JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол демонстрирует использование технологической платформы микрочипов фенотипа (PM) для определения метаболических требований Chlamydomonas reinhardtii, зеленой микроводоросли, и уточнения существующей модели метаболической сети.

Аннотация

Метаболические модели реконструируются на основе доступной аннотации генома организма и предоставляют прогностические инструменты для изучения метаболических процессов на системном уровне. Метаболические модели геномного масштаба могут включать пробелы, а также реакции, которые не проверены экспериментально. Реконструированные модели недавно выделенных видов микрорастилей приведут к слабостям из-за этих пробелов, поскольку обычно имеются скудные биохимические данные о метаболизме таких изолятов. Технология микрочипов фенотипа (ПМ) является эффективным, высокопроизводимым методом, который функционально определяет клеточную метаболическую активность в ответ на широкий спектр входных метаболитов. Сочетание высокопроизводительных фенотипических анализов с метаболическим моделированием может позволить быстро реконструировать или оптимизировать существующие модели метаболических сетей, предоставляя биохимические данные для поддержки и расширения геномных доказательств. Эта работа покажет использование анализов ТЧ для изучения микроводорослей на примере зеленой модели микроводорослей вида Chlamydomonas reinhardtii. Экспериментальные данные для более чем 254 реакций, полученных PM, были использованы в этом исследовании для расширения и уточнения модели метаболической сети C. reinhardtii в масштабе генома, iRC1080, примерно на 25 процентов. Созданный здесь протокол может быть использован в качестве основы для функционального профилирования метаболизма других микрокроволопелей, включая известные мутанты микрокроволопелей и новые изоляты.

Введение

Оптимизация метаболизма водорослей для усиленного и стабильного производства целевых метаболитов требует разработки сложных стратегий метаболической инженерии посредством системного анализа метаболических сетей. Метаболические сетевые модели могут направлять рациональные конструкции для быстрого развития стратегий оптимизации1,2,3,4. Хотя приблизительно 160 видов микроравных водорослей были секвенированы5,насколько нам известно, только 44 метаболические модели водорослей доступны4,6,7. Из-за сложности получения высокопроизводительных метаболических фенотипических данных для экспериментальной валидации геномной информации реконструкция высококачественных сетевых моделей отстает от быстрого развития секвенирования генома водорослей.

C. reinhardtii является привлекательной модельной системой для исследований на основе водорослей. Этот вид может расти фотоавтотрофно или гетеротрофно и широко используется в качестве модельного организма в фундаментальных и прикладных исследованиях. Его последовательность генома была опубликована в 2007году 8,с метаболическими моделями геномного масштаба, впоследствии реконструированными для видов9,10,11. Модель геномного масштаба для C. reinhardtii (iRC1080) была реконструирована Chang et al. 10 основаны на геномных и литературных данных (влекущих за собой ~250 источников). Имеет 1 706 метаболитов с 2 190 реакциями10; однако полнота модели не могла быть проверена за пределами имеющихся в то время экспериментальных данных, опубликованных в то время.

Технология фенотипных микрочипов (ПМ) представляет собой высокопроизводительную платформу, которая может предоставлять информацию метаболического профилирования для гетеротрофных микроорганизмов, а также клеток тканевой культуры. В частности, он может быть использован для устранения пробела в знаниях между фенотипом и генотипом в микроводорослях, о чем впервые сообщалось для Chlamydomonas reinhardtii12, а затем для видов Chloroidium13 и Chlorella14. Изучая реакцию клеток на тысячи метаболитов, сигнальных молекул, осмолитов и эффекторных молекул, анализы PM могут обеспечить функциональное метаболическое профилирование и дать представление о функции, метаболизме и чувствительности окружающей среды15,16,17. В частности, анализы ТЧ обнаруживают использование метаболитов клетками в 96-скважинных микропластинках с различными питательными веществами, метаболитами или осмолитами, содержащимися в каждой скважине. Кроме того, также можно провести анализ биологически активных молекул, таких как антибиотики и гормоны. Поскольку определяется интенсивностью производства цвета путем восстановления NADH окислительно-восстановительного красителя на основе тетразолия, метаболическое использование субстратов оценивается в терминах клеточного дыхания15,16,17. Эксперименты на 96-скважинных микропластилях могут контролироваться и определяться автоматически с течением времени с помощью платформы фенотипного микрочипа (PMI). Двадцать 96-скважинных микропластин предназначены для представления общего набора метаболитов для изучения клеточных фенотипов для использования источников углерода, азота, серы и фосфора, а также различных осмотических / ионных и рН эффектов. Технология ТЧ успешно используется для обновления и модернизации ряда существующих метаболических моделей геномного масштаба для микроорганизмов15,16,17,18.

Протокол и данные, показанные здесь, основаны на ранее опубликованной работе Chaiboonchoe et al. 12 В представленной работе подробно описано использование метода анализа ТЧ для характеристики метаболических фенотипов микроводорослей и расширения существующей метаболической модели водорослей C. reinhardtii, а также для руководства реконструкцией новых метаболических моделей.

