניסיוני של מידע גנומי, שחזור מודלים איכותיים של רשת מפגר מאחורי ההתפתחות המהירה של ריצוף הגנום האצות.

C. reinhardtii היא מערכת מודל אטרקטיבית למחקרים מבוססי אצות. מין זה יכול לגדול פוטואוטוטרופית או הטרוטרופית והיה בשימוש נרחב כאורגניזם מודל במחקר בסיסי ויישומי. רצף הגנום שלה פורסם בשנת 20078, עם מודלים מטבוליים בקנה מידה גנום לאחר מכן שוחזר עבור המינים9,10,11. המודל בקנה מידה הגנום עבור C. reinhardtii (iRC1080) שוחזר על ידי צ'אנג ואח '. 10 מבוסס על עדויות גנומיות וספרותיות (הכרואות כ -250 מקורות). יש לו 1,706 מטבוליטים עם 2,190 תגובות10; עם זאת, לא ניתן היה לאמת את שלמות המודל מעבר לראיות הניסוייות הזמינות שפורסמו באותה עת.

טכנולוגיית המיקרואורגניזמים הפנוטיפ (PMs) היא פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה שיכולה לספק מידע פרופיל מטבולי עבור מיקרואורגניזמים הטרוטרופיים כמו גם תאים של תרבית רקמות. בפרט, ניתן להשתמש בו כדי לטפל בפער הידע פנוטיפ לגנוטיפ במיקרו-אצות, כפי שדווח לראשונה עבור כלמידומונס ריינהרדטי12 ולאחר מכן עבור מין של כלורוידיום13 וכלורלה14. על ידי לימוד תגובות תאים לאלפי מטבוליטים, מולקולות איתות, אוסמוליטים ומולקולות אפקטים, בדיקות ראש הממשלה יכולות לספק פרופיל מטבולי תפקודי ולהציע תובנות על התפקוד, חילוף החומרים והרגישות הסביבתית15,16,17. באופן ספציפי, בדיקות PM לזהות ניצול מטבוליט תאים 96-היטב microplates עם חומרים מזינים שונים, מטבוליטים, או osmolytes הכלולים בכל באר. יתר על כן, ניתן גם לאתחל מולקולות ביואקטיביות, כגון אנטיביוטיקה והורמונים. כפי שנקבע על ידי עוצמת ייצור הצבע על ידי הפחתת NADH של צבע redox מבוסס טטרזוליום, ניצול מטבולי של מצעים מוערך במונחים של נשימה התא15,16,17. הניסויים במיקרו-לוחות 96-באר ניתן לפקח ולהיקבע באופן אוטומטי לאורך זמן עם פלטפורמת מכשיר microarray פנוטיפ (PMI). עשרים מיקרו-לוחות בעלי 96 באר נועדו לייצג את המטבוליטים הנפוצים לחקר פנוטיפים תאיים כדי להשתמש במקורות פחמן, חנקן, גופרית וזרחן, יחד עם השפעות אוסמוטיות/יונים ו-pH שונות. טכנולוגיית PM שימשה בהצלחה לעדכון ושדרוג של מספר מודלים מטבוליים קיימים בקנה מידה גנומי עבור מיקרואורגניזמים15,16,17,18.

הפרוטוקול והנתונים המוצגים כאן מבוססים על עבודה שפורסמה בעבר על ידי Chaiboonchoe et al. 12 העבודה המוצגת מפרטת את השימוש בשיטת בדיקות PM כדי לאפיין את הפנוטיפים המטבוליים של מיקרו-אצות ולהרחיב מודל מטבולי אצות קיים של C. reinhardtii וכן להנחות את השחזור של מודלים מטבוליים חדשים.

Protocol

1. ניסויי מיקרוארייה פנוטיפ

  1. להשיג C. reinhardtii זן CC-503 ממרכז המשאבים כלמידומונס באוניברסיטת מינסוטה, ארה"ב (https://www.chlamycollection.org).
  2. לגדל את התאים טריס-אצטט-פוספט טרי (TAP) מדיה19 עם ריכוזים סופיים של 400 מיקרוגרם / מ"ל timentin, 50 מיקרוגרם / mL אמפיצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin (כדי לעכב צמיחה חיידקית) תחת 400 פוטונים מיקרומול / מ'2s, ב 25 °C (C), במשך יומיים עד שלב אמצע היומן.
  3. לסובב את התרבות ב 2,000 x g במשך 10 דקות ב 22 °C (70 °F) ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור.
  4. הכן מדיית TAP טרייה המכילה 0.1% צבע סגול טטרזוליום "D".
    הערה: שנה את מדיית TAP בשלב זה כדי לא לכלול חומרים מזינים מסוימים בהתאם לקטגוריית המטבוליט שנבדקה בכל צלחת (לדוגמה, אל תכלול אמוניום כלוריד עבור לוחות מקור חנקן).
  5. resuspend הכדור במדיה TAP טרי מוכן (מן שלב 1.2) לריכוז סופי של 1 x 106 תאים / מ"ל.
  6. השתמש לוחות בדיקה מערך תרכובות כימיות (מקורות פחמן, מקורות חנקן, זרחן ומקורות גופרית לוחות, ומקורות חנקן פפטיד).
  7. לחסן 100 μL aliquot של מדיה המכילה תאים לתוך כל באר של לוחות ההסתה.
    הערה: הקפד לשכפל את ההסתה.
  8. תאי פס על תמצית שמרים / לוחות פפטון ולבצע כתמי גרם, כמו סמית ואח '. 20 לפני ואחרי הבחינה כדי לפקח על זיהום חיידקי.
  9. הכנס את מערך הכימיקלים צלחות בדיקה לתוך מערכת קורא מיקרופלסטית.
  10. לדגור על כל הלוחות ב 30 °C (7 ימים) ולתכנת את מערכת קורא microplate לקרוא את שינוי צבע הצבע כל 15 דקות.
    הערה: מכיוון שרוב קוראי המיקרו-לוח אינם מספקים מקור לאור מתמשך במהלך הדגירה, האצות אמורות להיות מסוגלות לבצע נשימה הטרוטרופית.

2. ניתוח נתונים

  1. ייצוא הנתונים הקינטיים הגולמיים מקורא המיקרו-לוחיות כקבצי CSV, אשר לאחר מכן ישמשו כקלט לחבילת המיקרוארייה של Omnilog Phenotype Microarray (OPM) ב- R. הוסף את המידע הביולוגי כמטא-נתונים (למשל, ייעוד זן, מדיית צמיחה, טמפרטורה וכו ').
    1. שימוש בתוכנת ממיר הנתונים הקינטית PM; טען את קבצי הנתונים D5E והמירה אותם לקבצי OKA באמצעות שורות הפקודה הבאות בתוכנת הניתוח הקינטי PM:
      טען | יבא (אתר את התיקיה של קבצי OKA) | אכלס מסננים | יבא | הוסף את כל הלוחות | קרוב.
      ייצוא | בחר קריאת נתונים (Kinetic), בחר תבנית (CSV) (כותרת טאב)ובחר לוחות (כל צלחת (קבצים בודדים)) | ייצוא | נתונים שמר.
    2. כדי לבצע את ניתוח הנתונים פנוטיפ Microarray (PM), השתמש בחבילת התוכנה OPM21,22 הפועלת בסביבת תוכנת R. החבילה, ההדרכה ותיעוד ההפניה זמינים ב: http://www.goeker.org/opm/. ב- RStudio, ממשק משתמש גרפי עבור R, התקן את חבילת opm ואת יחסי התלות שלה באמצעות הפקודות הבאות:
      מקור (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R)
      library (opm)
    3. נווט לספריה המכילה את קבצי ה- CSV של הנתונים הקינטיים וייבוא הנתונים באמצעות הפונקציהopm read_:
      x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
    4. צבירה ופירוק של הנתונים הקינטיים באמצעות הערכת פרמטרי עקומה.
      עבור (i ב- 1:length(x)) {
      x[[i]] <אני עושה _aggre(x[[i]], אתחול = 0 L, ליבות = 1 L, שיטה = "splines", אפשרויות = set_spline_options("smooth.spline"))
      x[[i]] <- do_disc(x[[i], ניתוק = FALSE)
      }
      #Collection של המטה-נתונים
      < מטה-נתונים- collect_template(".")
      מטה-נתונים$מסנן <- c("BLANK","CC- 503")
      עבור (I ב- 1:length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = מטה-נתונים, החלף = TRUE)}
    5. השתמש בפונקציה xy_plot כדי למפות את מדידות הנשימה (או הצמיחה) (ציר y) כפונקציה של זמן (ציר x) עבור לוחות 96-בארות שנמדדו.
      הדפסה (xy_plot(x[[ 1 ]], כולל ="Strain", .max = FALSE))
    6. דמיין את הנתונים כמפת חום באמצעות הפונקציה level_plot כדי לאפשר סקירה השוואתית מהירה של הנתונים הקינטיים.
      level_plot(x, ראשי = list(), צבעים = opm_opt("color.borders"), panel.headers = מטה-נתונים$זן, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", רווח ="Lab", הטיה = 0.7 , num.colors = 200 L)
    7. לחלץ מידע ביולוגי חשוב, הפרמטרים העקומה, מן העקומות קינטי גלם וכוללים את שלב ההשהיה (λ), קצב הצמיחה (μ), הנשימה התא המרבי (A) ואת השטח מתחת לעקומה (AUC)21. כדי לזהות מטבוליטים חיוביים, השתמש בערכי A של הפקד השלילי, המייצג את התגובה האביוטית של הצבע עם המדיום, בנוסף לריקה של כל צלחת microwell כערכי חיסור רקע. פונקציית החילוץ משמשת להשגת הפרמטר A.
      opm_opt("curve.param")
      param <- לחלץ (x, as.labels = list("Strain"))

3. זיהוי תגובות וגנים הקשורים מטבוליטים חדשים

  1. חפש KEGG (קיוטו אנציקלופדיה של גנים וגנומים) (http://www.genome.jp/kegg/) ומטבוליזם (http://metacyc.org/) כדי לזהות מספרי ועדת אנזימים (ECs) לתגובות באמצעות מטבוליטים שנמצאו מערכי תרכובות כימיות23,2423,24.
  2. השתמש במספרי EC המזוהים כבסיס חיפוש במשאבי ביאור אצות זמינים מרובים כגון מכון הגנום המשותף (JGI), פיטוזום (http://www.phytozome.net) ופרסומים ביקורת עמיתים23,25,26,27.
  3. אם שאילתה אינה מחזירה ראיות גנטיות למספר EC נתון, זהה את החלבונים הקשורים הרלוונטיים באורגניזמים אחרים, החל במינים הקרובים ביותר ל- C. reinhardtii, ולאחר מכן בצע חיפוש מבוסס פרופיל באמצעות שרת NCBI PSI-BLAST עם הגדרות ברירת מחדל והשתמש בחלבונים לא יתירים (nr) ב- C. reinhardtii (taxid:3055) כדי לזהות גנים מועמדים הקשורים לתגובה12.
  4. אצור באופן ידני כניסות PSI-BLAST עם ערכי E של < 0.05 עבור רלוונטיות למספר EC שנבדק באמצעות ביצוע שאילתה על כניסות BLAST אלה באמצעות שרתי חיזוי תחומים של EMBL-EBI (http://pfam.xfam.org/search) או InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/). שימו לב ששתי הסריקות האחרונות הן צעדים קריטיים כדי להבטיח זיהוי של הפעילות אנזימטית נכונה עבור החלבון.

4. עידון והערכה של מודל

  1. השתמש בארגז הכלים העדכני ביותר של קוברה v.3.028במטלב29,30פלטפורמה לביצוע השלבים הבאים לעידון מודל. ניתן להתקין את ארגז הכלים של קוברה על-ידי ביצוע השלבים ב: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . לחלופין, שים לב שארגז הכלים של COBRA מיושם גם בשפות תכנות קוד פתוח אחרות, כגון Python (COBRApy31) וזמין ב: https://opencobra.github.io/cobrapy/.
    1. לאחר התקנת ארגז הכלים COBRA v.3.0, פתח את MATLAB והבצע את הפקודה הבאה כדי לאתחל את ארגז הכלים:
      initCobraToolbox;
    2. הוסף את התגובות המזוהות עם הגנים המשויכים שלהם למודל המטבולי, כגון iRC1080, באמצעות ההוספה של פונקציות ארגז הכלים COBRAהוספת ו- changeGeneAssociation. נווט לספריה המכילה את דגם iRC1080, שהורד מ- http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 ובצע את הפקודות הבאות כדי לטעון את המודל, לשנות את שמו ולהוסיף תגובה חדשה ואת הגן המשויך אליו.
      Load('iRC 1080 .mat')
      modelNew = iRC 1080;
      modelNew = addReaction(modelNew, 'D-ALA 2' , ...
      {'d-ala[c]' , 'atp[c]', ...
      'D-aladata[c]' , 'adp[c]' , 'pi[c]', ...
      'h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false);
      modelNEW = changeGeneAssociation(modelNew, ...
      'D-ALA 2', 'au.g 14655 _t 1' );
    3. במקרים מסוימים כאשר המטבוליט אינו מיוצר תאיים אלא נלקח מהמדיום, הוסף תגובות תחבורה עבור מטבוליטים חדשים למודל. תגובות תחבורה אלה מייצגות דיפוזיה פסיבית של מטבוליט מהמדיום החוץ תאי לציטוסול. בנוסף, להוסיף תגובת חילופי מלאכותית תואמת באמצעות הפונקציה addExchangeRxn כדי להזין או פלט את המטבוליט לתוך המדיום חוץ תאי.
      modelNew = addReaction(modelNew, 'CYCPt', ...
      {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)'
      modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]' ,- 1000 ,1000 );
    4. בדוק את ההתנהגות של המודל החדש הנובע, למשל, iBD1106, על ידי ביצוע ניתוח איזון שטף (FBA) באמצעות הפונקציה optimizeCbModel בתנאים בהירים וכהים למיקסום הביומסה כפונקציה האובייקטיבית. לצמיחה קלה, הגדר את הגבולות התחתונים והעליון של תגובות האור של ה-PRISM solar litho ל-646.07 (שיעור מרבי). לצמיחה כהה, הגדר את גבולות כל תגובות האור של פריזמה לאפס. השתמש בפונקציה ביומסה שהוגדרה בעבר10 לצמיחה בתנאי חושך ואור. פתרון ה- FBA יפיק שני וקטורים המתאימים לשטף תגובה (solution.v) ועלות מופחתת (solution.w), כמו גם וקטור אחד המתאים למחירי הצל של מטבוליטים (solution.y).
      %הדמה צמיחה בתנאי אור:
      modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ...
      % 'PRISM_solar_litho', ...
      "PRISM_solar_exo", ...
      "PRISM_incandescent_ 60 W", ...
      "PRISM_fluorescent_cool_ 215 W", ...
      "PRISM_metal_halide", ...
      "PRISM_high_pressure_sodium", ...
      "PRISM_growth_room", ...
      "PRISM_white_LED", ...
      "PRISM_red_LED_array_ 653 ננומטר," ...
      "PRISM_red_LED_ 674 ננומטר," ...
      "PRISM_fluorescent_warm_ 18 ו', ...
      "PRISM_design_growth", ...
      }, 0, 'b' );
      modelNew = changeObjective(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo');
      FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNew, 'max');
    5. חזור על שלב 4.1.4 עבור iRC1080 כדי להשוות פתרונות FBA שהושגו עבור iBD1106 עם אלה שהושגו עבור iRC1080.
    6. יש מגוון של שיטות COBRA זמין שניתן להשתמש בהם כדי להשוות מודלים (למשל, ניתוח השתנות שטף, מחקרי מחיקת גנים, ניתוחי חוסן, תחזיות פיצול שטף, FBA, דגימה, וכו '). ערכות לימוד מפורטות ניתן למצוא https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. כאן, דוגמה מסופקת כאשר דגם iRC1080 מושווה לגרסה המעודנת שלו, iBD1106, על ידי קבלת מחירי הצל (רגישות של הפונקציה האובייקטיבית ביומסה לשינויים במשתנה המערכת) של המטבוליטים בחשבון בכל דגם.
      להשיג את מחירי הצל עבור מטבוליטים:
      shadowPrices = table(modelNew.mets, ...
      modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);

תוצאות

הקרנת מיקרוארי פנוטיפ של דגם אצות כלמידומונס ריינהרדטי
רה"מ בודק את יכולת האצות להשתמש במקורות שונים של פחמן, חנקן, גופרית וזרחן במדיום מינימלי. בתיאור שיטות זה, הדגמנו כיצד בדיקות PM שימשו לזיהוי חילוף החומרים של פחמן וחנקן. קינטיקה של ניצול פחמן וחנקן נמדדה אצל קורא מיקרו-לוחית. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת PMI. הקינטיקה של לוחות ההסתה שנבחרו של PM (PM01 ו- PM03) מוצגת באיור 1. "קוויזי xy" מציגים את מדידות הנשימה לאורך זמן שרוטלו עבור 96-well לוחות', שבו ציר y וציר x מייצגים את הערכים של מדידות גלם וזמן, בהתאמה. הנתונים הוסבו לתבנית מפת חום כדי לנתח באופן יחסי את ההרכבה של הנתונים הקינטיים.

הצינור של חידוד רשת מטבולית בקנה מידה גנומי באמצעות נתוני PM (איור 2) ממחיש את השילוב של בדיקות PM בעלות תפוקה גבוהה עם ראיות ניסיוניות המסופקות על ידי חיפושים גנומיים שיכולים להרחיב מודל רשת מטבולית.

כדי לקבוע את יכולת השכפול של נתוני PM שהתקבלו מלוחות PM01 - 04 ו- PM10, נותחה רגרסיה ליניארית כדי להתוות את הנתונים משני ניסויי שכפול עצמאיים זה נגד זה (איור 3). איור 3 מראה כי רוב הנתונים היו כמעט דומים כאשר הם נופלים על קו 45°, כאשר רק מעט חריגים היו נוכחים, ומקדם הנחישות שלהם R2 היה 0.9. העקביות והשחזור של הניסויים עבור האצות מאומתות על ידי עלילה זו.

זיהוי מטבוליטים חדשים
ראש הממשלה זיהה 662 מטבוליטים בשבע לוחות; PM01-PM04 ו-PM06-PM08, בעוד כרומטוגרפיה גז זמן טיסה (GC-TOF) זיהה 77 מטבוליטים32 (איור 4). כאשר משווים בין שני סטים אלה עם 1068 מטבוליטים ב- iRC1080, רק שישה מטבוליטים חופפים בין שלושת הסטים, ו -149 חופפים בין iRC1080 לבין PM. תוצאה זו מדגימה כי פלטפורמת הפרופיל המטבולי יכולה להיות מקור משמעותי למידע מטבולי חדש.

חומצה אצטית הייתה מקור הפחמן היחיד שזוהה בצלחת PM01 כפחמן תומך לאחר הפחתה של אות הרקע. ממצא זה עולה בקנה אחד עם הספרות33 ומראה את הספציפיות של בדיקות ראש הממשלה. מומחים חשפו גופרית חדשה, זרחן ומקורות חנקן ש-C. reinhardtii יכול לנצל לצמיחה. מטבוליטים גופרית היו גופרתיים, תיאוסולפט, טטרתיויונט, ו- DL-Lipoamide. מקורות הזרחן היו תיופוספט, דידיופוספט, חומצה זרחנית D-3-זרחן וציסטמין-S-פוספט. מטבוליטים מקור חנקן היו L-אמינו וחומצות אמינו D, כולל חומצות אמינו פחות נפוצות; L-הומוזרין, L-pyroglutamic, מתילאמין, אתילאמין, אתנולמין, ו D, L-α-אמינו-בוטיריק, ו 108 די-פפטידים וחמישה טרי-פפטידים(טבלה 1). כל 128 המטבוליטים שזוהו לאחרונה נבדקו ב- KEGG וב- MetaCyc אחר התגובות, מספרי EC והמסלולים הקשורים שלהם.

128 המטבוליטים החדשים היו קשורים ל-49 מספרי EC ייחודיים. מתוכו, 15 קרנות הון סיכון קושרו לראיות הגנומיות שלהם באמצעות חמישה מקורות כולל; Phytozome גירסה 10.0.234 JGI גירסה 435, AUGUSTUS 5.0, ו 5.210 ביאורים מניקאיקול ואח '. 36 ו KEGG13. מטבוליטים ללא ראיות גנומיות הוזנו לאתר משאבי החלבון האוניברסלי (UniProt, http://www.uniprot.org/)37,38 שבו הרצפים הקשורים שלהם נמצאו באורגניזמים אחרים. רצפים הומולוגיים ב- C. reinhardtii זוהו על ידי הפעלת BLAST איטרציה ספציפי למיקום (PSI-BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) מאתר האינטרנט של NCBI בהתחשב רק ברצפים שיצרו יישור משמעותי (E-value <0.005).

עידון מודל
תגובות הקשורות 128 מטבוליטים החדשים, יחד עם הגנים המקודדים שלהם, נוספו למודל iRC1080, הרחבת הרשת. הדגםi BD1106, שמהווה 2,444 תגובות, 1,959 מטבוליטים ו-1,106 גנים (לוח 2). 254 התגובות החדשות שנוספו היו 20 תגובות חמצון חומצות אמינו, 108 תגובות הידרוליזה di-פפטיד, חמש תגובות הידרוליזה tripeptide, ו 120 תגובות תחבורה, מקודד על ידי ארבעה גנים (Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3).

בסך הכל 113 תגובות חדשות נוספו להסביר הידרוליזה של די-פפטידים וטר-פפטידים. ההידרוליזה של די-פפטידים וטר-פפטידים קשורה לשני גנים, אחד לדי-פפטידים (Cre02.g078650.t1.3) ואחד עבור תלת-פפטידים (Cre16.g675350.t1.3).

לגבי מקורות של זרחן, תגובה הידרוליזה של ציסטמין-S-פוספט לתוך ציסטמין ופוספט נוספה הקשורים הגן JLM_162926.

כלי PSORT של WoLF39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) ותוצאות שדווחו על ידי Ghamsari ואח '. 35 הוחלו כדי לקבל את המפרט של התאים הסלולריים שבהם מתרחשות התגובות החדשות. על ידי ניתוח רצפי חלבונים הקשורים לתגובות החדשות, WoLF PSORT חזה ציטוסול כתא התאי לתגובות.

מודל מטבולי שנוצר עשוי להכיל פערים כאשר המידע הביוכימי אינו שלם. במקרים כאלה, gapFind, פקודת COBRA, משמש. הוא מפרט פערי שורש ומאפשר זיהוי של מבוא פערים חדשים במודל החדש. המטבוליטים שלא ניתן לייצר במודל מטבולי מכונים פערי שורש40,41. ניתוח פער השורש הצביע על כך שגם דגמי iRC1080 וגם iBD1106 מכילים את אותם 91 רווחים. זה מראה כי הוספת מטבוליטים חדשים ואת התגובות הקשורות שלהם לא הציגו פערי שורש נוספים. יש לציין כי שיטת phenotyping המשמש בפרוטוקול זה אינה סוגרת פערי שורש, כי מטבוליטים פער השורש המקורי חסרים מנגנוני תחבורה או ייצור, אשר לא טופלו ב assays phenotyping. ניתוח איזון שטף בוצע כדי לבדוק את ההתנהגות המטבולית של iBD1106 בתנאים בהירים וחשוכים; (ללא אצטט) ו (עם אצטט), בהתאמה. האלגוריתם ממקסם את תגובות מבשר הביומסה לתפקוד אובייקטיבי (צמיחת ביומסה). כדי להעריך את המעורבות של כל מטבוליט לפונקציה האובייקטיבית שנקבעה, חושבו "מחירי צל" עבור כל המטבוליטים. השינוי בתפקוד האובייקטיבי לגבי שינויים שטף של מטבוליט מגדיר את מחיר הצל של מטבוליט30,42. האינדיקציה אם מטבוליט הוא "עודף" או "מגביל" את הפונקציה האובייקטיבית ניתן לקבוע על ידי ניתוח מחיר צל, למשל, ייצור ביומסה. ערכי מחיר צל שליליים או חיוביים חושפים מטבוליטים שעם התוספת, יקטן או יגדיל את הפונקציה האובייקטיבית. אפס ערכים של מחירי צל לחשוף מטבוליטים שלא ישפיעו על הפונקציה האובייקטיבית. ההשוואה בין מחירי הצללים בין iBD1106 ל-i RC1080 באיור 5 מראה כי עבור רוב המטבוליטים, לא נצפה שינוי משמעותי; עם זאת, הבדלים נמצאים 105 ו 70 מקרים בתנאי צמיחה בהירים וחשוכים, בהתאמה. טבלה 4 כוללת דוגמאות של מטבוליטים כאלה.

figure-results-6595
איור 1: פרופיל מיקרו-עראי פנוטיפיק של C. reinhardtii. נשימה XY-plots וחלקות רמה של PM01 (מקורות פחמן; A, C) ו- PM03 (מקורות חנקן; ב, ד) צלחות צ'ק מוצגות. הדמות היא מערך 8x12 שבו כל תא מייצג היטב צלחת, ולכן, מטבוליט נתון או סביבת צמיחה. בתוך כל תא או ייצוג טוב, עקומות מייצגות המרת צבע על-ידי הפחתה (ציר y) כפונקציה של זמן (ציר x). עקומות נשימה PM מן CC-503 ובארות ריקות מוצגים בכל תא מסומנים לפי צבע (צבע צהבהב מייצג בארות ריקות וצבע סגול מייצג CC-503). התוויית הרמה מייצגת כל עקומת נשימה כקו אופקי דק שמשנה צבע (או נשאר ללא שינוי) לאורך זמן. שינויי צבע מפת החום הם מצהוב בהיר (מעט עד ללא נשימה התרחשה) לכתום כהה או חום (נשימה משמעותית התרחשה). מטבוליטים בשימוש על ידי C. reinhardtii (CC-503) ואת הלוחות הריקים מוצגים. נתון זה הוא מתוך עבודה שפורסמה בעבר על ידי Chaiboonchoe ואח '. 12אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

figure-results-7814
איור 2: צינור עידון רשת מטבולית בקנה מידה גנומי באמצעות נתוני PM. לאחר בדיקה מורכבת חדשה חיובית בבדיקת PM, מספר ועדת האנזימים שלה (EC), תגובה, מסלול מזוהים ממסדי נתונים זמינים, למשל, KEGG ו- MetaCyc. ראיות גנומיות מופקות לאחר מכן ממשאבים גנומיים וביאורים כאשר הם זמינים ומהווה קשר בין גנוטיפ לפנוטיפ. כאשר ראיות גנומיות ישירות אינן זמינות, רצף החלבון מזוהה ממספרי EC, וראיות גנטיות מזוהות באמצעות PSI-Blast. לאחר מכן, הרשת המטבולית המשוחזרת מעודנת בהתבסס על תרכובות שזוהו לאחרונה, אך רק לאחר שלב בקרת איכות הכרוך בשאילת שאילתות על תחומי החלבון באמצעות מסדי נתונים רלוונטיים. נתון זה שונה מעבודתו שפורסמה בעבר על ידי Chaiboonchoe et al. 12אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

figure-results-8834
איור 3: שחזור של בדיקות PM. ערכי ה- PMI נאספו על פני תקופה של 168 שעות, וערכי ה- PMI המרביים נותנו לשני מחקרים משוכפלים. כל ציר מייצג את ערכי ה-PMI המרביים עבור כל מחקר (ציר ה-x הוא מחקר אחד משוכפל וציר ה-y אחר). ערכים משוחזרים הם שוות מכל ציר. כל נקודה מייצגת ערך מרבי יחיד. הרגרסיה הליניארית בוצעה על-ידי תוכנת גיליון אלקטרוני, ומקדם הקביעה המתקבל (R2) מוצג. נתון זה שונה מעבודתו שפורסמה בעבר על ידי Chaiboonchoe et al. 12אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

figure-results-9651
איור 4: דיאגרמת ון של מטבוליטים. דיאגרמת ון מונה מטבוליטים שזוהו על ידי לוחות PM, המודל המטבולי iRC1080 וניסויים בכרומטוגרפיה של גז (GC-TOF). כל עיגול מציין את המספר הכולל של מטבוליטים הקיימים בכל שיטת לימוד בהתאמה. יחד עם זאת, האזורים החופפים מייצגים את מספר המטבוליטים המשותפים בין שיטות אלה. המודל המטבולי iRC1080 מכיל סך של 1,068 מטבוליטים ייחודיים. GC-TOF זיהה סך של 77 מטבוליטים32, בעוד שיש בסך הכל 662 מטבוליטים שזוהו באמצעות לוחות PM. נתון זה הוא מעבודה שפורסמה בעבר על ידי Chaiboonchoe ואח '. 12אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10578
איור 5: מחירי צללים של מטבוליטים ב-i RC1080 וב-i BD1106 בתנאים שונים למיקסום ביומסה. כל עיגול על "התוויות מכ"ם" מתאים לערך מחיר צל, בעוד כל שורה המשתרעת ממרכז העלילה מצביעה על מטבוליט. (A) מחירי צללים והתנהגויות מטבוליות של iRC1080 ו-BD1106 בתנאי צמיחה קלה; (B), התנהגויות מטבוליות שונות של iRC1080 ו-i BD1106 בתנאי גדילה כהה. נתון זה הוא מעבודה שפורסמה בעבר על ידי Chaiboonchoe ואח '. 12אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

כימיקל ביולוגיEC* ביאור גניםפסאיי-בלאסט
ציסטמין-S-פוספט3.1.3.1JLM_1629261,2,3,4
טטרתיויונט1.8.2.2ערך E חסר חשיבות
1.8.5.2ערך E חסר חשיבות
די-אלנין1.4.1.1XP_001700222.1
1.5.1.22QC ידני שנכשל
2.1.2.7ערך E חסר חשיבות
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
2.3.2.10ערך E חסר חשיבות
2.3.2.14ערך E חסר חשיבות
2.3.2.16ערך E חסר חשיבות
2.3.2.17ערך E חסר חשיבות
2.3.2.18ערך E חסר חשיבות
2.6.1.21QC ידני שנכשל
3.4.13.22XP_001698572.1, XP_001693532.1, XP_001701890.1, XP_001700930.1
3.4.16.4Chlre2_kg.פיגומים_ 140000391,2,3
3.4.17.8QC ידני שנכשל
3.4.17.13ערך E חסר חשיבות
3.4.17.14ערך E חסר חשיבות
4.5.1.2ערך E חסר חשיבות
6.1.1.13QC ידני שנכשל
6.1.2.1QC ידני שנכשל
6.3.2.4au.g14655_t11,2,3
6.3.2.10QC ידני שנכשל
6.3.2.16ערך E חסר חשיבות
6.3.2.35ערך E חסר חשיבות
D-אספרגין1.4.5.1ערך E חסר חשיבות
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
3.1.1.96ערך E חסר חשיבות
2.3.1.36ערך E חסר חשיבות
1.4.99.1XP_001692123.1
3.5.1.77e_gwW.1.243.11,2
3.5.1.81ערך E חסר חשיבות
5.1.1.10QC ידני שנכשל
חומצה אספרטית D-6.3.1.12ערך E חסר חשיבות
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
חומצה גלוטמית D-1.4.3.7ערך E חסר חשיבות
1.4.3.3ערך E חסר חשיבות
די-ליסין5.4.3.4ערך E חסר חשיבות
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
6.3.2.37QC ידני שנכשל
די-סרין2.7.11.8ערך E חסר חשיבות
2.7.11.17Cre12.g486350.t1.31,2,3,4
3.4.21.78QC ידני שנכשל
3.4.21.104QC ידני שנכשל
4.3.1.18g6244.t14 QC ידני שנכשל
6.3.2.35ערך E חסר חשיבות
6.3.3.5ערך E חסר חשיבות
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
די-ואלין1.21.3.1QC ידני שנכשל
6.3.2.26QC ידני שנכשל
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
חומצה L-פירוגלוטמית
תיאופוספט
דידיופוספט
אתילאמין6.3.1.6
D, חומצה L-א-אמינו-בוטירית2.1.1.49ערך E חסר חשיבות
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
די-פפטיד3.4.13.18Cre02.g078650.t1.31
תלת פפטיד3.4.11.4Cre16.g675350.t1.31

טבלה 1: רשימה של מטבוליטים ניצול מצע חיובי מזוהה (C, P, S, N) לא נוכח במודל חילוף החומרים iRC1080.   *התגובה לא נכללה אם לא זוהה גן.  1 פיטוזום גירסה 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii).   2 JGI גירסה 4 35.  3 אוגוסטוס גרסה 510.  4 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html).  5 JGI גירסה 3.136.  טבלה זו היא מעבודה שפורסמה בעבר על ידי Chaiboonchoe ואח '. 12

מודלתגובותמטבוליטיםגנים
iRC10802,1911,7061,086
iBD11062,4451,9591,106

טבלה 2: תוכן של iRC1080 ו- BD1106.  טבלה זו היא מעבודה שפורסמה בעבר על ידי Chaiboonchoe ואח '. 12

קטגוריה או סוג של תגובותמספר תגובות
חומצות אמינו20
דיפפטידים108
טריפטידים5
תגובת תחבורה120

טבלה 3: סיכום תגובות חדשות ב- iBD1106. טבלה זו היא מעבודה שפורסמה בעבר על ידי Chaiboonchoe ואח '. 12

מצב צמיחהמטבוליטשםiRC1080iBD1106
4r5au4-(1-D-Ribitylamino)-5-אמינואורסיל00.168
5aprbu5-אמינו-6-(5'-זרחןלמינו)uracil-0.0090.158
אורpa1819Z18111Z1-(9Z)-octadecenoyl,2-(11Z)-octadecenoyl-sn-גליצל3-פוספט-0.009-0.65
חשוך4אבוט4 אמינובוטנואט0.18-0.05

טבלה 4: דוגמה למחירי צללים משמעותיים עבור iRC1080 ו- bD1106. טבלה זו היא מעבודה שפורסמה בעבר על ידי Chaiboonchoe ואח '. 12

Discussion

פנוטיפינג מטבולי של microalga ירוק, C. reinhardtii, תואר כאן באמצעות צלחות בדיקה PM תפוקה גבוהה PMI לא שטופת. בדיקות החנקן נוצלו בסך הכל 190 מקורות פחמן (PM01 ו- PM02), 95 מקורות חנקן (PM03), 59 מקורות זרחן ו -35 מקורות גופרית (PM04), יחד עם מקורות חנקן פפטיד (PM06-08). נשימה חיובית נצפתה עבור 148 חומרים מזינים (מבחן חיובי אחד לניצול מקור C, ארבע בדיקות חיוביות עבור כל שימוש במקור S ו- P-source, ו 139 בדיקות חיוביות לניצול מקור N). אין להוסיף את רכיב המצעים או החומרים המזינים (פחמן, חנקן, זרחן או גופרית) של המדיה למדיום המוגדר כאשר הם מוחלים על מיקרו-לוחות ראש הממשלה הרלוונטיים הבודקים עבור כל אחד מאותם מקורות.

השיטה המוצגת כאן יעילה לאפיון פנוטיפים מיקרו-אצות מטבוליות שניתן להשתמש בהם כדי להרחיב את מודלי הרשת המטבולית הקיימים או לכוון את השחזור של מודלים חדשים. יתר על כן, כמו הדרישות התזונתיים של רוב microalgae אינם ידועים, פלטפורמה זו יכולה לשמש כדי להגדיר אלה במהירות. נלסון ואח. 43 יישם בהצלחה שיטות אלה כדי לזהות תרכובות חדשות התומכות בצמיחה של כלורוידיום microalgae sp. UTEX 3007 והשתמש במידע המתקבל כדי להגדיר את מטבוליטים הכניסה למינים, אשר, בניגוד לכלמידומונס, כוללים 40 מקורות פחמן שונים.

מגבלה מרכזית אחת של ראש הממשלה ליצירת פרופיל של מיקרו-אצות היא של-PMI אין תאורה בתא הדגירה, והמיקרו-אצות צריכות להיות מסוגלות לבצע חילוף חומרים הטרוטרופי. היעדר אור יכול להשפיע על הפרשנות של מודלים המשלבים אור לחישוב שטפים מטבוליים. זוגות גנים עם פונקציות תיאום התפתחו במשותף כדי להוות רכזות רשת מטבוליות, ואת ההבחנה בין רכזות רשת פוטוסינתזה ולא פוטוסינתזה יכול להיעשות44. באופן כללי, רכזות רשת פוטוסינתזה (כלומר, צמתים מחוברים מאוד במודל) יישארו מחוץ לדגמים הטרוטרופיים. למטרות מעשיות, מידול הטרוטרופיזם במינים מיקסוטרופיים צריך להשמיט תגובות הידועות כמונעות על ידי אור ולחשב על ההבדלים מאזן האנרגיה בין התנאים. לכן, מידול חילוף החומרים תלוי אור ולטהות אור הוא נוהג מקובל בכלמידומונס מידול מטבולי6,45.

כמה מיקרו-אצות ירוקות, כמו טרבוקיופיטים, ידועות כמטמיעות מגוון מולקולות פחמן לצמיחה, וזה נחשב כמי שצמח מההיסטוריה האבולוציונית הארוכה שלהן כחברים בחזזיות46. בעוד כלורופיטים כמו כלמידומונס יכולים להשתמש אצטט לצמיחה, מיקרואלגה ימית חומה Tisochrysis lutea, הידועה בפוטנציאל שלה לייצר באופן מסחרי חומצות שומן רב בלתי רוויות בשרשרת ארוכה מאוד (VLC-PUFAs), אינה יכולה להשתמש באצטט אך יכולה להשתמש בגליצרול לצמיחה47. ריכוז ביומסה של יותר מ 100 גרם l−1 משקל תא יבש הושג עם כלורלה עם תוספת אופטימלית של מקורות פחמן אורגני במצב אצווה48. כמו כן, תוספת של סוכר כלורלאבולגאריס יכול להעלות את ההרחבה שלה של CO2, ובכך לספק יתרון תוסף במהלך צמיחה פוטוסינתזה49. רוב המיקרו-אצות הטרוטרופיות יכולות גם לגדול באופן מיקסוטרופי, אבל כלורופיט כרומוכלוריס זופינגיאנסיס הוכח ככיבוי פוטוסינתזה בתוספת סוכר50.

הצורניות, המשתייכות למחלקה בסילאריופיטה, הן קבוצה גדולה של פיטופלנקטון. למרות שרוב הצורניות יכולות לגדול רק פוטואוטוטרופית, חלקם ניתן לטפח מיקסוטרופית או הטרוטרופית51. לדוגמה, גליצרל נמצאה כתומכת בצמיחה באור בהיעדר CO2 בכמה הצורניות, כולל מינים מודל Phaeodactylum tricornutum52. כמו כן, כמה הצורניות הבנטיות כמו ניטשיה לינאריס יכולות לגדול על פחמימות בחושך53. זה עשוי להרחיב את בדיקות ראש הממשלה הצורניות וקבוצות אצות אחרות על ידי שכשהם מקורות פחמן אורגניים מתאימים כדי לאפשר לתאים לגדול הטרוטרופית, ואסטרטגיית מיקסוטרופיה יכולה לשמש גם עבור מיקרו-אצות אוטוטרופיות חובה המספקות אספקת אור מינימלית נדרשת.

כדי להעריך את יכולת הרבייה של הנתונים, מומלץ מאוד לבצע התקפות כפולות עבור כל הצלחות. בדיקה עשויה להיחשב חיובית רק אם, לאחר חיסור מהפקד השלילי והבארות הריקות המתאימות, הספיגה (ערך PMI) חיובית. תיאור זה, בנוכחות המתחם שנבדק, הוא השתקפות של התגובה האביוטית של הצבע עם המדיום.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

תמיכה משמעותית בעבודה זו ניתנה על ידי מרכז NYUAD לביולוגיה גנומיקה ומערכות (CGSB), במימון Tamkeen תחת מענק מכון המחקר של אוניברסיטת ניו יורק אבו דאבי (73 71210 CGSB9) וקרנות המחקר של הפקולטה לאבו דאבי של אוניברסיטת ניו יורק (AD060). ארגון W.F. נתמך בנוסף על ידי תוכנית מאה הכישרונות של אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג. אנו מודים לאשיש ג'איסוואל על העזרה בהקלטת הסרטון. אנו מודים להונג קאי על יצירת נתוני פנוטיפ מטבולי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinVWR97062-796
Biolog assay plates [ PM01-08]Biolog, Hayward, CA, USA
Biolog Omnilog InstrumentBiolog, Hayward, CA, USA
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.Regents of the University of Minnesota
KanamycinVWR0408-EU-10G
Tetrazolium Violet Dye “D”Biolog, Hayward, CA, USA
TimentinGlaxoSmithKline Australia Pty Ltd42010012-2

References

  1. Oberhardt, M. A., Palsson, B. &. #. 2. 1. 6. ;., Papin, J. A. J. M. Applications of genome-scale metabolic reconstructions. Molecular Systems Biology. 5 (1), 320 (2009).
  2. Schmidt, B. J., Lin-Schmidt, X., Chamberlin, A., Salehi-Ashtiani, K., Papin, J. A. Metabolic systems analysis to advance algal biotechnology. Biotechnology Journal. 5 (7), 660-670 (2010).
  3. Koskimaki, J. E., Blazier, A. S., Clarens, A. F., Papin, J. A. J. I. B. Computational models of algae metabolism for industrial applications. Industrial Biotechnology. 9 (4), 185-195 (2013).
  4. Koussa, J., Chaiboonchoe, A., Salehi-Ashtiani, K. J. B. Computational approaches for microalgal biofuel optimization: a review. BioMed Research. 2014, 649453 (2014).
  5. Nelson, D. R., et al. Large-scale genome sequencing reveals the driving forces of viruses in microalgal evolution. Cell Host & Microbe. 29 (2), 250-266 (2021).
  6. Shene, C., Asenjo, J. A., Chisti, Y. Metabolic modelling and simulation of the light and dark metabolism of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 96 (5), 1076-1088 (2018).
  7. Tibocha-Bonilla, J. D., Zuñiga, C., Godoy-Silva, R. D., Zengler, K. Advances in metabolic modeling of oleaginous microalgae. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 241 (2018).
  8. Merchant, S. S., et al. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 318 (5848), 245-250 (2007).
  9. May, P., Christian, J. -. O., Kempa, S., Walther, D. J. B. G. ChlamyCyc: an integrative systems biology database and web-portal for Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 10 (1), 209 (2009).
  10. Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), (2011).
  11. de Oliveira Dal'Molin, C. G., Quek, L. -. E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM - a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. BMC Genomics. 12 (5), (2011).
  12. Chaiboonchoe, A., et al. Microalgal metabolic network model refinement through high-throughput functional metabolic profiling. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, 68 (2014).
  13. Kanehisa, M., et al. Data, information, knowledge and principle: back to metabolism in KEGG. Nucleic Acids Research. 42 (1), 199-205 (2014).
  14. Zuñiga, C., et al. Genome-scale metabolic model for the green alga Chlorella vulgaris UTEX 395 accurately predicts phenotypes under autotrophic, heterotrophic, and mixotrophic growth conditions. Plant Physiology. 172 (1), 589-602 (2016).
  15. Bochner, B. R. New technologies to assess genotype-phenotype relationships. Nature Reviews Genetics. 4 (4), 309-314 (2003).
  16. Bochner, B. R. Global phenotypic characterization of bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 33 (1), 191-205 (2009).
  17. Bochner, B. R., Gadzinski, P., Panomitros, E. Phenotype microarrays for high-throughput phenotypic testing and assay of gene function. Genome Research. 11 (7), 1246-1255 (2001).
  18. Bartell, J. A., Yen, P., Varga, J. J., Goldberg, J. B., Papin, J. A. Comparative metabolic systems analysis of pathogenic Burkholderia. Journal of Bacteriology. 196 (2), 210-226 (2014).
  19. Gorman, D. S., Levine, R. J. P. o. t. N. A. o. S. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. PNAS. 54 (6), 1665-1669 (1965).
  20. Smith, A. C., Hussey, M. A. Gram stain protocols. American Society for Microbiology. , 1-9 (2005).
  21. Vaas, L. A. I., et al. opm: an R package for analysing OmniLog phenotype microarray data. Bioinformatics. 29 (14), 1823-1824 (2013).
  22. Vaas, L. A. I., Sikorski, J., Michael, V., Göker, M., Klenk, H. -. P. Visualization and Curve-Parameter Estimation Strategies for Efficient Exploration of Phenotype Microarray Kinetics. PLoS ONE. 7 (4), 34846 (2012).
  23. Caspi, R., et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes-a 2019 update. Nucleic Acids Research. 48 (1), 445-453 (2020).
  24. Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Ishiguro-Watanabe, M., Tanabe, M. KEGG: integrating viruses and cellular organisms. Nucleic Acids Research. , (2020).
  25. Lopez, D., Casero, D., Cokus, S. J., Merchant, S. S., Pellegrini, M. Algal Functional Annotation Tool: a web-based analysis suite to functionally interpret large gene lists using integrated annotation and expression data. BMC Bioinformatics. 12 (1), 282 (2011).
  26. Caspi, R., et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes. Nucleic Acids Research. 46, 633-639 (2018).
  27. Sahoo, S., et al. dEMBF v2. 0: An Updated Database of Enzymes for Microalgal Biofuel Feedstock. Plant and Cell Physiology. 61 (5), 1019-1024 (2020).
  28. Heirendt, L., et al. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 14 (3), 639-702 (2019).
  29. Heirendt, L., et al. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 1, (2019).
  30. Orth, J. D., Thiele, I., Palsson, B. &. #. 2. 1. 6. ;. What is flux balance analysis. Nature Biotechnology. 28 (3), 245 (2010).
  31. Ebrahim, A., Lerman, J. A., Palsson, B. O., Hyduke, D. R. COBRApy: constraints-based reconstruction and analysis for python. BMC Systems Biology. 7 (1), 74 (2013).
  32. Bölling, C., Fiehn, O. Metabolite profiling of Chlamydomonas reinhardtii under nutrient deprivation. Plant Physiology. 139 (4), 1995-2005 (2005).
  33. Harris, E. H. . The Chlamydomonas sourcebook: introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, (2009).
  34. Goodstein, D. M., et al. Phytozome: a comparative platform for green plant genomics. Nucleic Acids Research. 40, 1178-1186 (2012).
  35. Ghamsari, L., et al. Genome-wide functional annotation and structural verification of metabolic ORFeome of Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 12 (1), 4 (2011).
  36. Manichaikul, A., et al. Metabolic network analysis integrated with transcript verification for sequenced genomes. Nature Methods. 6 (8), 589-592 (2009).
  37. Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 32, 115-119 (2004).
  38. Consortium, T. U. Activities at the universal protein resource (UniProt). Nucleic Acids Research. 42 (11), 7486-7486 (2014).
  39. Horton, P., et al. PSORT: protein localization predictor. Nucleic Acids Research. 35, 585-587 (2007).
  40. Becker, S. A., et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox. Nature Protocols. 2 (3), 727-738 (2007).
  41. Schellenberger, J., et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox v2.0. Nature Protocols. 6 (9), 1290 (2011).
  42. Varma, A., Boesch, B. W., Palsson, B. O. Stoichiometric interpretation of Escherichia coli glucose catabolism under various oxygenation rates. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2465-2473 (1993).
  43. Nelson, D. R., et al. The genome and phenome of the green alga Chloroidium sp. UTEX 3007 reveal adaptive traits for desert acclimatization. eLife. , 25783 (2017).
  44. Chaiboonchoe, A., et al. Systems level analysis of the Chlamydomonas reinhardtii metabolic network reveals variability in evolutionary co-conservation. Molecular BioSystems. 12 (8), 2394-2407 (2016).
  45. Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), 518 (2011).
  46. Rajendran, A., Hu, B. Mycoalgae biofilm: development of a novel platform technology using algae and fungal cultures. Biotechnology for Biofuels. 9 (1), 112 (2016).
  47. Hu, H., et al. Effect of cultivation mode on the production of docosahexaenoic acid by Tisochrysis lutea. AMB Express. 8 (1), 50 (2018).
  48. Bumbak, F., Cook, S., Zachleder, V., Hauser, S., Kovar, K. Best practices in heterotrophic high-cell-density microalgal processes: achievements, potential and possible limitations. Applied Microbiology and Biotechnology. 91 (1), 31 (2011).
  49. Fu, W., et al. Sugar-stimulated CO2 sequestration by the green microalga Chlorella vulgaris. Science of the Total Environment. 654, 275-283 (2019).
  50. Roth, M. S., et al. Regulation of oxygenic photosynthesis during trophic transitions in the green alga Chromochloris zofingiensis. The Plant Cell. , (2019).
  51. Villanova, V., et al. Investigating mixotrophic metabolism in the model diatom Phaeodactylum tricornutum. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1728), 20160404 (2017).
  52. Cerón-García, M., et al. Mixotrophic growth of Phaeodactylum tricornutum on fructose and glycerol in fed-batch and semi-continuous modes. Bioresource Technology. 147, 569-576 (2013).
  53. Tuchman, N. C., Schollett, M. A., Rier, S. T., Geddes, P. . Advances in Algal Biology: A Commemoration of the Work of Rex Lowe. , 167-177 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved