Diferenciación celular precursora neuronal inducida por campo eléctrico en dispositivos microfluídicos

Resumen

En este estudio, presentamos un protocolo para la diferenciación de células madre neurales y progenitoras (NPC) inducidas únicamente por estimulación del pulso de corriente directa (DC) en un sistema microfluídico.

Resumen

Los campos eléctricos fisiológicos (EF) desempeñan un papel vital en la migración celular, la diferenciación, la división y la muerte. Este artículo describe un sistema de cultivo celular microfluídico que se utilizó para un estudio de diferenciación celular a largo plazo utilizando microscopía. El sistema microfluídico consta de los siguientes componentes principales: un chip electrotáctico ópticamente transparente, un calentador transparente de óxido de indio-estaño (ITO), una bomba de llenado de medios de cultivo, una fuente de alimentación eléctrica, un amplificador de potencia de alta frecuencia, un multiplexor EF, una etapa motorizada X-Y-Z programable y un microscopio de contraste de fase invertido equipado con una cámara digital. El sistema microfluídico es beneficioso para simplificar la configuración experimental general y, a su vez, el reactivo y el consumo de muestras. Este trabajo implica la diferenciación de células madre neurales y progenitoras (NPC) inducidas por estimulación del pulso de corriente directa (CC). En el medio de mantenimiento de células madre, los PNJ del ratón (MNPC) se diferenciaron en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos después de la estimulación del pulso de CC. Los resultados sugieren que el tratamiento simple del pulso de CC podría controlar el destino de los MNPC y podría utilizarse para desarrollar estrategias terapéuticas para los trastornos del sistema nervioso. El sistema se puede utilizar para el cultivo celular en múltiples canales, para la estimulación ef a largo plazo, para la observación morfológica celular y para la adquisición automática de imágenes de lapso de tiempo. Este sistema microfluídico no sólo acorta el tiempo experimental requerido, sino que también aumenta la precisión del control en el microambiente.

Introducción

Las células precursoras neuronales (NPCs, también conocidas como células madre neurales y progenitoras) pueden ser como un candidato prometedor para la estrategia terapéutica neurodegenerativa¹. Los PNJ indiferenciados tienen capacidad de autorretración, multipotencia y capacidad proliferativa^2,3. Un estudio anterior ha informado de que la matriz extracelular y los mediadores moleculares regulan la diferenciación de NPC. El factor de crecimiento epidérmico (FEAG) y el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) promueven la proliferación de NPC, manteniendo así el estado indiferenciado⁴.

Estudios previos han informado que la estimulación eléctrica puede regular las actividades fisiológicas celulares como la división^5,la migración^6,7,8,la diferenciación^1,9,10,y la muerte celular^11. Los campos eléctricos (EF) desempeñan un papel vital en el desarrollo y regeneración del desarrollo del sistema nervioso central^12,13,14. De 2009 a 2019, este laboratorio ha investigado las respuestas celulares a la aplicación de EF en el sistema microfluídico^{1,6,7,8,15,16,17.} Un chip multicanal, ópticamente transparente y electrotáctico (MOE) fue diseñado para ser adecuado para la tinción de inmunofluorescencia para microscopía confocal. El chip tenía alta transparencia óptica y buena durabilidad y permitió la realización simultánea de tres experimentos de estimulación independientes y varias condiciones inmunodeprimadas en un solo estudio. El sistema microfluídico es beneficioso para simplificar la configuración experimental general y, a su vez, el reactivo y el consumo de muestras. Este artículo describe el desarrollo de un sistema de cultivo celular microfluídico que se utilizó para un estudio de diferenciación celular a largo plazo.

Protocolo

1. Diseño y fabricación del chip MOE

1. Dibuje patrones para capas individuales de metacrilato de polimetilo (PMMA) y la cinta de doble cara utilizando el software adecuado (Figura 1A,Tabla de Materiales). Corte las hojas de PMMA y la cinta de doble cara con un escribar de máquina láser CO₂ (Figura 1B).
   1. Encienda el escribar láser CO₂ y conéctelo a un ordenador personal. Abra el archivo de patrón diseñado utilizando el software.
   2. Coloque las láminas PMMA (275 mm x 400 mm) o cinta de doble cara (210 mm x 297 mm) en la plataforma del escribar láser (Figura 2A). Centre el láser en la superficie de las hojas de PMMA o en la cinta de doble cara mediante la herramienta de enfoque automático.
   3. Seleccione el escribar láser como impresora y, a continuación, "imprima" el patrón utilizando el escribar láser para iniciar la ablación directa en la hoja PMMA o cinta a doble cara y obtener patrones individuales en la hoja o cinta PMMA (Figura 2B).
2. Retire la película protectora de las láminas de PMMA y limpie la superficie con gas nitrógeno.
   NOTA: El dibujo del patrón PMMA y el mecanizado directo de la hoja PMMA se realizaron de acuerdo con un informe anterior¹⁷.
3. Para unir varias capas de láminas de PMMA, apile tres piezas de láminas de PMMA de 1 mm (capas 1, 2 y 3) y úselos bajo una presión de 5 kg/cm² en una unión térmica durante 30 minutos a 110 °C para formar el conjunto del canal de flujo/estimulación eléctrica (Figura 2C).
   NOTA: Diferentes lotes de lámina de PMMA obtenida comercialmente tienen una temperatura de transición de vidrio ligeramente diferente (Tg). La temperatura óptima de unión debe probarse a incrementos de 5 °C cerca del Tg.
4. Adherir 12 piezas de adaptadores a las aberturas individuales en la capa 1 del conjunto de chip MOE con pegamento de cianoacrilato de acción rápida.
   NOTA: Los adaptadores están hechos de PMMA mediante moldeo por inyección. Las superficies planas en la parte inferior son para conectarse al chip MOE. Los adaptadores que llevan rosca de tornillo hembra de 1/4W-28 son para conectar tapones blancos ajustados a los dedos, conectores de fondo plano o adaptadores Luer. Tenga cuidado al usar pegamento de cianoacrilato de acción rápida. Evite salpicar en los ojos.
5. Desinfectar los sustratos PMMA de 1 mm (Capas 1-3), la cinta de doble cara (Capa 4) y el PMMA de grado óptico de 3 mm (Capa 5) utilizando irradiación ultravioleta (UV) durante 30 minutos antes de montar el chip (Figura 1A).
6. Adherido a los sustratos PMMA de 1 mm (Capas 1-3) en el PMMA de grado óptico de 3 mm (Capa 5) con la cinta de doble cara (Capa 4) para completar el ensamblaje de PMMA (Capas 1-5) (Figura 1A).
7. Prepare el vaso de cubierta limpio para el conjunto en el chip.
   1. Llene diez veces la dilución del detergente en un frasco de manchas (ver la Tabla de Materiales),y limpie el vidrio de la cubierta de este detergente usando un limpiador ultrasónico durante 15 minutos.
   2. Enjuague bien el frasco de manchas debajo del agua corriente del grifo para eliminar todos los rastros del detergente.
   3. Continúe enjuagando con agua destilada para eliminar todos los rastros de agua del grifo y repita el paso 1.7.2 dos veces.
   4. Seque el vaso de la cubierta limpia soplando con gas nitrógeno.
8. Desinfectar el ensamblaje de PMMA (Capas 1-5), la cinta de doble cara (Capa 6) y el vidrio de la cubierta (Capa 7) usando irradiación UV dentro de un armario de bioseguridad durante 30 minutos antes de montar el chip (Figura 1A).
9. Adhiera el vidrio de la cubierta limpia (Capa 7) al ensamblaje pmma (capas 1-5) con la cinta de doble cara (Capa 6) (Figura 1A).
10. Incubar el chip MOE en una cámara de vacío durante la noche; utilizar el conjunto de chip MOE para procedimientos posteriores (Figura 3).

2. Recubrimiento de poli-L-lisina (PLL) en el sustrato en las regiones de cultivo celular

1. Prepare el tubo de politetrafluoroetileno, el conector de fondo plano, el conector del cono, el adaptador cono-luer, el tapón blanco con los dedos apretados (también llamado tapón), el adaptador Luer, la jeringa de bloqueo Luer y el bung de goma negro(Figura 4A,Tabla de Materiales). Esterilizar todos los componentes anteriores en un autoclave a 121 °C durante 30 min.
2. Selle las aberturas de los adaptadores de puente de agar(Figura 1A)con los tapones blancos ajustados a los dedos. Conecte el conector de fondo plano al conjunto de viruta MOE a través de los adaptadores de entrada y salida medianas(Figura 4B). Conecte el adaptador cono-luer a los stopcocks de 3 vías.
3. Añadir 2 ml de solución PLL del 0,01% utilizando una jeringa de 3 ml que se conecta al stopcock de 3 vías de la entrada mediana (Figura 4B- ).
4. Conecte una jeringa vacía de 3 ml al tapón de 3 vías de la toma de corriente media (Figura 4B- ).
5. Rellene las regiones de cultivo de celda con la solución PLL. Bombee manualmente la solución de recubrimiento de un lado a otro lentamente. Cierre los dos stopcocks de 3 vías para sellar la solución dentro de las regiones de cultivo.
6. Incubar el chip MOE a 37 °C durante la noche en una incubadora llena de 5% de CO₂ atmósfera.

3. Preparación de la red de puentes salados

1. Después del paso 2.6, abra los dos stopcocks de 3 vías y tire las burbujas en los canales bombeando manualmente la solución de recubrimiento de ida y vuelta en el canal usando las dos jeringas.
2. Dibuje 3 ml de medio completo (medio de mantenimiento de células madre que consiste en la mezcla nutritiva del águila modificada de Dulbecco F-12 (DMEM/F12), suplemento B-27 del 2%, 20 ng/mL EGF, y 20 ng/mL bFGF) en una jeringa de 3 ml que conecta con el stopcock de 3 vías de la entrada mediana (Figura 4B- y Figura 4B- ).
3. Añadir 3 ml de medio completo para reemplazar la solución de recubrimiento en las regiones de cultivo celular. Conecte una jeringa vacía de 5 ml al tapón de 3 vías de la toma de corriente media (Figura 4B- ).
4. Preparar la red de puentes salados (Figura 5).
   1. Corte el bung de goma negra para producir un hueco, e inserte los electrodos de cloruro de plata (Ag)/plata (AgCl) a través del bung de goma negra y en la jeringa de bloqueo Luer(Figura 4A).
   2. Reemplace el tapón de la dedo blanca por el adaptador Luer e inyecte un 3% de agarose caliente para llenar el adaptador Luer.
      NOTA: Para la preparación de la agarose caliente, disolver 3 g de polvo de agarose en 100 ml de solución salina amortiguada por fosfato (PBS) y esterilizar en un autoclave a 121 °C durante 30 min.
   3. Conecte la jeringa de bloqueo Luer al adaptador Luer. Inyectar 3% de agarose caliente a través de la boquete de goma negra para llenar la jeringa de bloqueo Luer usando la jeringa con aguja. Deje que de 10 a 20 minutos para que la agarose se enfríe y se solidifique.
      NOTA: Con el fin de aumentar la capacidad de volumen de la agarose, la jeringa de bloqueo Luer se monta en el adaptador Luer (Figura 4 y Figura 5). A continuación, los electrodos grandes se insertan en la jeringa de bloqueo luer. El electrodo es capaz de proporcionar una estimulación eléctrica estable para el experimento a largo plazo.

4. Preparación de mNC

1. Cultea los mNPC¹ en el medio completo en un matraz de cultivo celular 25T a 37 °C en una incubadora llena de 5% de CO₂ atmósfera. Subculen las células cada 3-4 días, y realizan todos los experimentos con células que han sido sometidas a 3-8 pasajes de la fuente original.
2. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y gire las neuroesferas a 100 × g durante 5 minutos. Aspirar el sobrenadante, y lavar las neuroesferas con 1x PBS de Dulbecco (DPBS). Gire hacia abajo las neuroesferas a 100 × g durante 5 minutos.
3. Aspirar el 1x DPBS y luego resuspend las neuroesferas en el medio completo. Mezcle bien y suavemente.
4. Añadir 1 ml de la suspensión de la neurosfera utilizando una jeringa de 1 ml que se conecta al stopcock de 3 vías de la salida (Figura 4B- ).

5. Configuración del sistema microfluídico para estimulación del pulso CC (Figura 6)

1. Instale el chip MOE de semillas de celda en el calentador ITO transparente que se fija en una etapa motorizada X-Y-Z programable.
   NOTA: La temperatura superficial ITO se controla mediante un controlador proporcional-integral-derivado y se mantiene a 37 °C. Un termopar tipo K se sujeta entre el chip y el calentador ITO para monitorear la temperatura de las regiones de cultivo celular dentro del chip. El chip MOE está instalado en una etapa motorizada X-Y-Z programable y es adecuado para la adquisición automática de imágenes de lapso de tiempo en secciones de canales individuales. La fabricación del calentador ITO y la configuración del sistema de calefacción de cultivo celular se han descrito previamente^18,19.
2. Infunda los mNPC bombeando manualmente al chip MOE a través de la toma de corriente media. Incubar el chip MOE de semillas celulares en el calentador ITO de 37 °C durante 4 h.
3. Después de 4 h, bombear el medio completo a través del chip MOE a través de la entrada media a un caudal de 20 μL/h utilizando una bomba de jeringa.
   NOTA: Los mNPC se cultivan y mantienen en el chip durante 24 h adicionales antes de la estimulación ef para permitir el apego y el crecimiento de la célula. El líquido residual se recoge en una jeringa vacía de 5 ml conectada al tapón de 3 vías de la salida, que se muestra como "residuos" en la Figura 6A. La configuración del sistema microfluídico MOE se muestra en la Figura 6. Este sistema microfluídico proporciona un suministro continuo de nutrición a las células. El medio fresco completo se bombea continuamente en el chip MOE para mantener un valor de pH constante. Por lo tanto, las células se pueden cultivar fuera de una incubadora de CO_2.
4. Utilice cables eléctricos para conectar un multiplexador EF al chip MOE a través de los electrodos Ag/AgCl del chip. Conecte un multiplexador EF y un generador de funciones a un amplificador para emitir pulsos de CC de onda cuadrada con una magnitud de 300 mV/mm a una frecuencia de 100 Hz a un 50% de ciclos de trabajo (50% de tiempo encendido y 50% de tiempo de apagado) (Figura 6B).
   1. Conecte los cables eléctricos al multiplexador EF. Conecte los cables eléctricos al chip MOE a través de los electrodos Ag/AgCl.
   2. Conecte el multiplexador EF al amplificador mediante cables eléctricos. Conecte el generador de funciones al amplificador y al osciloscopio digital.
      NOTA: El multiplexador EF es un circuito que incluye la impedancia de la cámara de cultivo en el circuito y conecta todas las cámaras individuales en una red electrónica paralela. Cada una de las tres cámaras de cultivo está conectada eléctricamente en serie a una resistencia variable (Vr) y un ammeter (que se muestra como μA en la Figura 6A)en el multiplexor. La corriente eléctrica a través de cada cámara de cultivo es variada mediante el control de la Vr, y la corriente se muestra en el ammeter correspondiente. La fuerza de campo eléctrico en cada región de cultivo celular fue calculada por la Ley de Ohm, I= σEA, donde yo es la corriente eléctrica, σ (establecida como 1.38 S·m^-1 para DMEM/F12²⁰⁾es la conductividad eléctrica del medio de cultivo, E es el campo eléctrico, y A es el área transversal de la cámara electrotáctica. Para la dimensión de región de cultivo celular que se muestra en la Figura 1,la corriente eléctrica es ~87 mA y ~44 mA para el pulso DC y DC al 50% del ciclo de trabajo, respectivamente.
5. Someta los mNPC a pulsos de CC cuadrados con una magnitud de 300 mV/mm a la frecuencia de 100 Hz durante 48h. Bombee continuamente el medio completo a una velocidad de 10 μL/h para suministrar una nutrición adecuada a las células y mantener un valor constante de pH en el medio.

6. Ensayos de inmunofluorescencia de mNPC después de la estimulación de CC pulsada

NOTA: En este paso, todo reactivo se bombea a través de la entrada mediana utilizando una bomba de jeringa.

1. Después de 3, 7 o 14 días de cultivo in vitro (DIV) después de la siembra^1,lave las células con 1x PBS a un caudal de 25 μL/min durante 20 minutos.
2. Fijar las células con 4% paraformaldehído (PFA). Bombee 4% PFA en el chip a un caudal de 25 μL/min durante 20 minutos para reemplazar el PBS 1x. Para reemplazar el PFA del 4%, lave las celdas con 1x PBS a un caudal de 25 μL/min durante 20 min.
3. Bomba 0.1% Tritón X-100 en el chip a un caudal de 50 μL/min durante 6 minutos para permeabilizar las células. Reduzca el caudal a 50 μL/h durante 30 minutos adicionales para reaccionar con las células. Para reemplazar el Tritón X-100 del 0,1%, lave las células con 1x PBS a un caudal de 50 μL/min durante 6 min.
4. Bloquee las células con PBS que contenga albúmina sérica bovina (BSA) al 1% para reducir la unión de anticuerpos no específicos. Bombee 1% BSA en el chip a un caudal de 50 μL/min durante 6 min. Reduzca el caudal a 100 μL/h y bombee durante 1 h.
5. Bombea los anticuerpos para una doble inmunodetención en el chip a un caudal de 50 μL/min durante 6 min, e incuba el chip durante 18 h a 4 °C. Lave las células con 1x PBS a un caudal de 50 μL/min durante 15 min.
6. Bombea los anticuerpos secundarios conjugados con Fluor Alexa en el chip a un caudal de 50 μL/min durante 6 min. Reduzca el caudal a 50 μL/h y bombee los anticuerpos durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave las células con 1x PBS a un caudal de 50 μL/min durante 15 min.
7. Para la tinción nuclear, bombee Hoechst 33342 en el chip a un caudal de 20 μL/min durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave las células con 1x PBS a un caudal de 50 μL/min durante 15 min.
8. Después de la inmunodetención, observe las células utilizando un microscopio de fluorescencia confocal.

7. Análisis de imágenes y procesamiento de datos

1. Analice las imágenes fluorescentes utilizando software con herramientas de medición integradas (consulte la Tabla de materiales).
2. Compare los núcleos manchados de contador Hoechst (número total de células) en los grupos de control y tratamiento, y calcule el porcentaje de células que expresan cada marcador fenotípico.

Resultados

La configuración detallada del chip MOE se muestra en el cuadro 1. El chip microfluídico proporciona un enfoque beneficioso para reducir el tamaño de configuración experimental, el volumen de la muestra y el volumen de reactivos. El chip MOE fue diseñado para realizar tres experimentos independientes de estimulación ef y varias condiciones de inmunodetención simultáneamente en un solo estudio (Figura 3). Además, el chip ...

Discusión

Durante la fabricación del chip MOE, los adaptadores se unen a la Capa 1 del chip MOE con pegamento de cianoacrilato de acción rápida. El pegamento se aplica a 4 esquinas de los adaptadores, y luego la presión se aplica uniformemente sobre los adaptadores. Se debe evitar el exceso de pegamento para garantizar la polimerización completa del pegamento. Además, el conjunto de chips MOE completado se incuba en una cámara de vacío. Este paso ayuda a eliminar las burbujas entre la capa PMMA, la cinta de doble cara y el...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mm PMMA substrates (Layers 1-3)	BHT	K2R20	Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL plastic tube	Protech Technology Enterprise Co., Ltd	CT-15-PL-TW	Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized
3 mL syringe	TERUMO	DVR-3413	3 mL oral syringes, without needle
3 mm optical grade PMMA (Layer 5)	CHI MEI Corporation	ACRYPOLY PMMA Sheet	Optical grade PMMA
3-way stopcock	NIPRO	NCN-3L	Sterile disposable 3-way stopcock
5 mL syringe	TERUMO	DVR-3410	5 mL oral syringes, without needle
Adaptor	Dong Zhong Co., Ltd.	Customized	PMMA adaptor
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	Agarose, low gelling temperature
Amplifier	A.A. Lab Systems Ltd	A-304	High voltage amplifier
AutoCAD software	Autodesk	Educational Version	Drafting
B-27 supplement	Gibco	12587-010	B-27 supplement (50x), minus vitamin A
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Peprotech	AF-100-18B	Also called recombinant human FGF-basic
Black rubber bung	TERUMO	DVR-3413	From 3 mL oral syringes, without needle
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B4287	Blocking reagent
Centrifuge	HSIANGTAI	CV2060	Centrifuge
CO2 laser scriber	Laser Tools and Technics Corp.	ILS-II	Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm
Cone connector	IDEX Health & Science	F-120X	One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural
Cone-Luer adaptor	IDEX Health & Science	P-659	Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK
Confocal fluorescence microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Digital camera	OLYMPUS	E-330	Automatic time-lapse image acquisition
Digital oscilloscope	Tektronix	TDS2024	Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency.
Double-sided tape	3M	PET 8018	Purchased from http://en.thd.com.tw/
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	12400024	DMEM/F-12, powder, HEPES
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21600010	DPBS, powder, no calcium, no magnesium
EF multiplexer	Asiatic Sky Co., Ltd.	Customized	Monitor and control the electric current in individual channels
Epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Also called recombinant human EGF
Fast-acting cyanoacrylate glue	3M	7004T	Strength instant adhesive (liquid)
Flat bottom connector	IDEX Health & Science	P-206	Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue
Function generator	Agilent Technologies	33120A	High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability
Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150117	Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed
Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555)	Abcam	ab150086	Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
ImageJ software	National Institutes of Health	1.48v	Analyze the fluorescent images
Indium–tin–oxide (ITO) glass	Merck	300739	For ITO heater
Inverted phase contrast microscope	OLYMPUS	CKX41	For cell morphology observation
K-type thermocouple	Tecpel	TPK-02A	Temperature thermocouples
Luer adapter	IDEX Health & Science	P618-01	Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene
Luer lock syringe	TERUMO	DVR-3413	For agar salt bridges
Mouse anti-GFAP	eBioscience	14-9892	Astrocytes marker
Oligodendrocyte  marker  O4  antibody	R&D Systems	MAB1326	Oligodendrocytes marker
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148	Fixing agent
Phosphate buffered saline (PBS)	Basic Life	BL2651	Washing solution
Poly-L-Lysine (PLL)	SIGMA	P4707	Coating solution
Precision cover glasses thickness No. 1.5H	MARIENFELD	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programmable X-Y-Z motorised stage	Tanlian Inc	Customized	Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportional–integral–derivative (PID) controller	Toho Electronics	TTM-J4-R-AB	Temperature controller
PTFE tube	Professional Plastics Inc. Taiwan Branch	Outer diameter 1/16 Inches	White translucent PTFE tubing
Rabbit anti-Tuj1	Abcam	ab18207	Neuron marker
Syringe pump	New Era Systems Inc	NE-1000	NE-1000 programmable single syringe pump
TFD4 detergent	FRANKLAB	TFD4	Cover glass cleaner
Thermal bonder	Kuan-MIN Tech Co.	Customized	Purchased from http://kmtco.com.tw/
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Permeabilized solution
Ultrasonic cleaner	LEO	LEO-300S	Ultrasonic steri-cleaner
Vacuum chamber	DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.	DOV-30	Vacuum drying oven
White fingertight plug	IDEX Health & Science	P-316	1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html