протокол

1. Эксперименты с фенотипом микрочипов

  1. Получите штамм C. reinhardtii CC-503 в Ресурсном центре Chlamydomonas в Университете Миннесоты, США (https://www.chlamycollection.org).
  2. Выращивайте клетки в свежей трис-ацетат-фосфатной (TAP) среде19 с конечными концентрациями 400 мкг/мл тиментина, ампициллина 50 мкг/мл и канамицина 100 мкг/мл (для ингибирования роста бактерий) при 400 микромоль фотонах/м2 с при 25 °C в течение двух дней до середины фазы.
  3. Открутите культуру при 2000 х г в течение 10 мин при 22 °C и выбросьте супернатант, не нарушая гранулу.
  4. Готовят свежие носители TAP, содержащие 0,1% тетразолия фиолетового красителя «D».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Модифицируйте носители TAP на этом этапе для исключения некоторых питательных веществ в зависимости от категории метаболитов, протестированных в каждой пластине (например, исключить хлорид аммония для пластин источника азота).
  5. Повторно суспендируют гранулы в свежей среде TAP, приготовленной (со этапа 1.2) до конечной концентрации 1 х10 6 клеток/мл.
  6. Используйте пластины для анализа химических соединений (источники углерода, источники азота, пластины источников фосфора и серы, а также источники пептидного азота).
  7. Инокулируют 100 мкл аликвоты клеточно-содержащих сред в каждую скважину пробирных пластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что анализы дублируются.
  8. Протягивайте клетки на дрожжевой экстракт / пептоновые пластины и выполняйте окрашивание граммом, как у Smith et al. 20 до и после анализа для мониторинга бактериального загрязнения.
  9. Вставьте пластины для анализа химических соединений в систему считывания микропластин.
  10. Инкубировать все пластины при 30 °C в течение 7 дней и запрограммировать систему считывателя микропластин на считывание изменения цвета красителя каждые 15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку большинство считывателей микропластин не обеспечивают источник непрерывного света во время инкубации, водоросли должны иметь возможность осуществлять гетеротрофное дыхание.

2. Анализ данных

  1. Экспортируйте необработанные кинетические данные из считывателя микропластин в виде CSV-файлов, которые впоследствии будут использоваться в качестве входных данных в пакет Omnilog Phenotype Microarray (OPM) в R. Добавьте биологическую информацию в виде метаданных (например, обозначение деформации, питательные среды, температура и т. Д.).
    1. Использование программного обеспечения конвертера данных PM Kinetic; загрузите файлы данных D5E и преобразуйте их в файлы OKA с помощью следующих командных строк в программном обеспечении кинетического анализа PM:
      Загрузка | Импорт (поиск папки с файлами OKA) | Заполнение фильтров | Импорт | Добавить все тарелки | Закрывать.
      Экспорт | выберите чтение данных (Kinetic), выберите формат (CSV) (Tabulate Header)и выберите пластины (каждая пластина (отдельные файлы)) | Экспорт данных | Спасать.
    2. Для проведения анализа данных фенотипа микрочипа (PM) используйте программный пакет OPM21,22, который работает в программной среде R. Пакет, учебное пособие и справочная документация доступны по адресу: http://www.goeker.org/opm/. В RStudio, графическом пользовательском интерфейсе для R, установите пакет opm и его зависимости с помощью следующих команд:
      источник (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R)
      библиотека (opm)
    3. Перейдите в каталог, содержащий CSV-файлы кинетических данных, и импортируйте данные с помощью функции read_opm:
      x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
    4. Агрегировать и дискретизировать кинетические данные с помощью оценки параметров кривой.
      For (i в 1 :length(x)) {
      x[[i]] <Я делаю _aggre(x[[i]], boot = 0 L, cores = 1 L, method ="splines", options = set_spline_options("smooth.spline"))
      x[[i]] <- do_disc(x[[i]], отсечение = ЛОЖЬ)
      }
      #Collection метаданных
      метаданные <- collect_template(".")
      metadata$Штамм <- c("BLANK""CC- 503")
      for (I in 1 :length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = метаданные, replace = TRUE)}
    5. Используйте функцию xy_plot для отображения измерений дыхания (или роста) (ось Y) как функции времени (ось X) для анализируемых 96-скважинных пластин.
      print (xy_plot(x[[ 1 ]], include ="Strain", theor.max = FALSE))
    6. Визуализируйте данные в виде тепловой карты с помощью функции level_plot, чтобы обеспечить быстрый сравнительный обзор кинетических данных.
      level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt("color.borders"), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", пробел ="Lab", смещение = 0.7 , число.цветов = 200 л)
    7. Извлеките важную биологическую информацию, параметры кривой из необработанных кинетических кривых и включите фазу задержки (λ), скорость роста (μ), максимальное дыхание клетки (A) и область под кривой (AUC)21. Для идентификации положительных метаболитов используют значения А отрицательного контроля, которые представляют собой абиотическую реакционную способность красителя со средой, в дополнение к заготовке каждой микрояди пластины в качестве фоновых значений вычитания. Функция extract используется для получения параметра A.
      opm_opt("кривая.параметр")
      param <- extract (x, as.labels = list("Strain")))

3. Идентификация реакций и генов, связанных с новыми метаболитами

  1. Поиск KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) и MetaCyc (http://metacyc.org/) для определения номеров Комиссии ферментов (ECs) для реакций с использованием метаболитов, найденных из массивов химических соединений23,2423,24.
  2. Используйте идентифицированные номера EC в качестве основы для поиска в нескольких доступных ресурсах аннотации водорослей, таких как Joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) и рецензируемых публикациях23,25,26,27.
  3. Если запрос не возвращает генетических доказательств для данного номера EC, идентифицируйте соответствующие ассоциированные белки в других организмах, начиная с видов, наиболее близких к C. reinhardtii,затем выполните поиск на основе профиля с использованием сервера NCBI PSI-BLAST с настройками по умолчанию и используйте неизбыточные белки (nr) в C. reinhardtii (taxid: 3055) для идентификации генов-кандидатов, связанных с реакцией12.
  4. Вручную курируете хиты PSI-BLAST со значениями E < 0,05 для релевантности искомой номеру EC путем запроса этих обращений BLAST через серверы прогнозирования белковых доменов EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search) или InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/). Обратите внимание, что последние два сканирования являются критическими шагами для обеспечения идентификации правильной ферментативной активности белка.

4. Уточнение и оценка модели

  1. Используйте последнюю версию COBRA Toolbox v.3.028в МАТЛАБ29,30платформы для выполнения следующих шагов по уточнению модели. Набор инструментов COBRA можно установить, выполнив действия, описанные в разделе: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . Кроме того, обратите внимание, что COBRA Toolbox также реализован на других языках программирования с открытым исходным кодом, таких как Python (COBRApy).31) и доступен по адресу: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .
    1. После установки COBRA Toolbox v.3.0 откройте MATLAB и выполните следующую команду для инициализации панели инструментов:
      initКобраИнбокс;
    2. Добавьте идентифицированные реакции с их ассоциированными генами в метаболическую модель, такуюкак i RC1080, используя функции COBRA Toolbox addReaction и changeGeneAssociation. Перейдите в каталог, содержащий модель iRC1080, загруженную с http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 и выполните следующие команды, чтобы загрузить модель, переименовать ее и добавить новую реакцию и связанный с ней ген.
      Нагрузка('iRC 1080 .mat')
      модельNew = iRC 1080;
      modelNew = addReaction(modelNew, 'D-ALA 2' , ...
      {'d-ala[c]' , 'atp[c]' , ...
      'D-aladata[c]' , 'adp[c]' , 'pi[c]' , ...
      'h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false);
      modelNEW = changeGeneAssociation(modelNew, ...
      'D-ALA 2','au.g 14655 _t 1' );
    3. В некоторых случаях, когда метаболит не продуцируется внутриклеточным способом, а пополняется из среды, добавляют к модели реакции транспорта для новых метаболитов. Эти транспортные реакции представляют собой пассивную диффузию метаболита из внеклеточной среды в цитозоль. Кроме того, добавляют соответствующую искусственную обменную реакцию с помощью функции addExchangeRxn для ввода или вывода метаболита во внеклеточную среду.
      modelNew = addReaction(modelNew, 'CYCPt' , ...
      {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)'
      modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]' ,- 1000 ,1000 );
    4. Протестируйте поведение новой результивной модели, например, iBD1106, путем проведения анализа баланса потока (FBA) с использованием функции optimizeCbModel в светлых и темных условиях для максимизации биомассы в качестве целевой функции. Для роста света установите нижнюю и верхнюю границы световых реакций солнечного лито PRISM на 646,07 (максимальная скорость). Для темного роста установите границы всех световых реакций PRISM равными нулю. Используйте функцию биомассы, определеннуюранее 10, для роста в темных и светлых условиях. Раствор FBA будет выводить два вектора, соответствующих потокам реакции (раствор.v) и сниженной стоимости (раствор.w), а также один вектор, соответствующий теневым ценам метаболитов (раствор.y).
      %Имитация роста при освещении:
      modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ...
      % 'PRISM_solar_litho' , ...
      'PRISM_solar_exo' , ...
      'PRISM_incandescent_ 60 Вт' , ...
      'PRISM_fluorescent_cool_ 215 Вт' , ...
      'PRISM_metal_halide' , ...
      'PRISM_high_pressure_sodium' , ...
      'PRISM_growth_room' , ...
      'PRISM_white_LED' , ...
      'PRISM_red_LED_array_ 653 нм' , ...
      'PRISM_red_LED_ 674 нм' , ...
      'PRISM_fluorescent_warm_ 18 Вт' , ...
      'PRISM_design_growth' , ...
      }, 0, 'b' );
      modelNew = changeObjective(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo');
      FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNew, 'max');
    5. Повторите шаг 4.1.4 для iRC1080, чтобы сравнить решения FBA, полученные для iBD1106, с решениями, полученными для iRC1080.
    6. Существует ряд методов COBRA, которые могут быть использованы для сравнения моделей (например, анализ изменчивости потока, исследования делеции генов, анализ надежности, прогнозы разделения потоков, FBA, выборка и т. Д.). Подробные учебные пособия можно найти на https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. Здесь приведен пример, в котором модель iRC1080 сравнивается с ее усовершенствованной версией iBD1106 путем получения теневых цен (чувствительность целевой функции биомассы к изменениям системной переменной) метаболитов, учитываемых в каждой модели.
      Получить теневые цены на метаболиты:
      shadowPrices = table(modelNew.mets, ...
      modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);

Результаты

Фенотип Микрочип скрининга модельной водоросли Chlamydomonas reinhardtii
Анализы PM проверяют способность водорослей использовать различные источники углерода, азота, серы и фосфора в минимальной среде. В описании этого метода мы продемонстрировали, как анализы ТЧ использовались для идентификации метаболизма углерода и азота. Кинетика использования углерода и азота измерялась с помощью считывателя микропластин. Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения PMI. Сводная кинетика выбранных пластин для анализа ТЧ (PM01 и PM03) показана на рисунке 1. «Графики xy» отображают измерения дыхания с течением времени, нанесенные для анализов 96-скважинных пластин, где ось Y и ось X представляют значения необработанных измерений и времени, соответственно. Данные были преобразованы в шаблон тепловой карты для сравнительного анализа сборки кинетических данных.

Конвейер уточнения метаболической сети в масштабе генома с использованием данныхТЧ (рисунок 2)иллюстрирует интеграцию высокопроизводительных анализов ТЧ с экспериментальными данными, предоставленными геномными поисками, которые могут расширить модель метаболической сети.

Для определения воспроизводимости данных о ТЧ, полученных с пластин ТЧ01-04 и ТЧ10, была проанализирована линейная регрессия для построения данных двух независимых экспериментов по репликации друг против друга(рисунок 3). На рисунке 3 показано, что большинство данных были почти одинаковыми, поскольку они попадают на линию 45°, при этом присутствует лишь несколько выбросов, а их коэффициент определенияR2 составлял 0,9. Консистенция и воспроизводимость экспериментов над водорослями проверяются этим графиком.

Идентификация новых метаболитов
Анализ ТЧ выявил 662 метаболита в семи пластинках; PM01-PM04 и PM06-PM08, в то время как газовая хроматография Time-Of-Flight (GC-TOF) выявила 77 метаболитов32 (рисунок 4). При сравнении этих двух наборов с 1068 метаболитами, учтенными в iRC1080, только шесть метаболитов перекрывались между тремя наборами, а 149 перекрывались между iRC1080 и PM. Этот результат демонстрирует, что платформа метаболического профилирования может быть значительным источником новой метаболической информации.

Уксусная кислота была единственным источником углерода, обнаруженным в пластине PM01 в качестве поддерживающего углерода после вычитания фонового сигнала. Этот вывод согласуется с литературой33 и показывает специфику анализов ТЧ. Анализы PM выявили новые источники серы, фосфора и азота, которые C. reinhardtii может использовать для роста. Метаболиты серы представляли собой сульфат, тиосульфат, тетратионат и DL-липоамид. Источниками фосфора были тиофосфат, дитиофосфат, D-3-фосфо-глицериновая кислота и цистеамин-S-фосфат. Исходными метаболитами азота были L-амино и D-аминокислоты, включая менее распространенные аминокислоты; L-гомосерин, L-пироглутамический, метиламин, этиламин, этаноламин и D,L-α-аминомо-бутириновые, а также 108 дипептидов и пять трипептидов(таблица 1). Все 128 недавно идентифицированных метаболитов были обыскана в KEGG и MetaCyc на наличие связанных с ними реакций, числа EC и путей.

Новые 128 метаболитов были связаны с 49 уникальными номерами EC. Из них 15 ЭК были связаны с их геномными доказательствами с использованием пяти источников, включая; Phytozome Version 10.0.234 JGI Version 435,AUGUSTUS 5.0 и 5.210 аннотации от Manichaikul et al. 36 и КЕГГ13. Метаболиты без геномных доказательств были введены на веб-сайт Universal Protein Resource (UniProt, http://www.uniprot.org/)37,38, где их родственные последовательности были обнаружены в других организмах. Гомологичные последовательности в C. reinhardtii были идентифицированы путем запуска Position-Specific Iterated BLAST (PSI-BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) с веб-сайта NCBI, учитывая только последовательности, которые произвели значительные выравнивания (E-значение <0,005).

Уточнение модели
Реакции, связанные с новыми 128 метаболитами, вместе с их кодированными генами, были добавлены к модели iRC1080, расширяя сеть. Полученная модель iBD1106, учитывает 2 444 реакции, 1 959 метаболитов и 1 106 генов(таблица 2). Новые 254 добавленные реакции представляли собой 20 реакций окисления аминокислот, 108 реакций гидролиза дипептидов, пять реакций гидролиза трипептидов и 120 реакций переноса, кодируемых четырьмя генами (Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3).

В общей сложности 113 добавленных новых реакций объясняют гидролиз дипептидов и трипептидов. Гидролиз дипептидов и трипептидов связан с двумя генами, один для дипептидов (Cre02.g078650.t1.3) и один для трипептидов (Cre16.g675350.t1.3).

Что касается источников фосфора, то была добавлена реакция гидролиза цистеамина-S-фосфата на цистеамин и фосфат, связанная с геном JLM_162926.

Инструмент WoLF PSORT39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) и результаты, представленные Ghamsari et al. 35 были применены для получения спецификации клеточных компартментов, где происходят новые реакции. Анализируя белковые последовательности, связанные с новыми реакциями, WoLF PSORT предсказал цитозоль как клеточный компартмент для реакций.

Сгенерированная метаболическая модель может содержать пробелы, когда биохимическая информация является неполной. В таких случаях используется команда gapFind, команда COBRA. В нем перечислены корневые пробелы и позволяет выявить новые пробелы, вводимые в новую модель. Метаболиты, которые не могут быть получены в метаболической модели, называются корневыми промежутками40,41. Анализ корневого зазора показал, что обе модели iRC1080 и iBD1106 содержат одинаковые 91 зазор. Это показывает, что добавление новых метаболитов и связанных с ними реакций не вносит никаких дополнительных корневых промежутков. Следует отметить, что метод фенотипирования, используемый в этом протоколе, не закрывает корневые пробелы, поскольку исходные метаболиты корневого разрыва не имеют механизмов переноса или производства, которые не были рассмотрены в анализах фенотипирования. Анализ баланса потока проводили для проверки метаболического поведения iBD1106 в светлых и темных условиях; (без ацетата) и (с ацетатом) соответственно. Алгоритм максимизирует реакции предшественников биомассы для целевой функции (рост биомассы). Для оценки причастности каждого метаболита к заданной целевой функции были рассчитаны «теневые цены» для всех метаболитов. Изменение целевой функции относительно изменения потока метаболита определяет теневую цену метаболита30,42. Указание на то, находится ли метаболит в «избытке» или «ограничивает» объективную функцию, может быть определено с помощью анализа теневых цен, например, производства биомассы. Отрицательные или положительные значения теневых цен выявляют метаболиты, которые при сложении уменьшат или увеличат целевой функцию. Нулевые значения теневых цен выявляют метаболиты, которые не будут влиять на объективную функцию. Сравнение теневых цен между iBD1106 и iRC1080 на рисунке 5 показывает, что для большинства метаболитов существенного изменения не наблюдается; тем не менее, различия обнаруживаются в 105 и 70 случаях в условиях светлого и темного роста соответственно. Таблица 4 включает примеры таких метаболитов.

figure-results-8446
Рисунок 1:Фенотипическое профилирование микрочипов C. reinhardtii. Графики дыхания XY и графики уровня ТЧ01 (источники углерода; А, С) и ТЧ03 (источники азота; Б, Г) показаны пробирные пластины. Рисунок представляет собой массив 8x12, где каждая клетка представляет собой хорошо известную пластину и, таким образом, данный метаболит или среду роста. Внутри каждой ячейки или представления скважины кривые представляют преобразование красителя путем редукции (ось Y) в качестве функции времени (ось x). Кривые дыхания ТЧ из CC-503 и пустых скважин показаны в каждой ячейке и обозначены цветом (цвет чирка представляет собой пустые колодцы, а фиолетовый цвет представляет CC-503). График уровня представляет каждую кривую дыхания в виде тонкой горизонтальной линии, меняющей цвет (или остающейся неизменной) с течением времени. Изменения цвета тепловой карты от светло-желтого (дыхание практически не происходило) до темно-оранжевого или коричневого (произошло значительное дыхание). Показаны метаболиты, используемые C. reinhardtii (CC-503) и заготовки. Эта цифра взята из ранее опубликованной работы Chaiboonchoe et al. 12Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 

figure-results-10031
Рисунок 2:Конвейер уточнения метаболической сети в масштабе генома с использованием данных о ТЧ. После того, как новое соединение дарит положительный результат в анализе ТЧ, его номер Комиссии по ферментам (EC), реакция и путь идентифицируются из доступных баз данных, например, KEGG и MetaCyc. Геномные доказательства затем извлекаются из геномных и аннотационных ресурсов, когда они доступны, и представляют собой связь между генотипом и фенотипом. Когда прямые геномные доказательства недоступны, последовательность белка идентифицируется по номерам EC, а генетические доказательства идентифицируются с помощью PSI-Blast. Реконструированная метаболическая сеть затем уточняется на основе вновь идентифицированных соединений, но только после этапа контроля качества, который влечет за собой запрос белковых доменов с использованием соответствующих баз данных. Эта цифра была изменена по сравнению с ранее опубликованной работой Chaiboonchoe et al. 12Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 

figure-results-11393
Рисунок 3:Воспроизводимость испытаний ТЧ. Значения PMI были собраны в течение 168 часов, а максимальные значения PMI были построены для двух повторных исследований. Каждая ось представляет максимальные значения PMI для каждого исследования (ось X является одним реплицируемым исследованием, а ось Y - другим). Воспроизводимые значения равноудаленные от каждой оси. Каждая точка представляет собой одно максимальное значение. Линейная регрессия была выполнена программным обеспечением для работы с электронными таблицами, и показан результирующий коэффициент определения(R2). Эта цифра была изменена по сравнению с ранее опубликованной работой Chaiboonchoe et al. 12Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 

figure-results-12479
Рисунок 4:Диаграмма Венна метаболитов. Диаграмма Венна перечисляет метаболиты, идентифицированные пластинами PM, метаболической моделью iRC1080 и экспериментами по времени полета газовой хроматографии (GC-TOF). Каждый круг указывает на общее количество метаболитов, которые существуют в каждом соответствующем методе исследования. В то же время перекрывающиеся области представляют собой количество метаболитов, разделяемых между этими методами. Метаболическая модель iRC1080 содержит в общей сложности 1068 уникальных метаболитов. GC-TOF идентифицировал в общей сложности 77 метаболитов32,в то время как в общей сложности 662 метаболита были идентифицированы с использованием пластин ТЧ. Эта цифра взята из ранее опубликованной работы Chaiboonchoe et al. 12Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-13688
Рисунок 5:Теневые цены на метаболиты в iRC1080 и iBD1106 в различных условиях для максимизации биомассы. Каждый круг на «радарных графиках» соответствует теневому значению цены, в то время как каждая линия, простирающаяся от центра графика, указывает на метаболит. (A) Теневые цены и метаболическое поведение iRC1080 и iBD1106 в условиях легкого роста; (B), различное метаболическое поведение iRC1080 и iBD1106 в условиях темного роста. Эта цифра взята из ранее опубликованной работы Chaiboonchoe et al. 12Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Биологическая химияЕС* Аннотация генаПСИ-БЛАСТ
Цистеамин-S-фосфат3.1.3.1JLM_1629261,2,3,4
Тетратионат1.8.2.2незначительное значение E
1.8.5.2незначительное значение E
D-аланин1.4.1.1XP_001700222.1
1.5.1.22Неисправный ручной контроля качества
2.1.2.7незначительное значение E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
2.3.2.10незначительное значение E
2.3.2.14незначительное значение E
2.3.2.16незначительное значение E
2.3.2.17незначительное значение E
2.3.2.18незначительное значение E
2.6.1.21Неисправный ручной контроля качества
3.4.13.22XP_001698572.1, XP_001693532.1, XP_001701890.1, XP_001700930.1
3.4.16.4Chlre2_kg.каркас_ 140000391,2,3
3.4.17.8Неисправный ручной контроля качества
3.4.17.13незначительное значение E
3.4.17.14незначительное значение E
4.5.1.2незначительное значение E
6.1.1.13Неисправный ручной контроля качества
6.1.2.1Неисправный ручной контроля качества
6.3.2.4au.g14655_t11,2,3
6.3.2.10Неисправный ручной контроля качества
6.3.2.16незначительное значение E
6.3.2.35незначительное значение E
D-Аспарагин1.4.5.1незначительное значение E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
3.1.1.96незначительное значение E
2.3.1.36незначительное значение E
1.4.99.1XP_001692123.1
3.5.1.77e_gwW.1.243.11,2
3.5.1.81незначительное значение E
5.1.1.10Неисправный ручной контроля качества
D-аспарагиновая кислота6.3.1.12незначительное значение E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
D-глутаминовая кислота1.4.3.7незначительное значение E
1.4.3.3незначительное значение E
D-лизин5.4.3.4незначительное значение E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
6.3.2.37Неисправный ручной контроля качества
Д-Серин2.7.11.8незначительное значение E
2.7.11.17Cre12.g486350.t1.31,2,3,4
3.4.21.78Неисправный ручной контроля качества
3.4.21.104Неисправный ручной контроля качества
4.3.1.18г6244.т14 Неисправный ручной контроля качества
6.3.2.35незначительное значение E
6.3.3.5незначительное значение E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
Д-Валин1.21.3.1Неисправный ручной контроля качества
6.3.2.26Неисправный ручной контроля качества
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
L-пироглутаминовая кислота
Тиофосфат
Дитиофосфат
Этиламин6.3.1.6
D,L-а-аминоминовая кислота2.1.1.49незначительное значение E
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
Дипептид3.4.13.18Cre02.g078650.t1.31
Трипептид3.4.11.4Cre16.g675350.t1.31

Таблица 1: Перечень идентифицированных метаболитов с положительным использованием субстрата (C, P, S, N), не присутствующих в метаболической модели iRC1080.   * Реакция не была включена, если ген не был идентифицирован.  1 1 Фитозом версия 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii).   2 2 JGI версия 4 35.  3 3 Август версия 510.  4 4 КЕГГ (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html).  5 5 JGI версии 3.136.  Эта таблица взята из ранее опубликованной работы Chaiboonchoe et al. 12 12

МодельРеакцииМетаболитовГены
iRC10802,1911,7061,086
иБД11062,4451,9591,106

Таблица 2:Содержание iRC1080 и iBD1106.  Эта таблица взята из ранее опубликованной работы Chaiboonchoe et al. 12 12

Категория или класс реакцийКоличество реакций
Аминокислоты20
Дипептиды108
Трипептиды5
Транспортная реакция120

Таблица 3:Краткое изложение новых реакций в iBD1106. Эта таблица взята из ранее опубликованной работы Chaiboonchoe et al. 12 12

Состояние ростаМетаболитИмяiRC1080иБД1106
4r5au4-(1-D-рибитиламино)-5-аминоурацил00.168
5апребу5-Амино-6-(5'-фосфорибитиламино)урацил-0.0090.158
Светpa1819Z18111Z1-(9Z)-октадеценоил,2-(11Z)-октадеценоил-sn-глицерин3-фосфат-0.009-0.65
Темный4абут4-аминобутаноат0.18-0.05

Таблица 4:Пример значительных теневых цен на iRC1080 и iBD1106. Эта таблица взята из ранее опубликованной работы Chaiboonchoe et al. 12 12

Обсуждение

Метаболическое фенотипирование зеленой микроводоросли, C. reinhardtii,было описано здесь с использованием высокопроизводительных пробирных пластин pm и немодифицированного PMI. Анализы использовались в общей сложности для 190 источников углерода (PM01 и PM02), 95 источников азота (PM03), 59 источников фосфора и 35 источников серы (PM04), а также источников пептидного азота (PM06-08). Положительное дыхание наблюдалось для 148 питательных веществ (один положительный анализ для использования источника С, четыре положительных анализа для каждого использования S-источника и P-источника и 139 положительных анализов для использования N-источника). Субстраты или питательные вещества (углерод, азот, фосфор или сера) компонента среды не должны добавляться в определенную среду при нанесении на соответствующие микропластины ТЧ, которые тестируются для каждого из этих источников.

Показанный здесь метод эффективен для характеристики метаболических фенотипов микроводорослей, которые могут быть использованы для расширения существующих моделей метаболических сетей или прямой реконструкции новых моделей. Кроме того, поскольку потребности в питании большинства микрокрощевок неизвестны, эта платформа может быть использована для их быстрого определения. Нельсон и др. 43 успешно применили эти методы для идентификации новых соединений, поддерживающих рост микроросли Chloroidium sp. UTEX 3007 и использовали полученную информацию для определения метаболитов входа в виды, которые, в отличие от Chlamydomonas, включают 40 различных источников углерода.

Одним из основных ограничений PM для профилирования микрокрощевин является то, что PMI не имеет освещения в инкубационной камере, и микроросли должны быть в состоянии осуществлять гетеротрофный метаболизм. Отсутствие света может повлиять на интерпретацию моделей, которые включают свет для расчета метаболических потоков. Пары генов с координирующими функциями совместно эволюционировали, чтобы составить метаболические сетевые центры, и различие между фотосинтетическими и нефотосинтетическими сетевыми узлами можно сделать44. В общем, фотосинтетические сетевые концентраторы (т.е. высокосвязанные узлы в модели) будут исключены из гетеротрофных моделей. Для практических целей моделирование гетеротрофизма у миксотрофных видов должно опускать реакции, которые, как известно, управляются светом, и учитывать различия в энергетическом балансе между условиями. Таким образом, моделирование светозависимого и светонезависимого метаболизма является стандартной практикой в метаболическом моделировании хламидомонас6,45.

Известно, что некоторые зеленые микрокрощевки, такие как Trebouxiophytes, ассимилируют различные молекулы углерода для роста, и это, как полагают, возникло из их долгой эволюционной истории в качестве членов лишайников46. В то время как хлорофиты, такие как Chlamydomonas, могут использовать ацетат для роста, коричневая морская микроросль Tisochrysis lutea, известная своей потенциальной возможностью коммерческого производства очень длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (VLC-PUFAs), не может использовать ацетат, но может использовать глицерин для роста47. Концентрация биомассы более 100 г л−1 массы сухой ячейки была достигнута с помощью хлореллы с оптимизированным добавлением источников органического углерода в режиме подачипартии 48. Кроме того, добавление сахара в Chlorellavulgaris может повысить его связывание CO2, тем самым обеспечивая аддитивное преимущество во время фотосинтетического роста49. Большинство гетеротрофных микроводоросли также могут расти миксотрофно, но было показано, что хлорофит Chromochloris zofingiensis отключает фотосинтез при добавлении сахара50.

Диатомовые водоросли, относящиеся к подразделению Bacillariophyta, являются основной группой фитопланктона. Хотя большинство диатомовых водорослей могут расти только фотоавтотрофно, некоторые из них могут культивироваться миксотрофно или гетеротрофно51. Например, было обнаружено, что глицерин поддерживает рост в свете в отсутствие CO2 у некоторых диатомовых водорослей, включая модельный вид Phaeodactylum tricornutum52. Кроме того, некоторые бентические диатомовые водоросли, такие как Nitzschia linearis, могут расти на углеводах в темноте53. Вероятно, это распространит анализы ТЧ на диатомовые водоросли и другие группы водорослей путем дополнения подходящих органических источников углерода, чтобы позволить клеткам расти гетеротрофно, и стратегия миксотрофии также потенциально может быть использована для облигатных автотрофных микроводоросли, обеспечивающих минимально необходимый источник света.

Для оценки воспроизводимости данных настоятельно рекомендуется проводить дублирующие анализы для всех пластин. Анализ может считаться положительным только в том случае, если после вычитания из отрицательного контрольного и соответствующих пустых скважин поглощение (значение PMI) является положительным. Это описание, в присутствии искомого соединения, является отражением абиотической реакции красителя со средой.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Основную поддержку этой работе оказали Центр геномики и системной биологии NYUAD (CGSB), финансируемый Tamkeen в рамках гранта Нью-Йоркского университета Абу-Даби Научно-исследовательского института (73 71210 CGSB9) и Исследовательские фонды факультета Нью-Йоркского университета Абу-Даби (AD060). W.F. был дополнительно поддержан программой «Сто талантов» Чжэцзянского университета. Мы благодарим Ашиша Джайсвала за помощь в записи видео. Мы благодарим Хонг Цай за создание данных метаболического фенотипа.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinVWR97062-796
Biolog assay plates [ PM01-08]Biolog, Hayward, CA, USA
Biolog Omnilog InstrumentBiolog, Hayward, CA, USA
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.Regents of the University of Minnesota
KanamycinVWR0408-EU-10G
Tetrazolium Violet Dye “D”Biolog, Hayward, CA, USA
TimentinGlaxoSmithKline Australia Pty Ltd42010012-2

Ссылки

  1. Oberhardt, M. A., Palsson, B. Ø, Papin, J. A. J. M. Applications of genome-scale metabolic reconstructions. Molecular Systems Biology. 5 (1), 320(2009).
  2. Schmidt, B. J., Lin-Schmidt, X., Chamberlin, A., Salehi-Ashtiani, K., Papin, J. A. Metabolic systems analysis to advance algal biotechnology. Biotechnology Journal. 5 (7), 660-670 (2010).
  3. Koskimaki, J. E., Blazier, A. S., Clarens, A. F., Papin, J. A. J. I. B. Computational models of algae metabolism for industrial applications. Industrial Biotechnology. 9 (4), 185-195 (2013).
  4. Koussa, J., Chaiboonchoe, A., Salehi-Ashtiani, K. J. B. Computational approaches for microalgal biofuel optimization: a review. BioMed Research. 2014, 649453(2014).
  5. Nelson, D. R., et al. Large-scale genome sequencing reveals the driving forces of viruses in microalgal evolution. Cell Host & Microbe. 29 (2), 250-266 (2021).
  6. Shene, C., Asenjo, J. A., Chisti, Y. Metabolic modelling and simulation of the light and dark metabolism of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 96 (5), 1076-1088 (2018).
  7. Tibocha-Bonilla, J. D., Zuñiga, C., Godoy-Silva, R. D., Zengler, K. Advances in metabolic modeling of oleaginous microalgae. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 241(2018).
  8. Merchant, S. S., et al. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 318 (5848), 245-250 (2007).
  9. May, P., Christian, J. -O., Kempa, S., Walther, D. J. B. G. ChlamyCyc: an integrative systems biology database and web-portal for Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 10 (1), 209(2009).
  10. Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), (2011).
  11. de Oliveira Dal'Molin, C. G., Quek, L. -E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM - a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. BMC Genomics. 12 (5), (2011).
  12. Chaiboonchoe, A., et al. Microalgal metabolic network model refinement through high-throughput functional metabolic profiling. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, 68(2014).
  13. Kanehisa, M., et al. Data, information, knowledge and principle: back to metabolism in KEGG. Nucleic Acids Research. 42 (1), 199-205 (2014).
  14. Zuñiga, C., et al. Genome-scale metabolic model for the green alga Chlorella vulgaris UTEX 395 accurately predicts phenotypes under autotrophic, heterotrophic, and mixotrophic growth conditions. Plant Physiology. 172 (1), 589-602 (2016).
  15. Bochner, B. R. New technologies to assess genotype-phenotype relationships. Nature Reviews Genetics. 4 (4), 309-314 (2003).
  16. Bochner, B. R. Global phenotypic characterization of bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 33 (1), 191-205 (2009).
  17. Bochner, B. R., Gadzinski, P., Panomitros, E. Phenotype microarrays for high-throughput phenotypic testing and assay of gene function. Genome Research. 11 (7), 1246-1255 (2001).
  18. Bartell, J. A., Yen, P., Varga, J. J., Goldberg, J. B., Papin, J. A. Comparative metabolic systems analysis of pathogenic Burkholderia. Journal of Bacteriology. 196 (2), 210-226 (2014).
  19. Gorman, D. S., Levine, R. J. P. otN. A. oS. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. PNAS. 54 (6), 1665-1669 (1965).
  20. Smith, A. C., Hussey, M. A. Gram stain protocols. American Society for Microbiology. , 1-9 (2005).
  21. Vaas, L. A. I., et al. opm: an R package for analysing OmniLog phenotype microarray data. Bioinformatics. 29 (14), 1823-1824 (2013).
  22. Vaas, L. A. I., Sikorski, J., Michael, V., Göker, M., Klenk, H. -P. Visualization and Curve-Parameter Estimation Strategies for Efficient Exploration of Phenotype Microarray Kinetics. PLoS ONE. 7 (4), 34846(2012).
  23. Caspi, R., et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes-a 2019 update. Nucleic Acids Research. 48 (1), 445-453 (2020).
  24. Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Ishiguro-Watanabe, M., Tanabe, M. KEGG: integrating viruses and cellular organisms. Nucleic Acids Research. , (2020).
  25. Lopez, D., Casero, D., Cokus, S. J., Merchant, S. S., Pellegrini, M. Algal Functional Annotation Tool: a web-based analysis suite to functionally interpret large gene lists using integrated annotation and expression data. BMC Bioinformatics. 12 (1), 282(2011).
  26. Caspi, R., et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes. Nucleic Acids Research. 46, 633-639 (2018).
  27. Sahoo, S., et al. dEMBF v2. 0: An Updated Database of Enzymes for Microalgal Biofuel Feedstock. Plant and Cell Physiology. 61 (5), 1019-1024 (2020).
  28. Heirendt, L., et al. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 14 (3), 639-702 (2019).
  29. Heirendt, L., et al. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 1, (2019).
  30. Orth, J. D., Thiele, I., Palsson, B. Ø What is flux balance analysis. Nature Biotechnology. 28 (3), 245(2010).
  31. Ebrahim, A., Lerman, J. A., Palsson, B. O., Hyduke, D. R. COBRApy: constraints-based reconstruction and analysis for python. BMC Systems Biology. 7 (1), 74(2013).
  32. Bölling, C., Fiehn, O. Metabolite profiling of Chlamydomonas reinhardtii under nutrient deprivation. Plant Physiology. 139 (4), 1995-2005 (2005).
  33. Harris, E. H. The Chlamydomonas sourcebook: introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, Academic Press. (2009).
  34. Goodstein, D. M., et al. Phytozome: a comparative platform for green plant genomics. Nucleic Acids Research. 40, 1178-1186 (2012).
  35. Ghamsari, L., et al. Genome-wide functional annotation and structural verification of metabolic ORFeome of Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 12 (1), 4(2011).
  36. Manichaikul, A., et al. Metabolic network analysis integrated with transcript verification for sequenced genomes. Nature Methods. 6 (8), 589-592 (2009).
  37. Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 32, 115-119 (2004).
  38. Consortium, T. U. Activities at the universal protein resource (UniProt). Nucleic Acids Research. 42 (11), 7486-7486 (2014).
  39. Horton, P., et al. PSORT: protein localization predictor. Nucleic Acids Research. 35, suppl_2 585-587 (2007).
  40. Becker, S. A., et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox. Nature Protocols. 2 (3), 727-738 (2007).
  41. Schellenberger, J., et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox v2.0. Nature Protocols. 6 (9), 1290(2011).
  42. Varma, A., Boesch, B. W., Palsson, B. O. Stoichiometric interpretation of Escherichia coli glucose catabolism under various oxygenation rates. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2465-2473 (1993).
  43. Nelson, D. R., et al. The genome and phenome of the green alga Chloroidium sp. UTEX 3007 reveal adaptive traits for desert acclimatization. eLife. , 25783(2017).
  44. Chaiboonchoe, A., et al. Systems level analysis of the Chlamydomonas reinhardtii metabolic network reveals variability in evolutionary co-conservation. Molecular BioSystems. 12 (8), 2394-2407 (2016).
  45. Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), 518(2011).
  46. Rajendran, A., Hu, B. Mycoalgae biofilm: development of a novel platform technology using algae and fungal cultures. Biotechnology for Biofuels. 9 (1), 112(2016).
  47. Hu, H., et al. Effect of cultivation mode on the production of docosahexaenoic acid by Tisochrysis lutea. AMB Express. 8 (1), 50(2018).
  48. Bumbak, F., Cook, S., Zachleder, V., Hauser, S., Kovar, K. Best practices in heterotrophic high-cell-density microalgal processes: achievements, potential and possible limitations. Applied Microbiology and Biotechnology. 91 (1), 31(2011).
  49. Fu, W., et al. Sugar-stimulated CO2 sequestration by the green microalga Chlorella vulgaris. Science of the Total Environment. 654, 275-283 (2019).
  50. Roth, M. S., et al. Regulation of oxygenic photosynthesis during trophic transitions in the green alga Chromochloris zofingiensis. The Plant Cell. , (2019).
  51. Villanova, V., et al. Investigating mixotrophic metabolism in the model diatom Phaeodactylum tricornutum. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1728), 20160404(2017).
  52. Cerón-García, M., et al. Mixotrophic growth of Phaeodactylum tricornutum on fructose and glycerol in fed-batch and semi-continuous modes. Bioresource Technology. 147, 569-576 (2013).
  53. Tuchman, N. C., Schollett, M. A., Rier, S. T., Geddes, P. Advances in Algal Biology: A Commemoration of the Work of Rex Lowe. , Springer. 167-177 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

178Chlamydomonas reinhardtii

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены