JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışmada, sadece mikroakışkan bir sistemde doğrudan akım (DC) darbe stimülasyonu ile indüklenen nöral kök ve progenitör hücrelerin (NPC' ler) farklılaşması için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Fizyolojik elektrik alanları (EF) hücre göçü, farklılaşma, bölünme ve ölümde hayati roller oynar. Bu makalede, mikroskopi kullanılarak uzun süreli hücre farklılaşması çalışması için kullanılan mikroakışkan hücre kültürü sistemi açıklanmaktadır. Mikroakışkan sistem aşağıdaki ana bileşenlerden oluşur: optik olarak şeffaf bir elektrotaktik çip, şeffaf bir indiyum-kalay-oksit (ITO) ısıtıcı, bir kültür medya dolum pompası, bir elektrik güç kaynağı, yüksek frekanslı bir güç amplifikatörü, bir EF çoklayıcı, programlanabilir bir X-Y-Z motorlu aşama ve dijital kamera ile donatılmış ters faz kontrastlı mikroskop. Mikroakışkan sistem, genel deneysel kurulumu ve buna karşılık reaktif ve numune tüketimini basitleştirmede faydalıdır. Bu çalışma, doğru akım (DC) darbe stimülasyonu ile indüklenen nöral kök ve progenitör hücrelerin (NPC' ler) farklılaştırılmasını içerir. Kök hücre bakım ortamında, fare NPC'leri (mNPC'ler) DC darbe stimülasyonundan sonra nöronlara, astrositlere ve oligodendrositlere farklılaştı. Sonuçlar, basit DC nabız tedavisinin mNPC'lerin kaderini kontrol edebileceğini ve sinir sistemi bozuklukları için terapötik stratejiler geliştirmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Sistem, birden fazla kanalda hücre kültürü, uzun süreli EF stimülasyonu, hücre morfolojik gözlemi ve otomatik zaman atlamalı görüntü alımı için kullanılabilir. Bu mikroakışkan sistem sadece gerekli deneysel süreyi kısaltmakla kalmaz, aynı zamanda mikroçevrim üzerindeki kontrol doğruluğunu da arttırır.

Giriş

Nöral öncül hücreler (NPC'ler, nöral kök ve progenitör hücreler olarak da bilinir) nörodejeneratif terapötik strateji için umut verici bir aday olabilir1. Farklılaşmamış NPC'ler kendi kendini yenileme kapasitesine, çoklu güçlülüğe ve proliferatif yete sahip2,3. Daha önceki bir çalışmada hücre dışı matris ve moleküler arabulucuların NPC'nin farklılaşmasını düzenlediği bildirilmiştir. Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) NPC çoğalmasını teşvik eder, böylece farklılaşmamış durumu korur4.

Önceki çalışmalar, elektriksel stimülasyonun bölüm 5 , göç 6 , 7,8, farklılaşma1,9,10ve hücreölümü11gibi hücre fizyolojik faaliyetlerini düzenleyebileceğini bildirmiştir. Elektrik alanları (EF'ler) merkezi sinir sistemi gelişiminin geliştirilmesinde ve yenilenmesinde hayati roller oynar12,13,14. 2009'dan 2019'a kadar bu laboratuvar, EF'nin mikroakışkan sistem 1 ,6 , 7 ,8,15,16,17'dekiuygulamasına verilen hücresel yanıtları araştırmıştır. Çok kanallı, optik olarak şeffaf, elektroaktik (MOE) çip, konfokal mikroskopi için immünofluoresans boyamaya uygun olacak şekilde tasarlanmıştır. Çip yüksek optik şeffaflığa ve iyi dayanıklılığa sahipti ve tek bir çalışmada üç bağımsız stimülasyon deneyinin ve birkaç immünostained koşulun aynı anda yapılmasına izin verdi. Mikroakışkan sistem, genel deneysel kurulumu ve buna karşılık reaktif ve numune tüketimini basitleştirmede faydalıdır. Bu makalede, uzun süreli hücre farklılaşması çalışması için kullanılan mikroakışkan hücre kültürü sisteminin gelişimi açıklanmaktadır.

Protokol

1. MOE çipinin tasarımı ve imalatı

  1. Tek tek polimetil methakril (PMMA) katmanları ve çift taraflı bant için uygun yazılımı kullanarak desenlerçizin(Şekil 1A, Malzeme Tablosu ). Hem PMMA levhalarını hem de çift taraflı bandı CO2 lazer makine katibi (Şekil 1B)ile kesin.
    1. CO2 lazer katipini aç ve kişisel bir bilgisayara bağla. Yazılımı kullanarak tasarlanmış desen dosyasını açın.
    2. PMMA levhaları (275 mm x 400 mm) veya çift taraflı bandı (210 mm x 297 mm) lazer katibinin platformuna yerleştirin (Şekil 2A). Otomatik odaklama aracını kullanarak lazeri PMMA levhalarının yüzeyine veya çift taraflı teybe odaklayın.
    3. Yazıcı olarak lazer katibi seçin ve ardından PMMA sayfasında veya çift taraflı bantta doğrudan ablasyonu başlatmak ve PMMA sayfasında veya bantta tek tek desenler elde etmek için lazer katibi kullanarak deseni "yazdırın"(Şekil 2B).
  2. Koruyucu filmi PMMA levhalarından çıkarın ve yüzeyi azot gazı kullanarak temizleyin.
    NOT: PMMA deseninin çizimi ve PMMA levhasının doğrudan işlenmesi önceki bir rapora göregerçeklenmiştir 17.
  3. Pmma levhaların birden fazla katmanını bir araya getirmek için, 1 mm PMMA levhadan üç parça (Katman 1, 2 ve 3) istifleyin ve akış / elektrik stimülasyon kanalı montajını oluşturmak için110 ° C'de 30 dakika boyunca bir termal bonderde 5 kg / cm 2 basınç altında yapıştırın ( Şekil2C).
    NOT: Ticari olarak elde edilen farklı PMMA levha partileri biraz farklı cam geçiş sıcaklığına (Tg) sahiptir. Optimum yapıştırma sıcaklığının Tg'ye yakın 5 °C artışlarla test edilmesi gerekir.
  4. Hızlı etkili siyanoakrilat tutkal ile MOE çip tertibatının Katman 1'deki bireysel açıklıklara 12 parça adaptör yapıştırın.
    NOT: Adaptörler enjeksiyon kalıplama ile PMMA'dan yapılmıştır. Alttaki düz yüzeyler MOE çipine bağlanmak içindir. 1/4W-28 dişi vidalı diş taşıyan adaptörler, beyaz parmakla sıkı fişleri, düz alt konektörleri veya Luer adaptörlerini bağlamak içindir. Hızlı etkili siyanoakrilat tutkal kullanırken dikkatli olun. Gözlere sıçramaktan kaçının.
  5. Çipi monte etmeden önce 30 dakika boyunca ultraviyole (UV) ışınlama kullanarak 1 mm PMMA yüzeylerini (Katman 1-3), çift taraflı bandı (Katman 4) ve 3 mm optik sınıf PMMA'yı (Katman 5) dezenfekte edersiniz (Şekil 1A).
  6. PMMA montajını (Katmanlar 1-5)(Şekil 1A)tamamlamak için 3 mm optik sınıf PMMA'daki (Katman 1-3) 1 mm PMMA substratlarını (Katman 5) çift taraflı bantla (Katman 4) yapıştırın.
  7. Talaş üzerindeki montaj için temiz kapak camını hazırlayın.
    1. Deterjanın on kat seyreltilmesini bir boyama kavanozuna doldurun (Malzeme Masası'nabakın) ve bu deterjandaki kapak camını ultrasonik bir temizleyici kullanarak 15 dakika boyunca temizleyin.
    2. Deterjanın tüm izlerini gidermek için boyama kavanozunu akan musluk suyunun altında iyice durulayın.
    3. Musluk suyunun tüm izlerini gidermek için damıtılmış suyla durulama işlemine devam edin ve 1.7.2 adımını iki kez tekrarlayın.
    4. Temizlenen kapak camını azot gazı ile üfleyerek kurutun.
  8. PMMA tertibatını (Katmanlar 1-5), çift taraflı bandı (Katman 6) ve kapak camını (Katman 7) çipi monte etmeden önce 30 dakika boyunca bir biyogüvenlik kabini içinde UV ışınlamasını kullanarak dezenfekte etmeyin(Şekil 1A).
  9. Temizlenen kapak camını (Katman 7) çift taraflı bantla (Katman 6) (Şekil 1A) PMMA tertibatine (Katman1-5)yapıştırın.
  10. MOE çipini bir gecede bir vakum odasında kuluçkaya yatırın; sonraki prosedürler için MOE çip montajını kullanın (Şekil 3).

2. Hücre kültürü bölgelerindeki substrat üzerindeki poli-L-lizin (PLL) kaplama

  1. Politetrafloroetilen tüp, düz-alt konektör, koni konektörü, koni-Luer adaptörü, beyaz parmak sıkı fiş (stoper olarak da adlandırılır), Luer adaptörü, Luer kilit şırıngını ve siyah kauçuk bung'u hazırlayın (Şekil 4A, Malzeme Masası). Yukarıdaki tüm bileşenleri 121 °C'de bir otoklavda 30 dakika sterilize edin.
  2. Agar köprüsü adaptörlerinin açıklıklarını (Şekil 1A) beyaz parmak sıkı fişlerle kapatın. Düz tabanlı konektörü orta giriş ve çıkış adaptörleri(Şekil 4B)aracılığıyla MOE talaş tertibatine bağlayın. Koni-Luer adaptörini 3 yönlü stopcock'lara bağlayın.
  3. Orta girişin 3 yönlü stopcock'una bağlanan 3 mL şırıngır kullanarak 2 mL% 0.01 PLL çözeltisi ekleyin (Şekil 4B- figure-protocol-4935 ).
  4. Orta çıkışın 3 yönlü stopcock'una boş bir 3 mL şırıngır bağlayın (Şekil 4B- figure-protocol-5145 ).
  5. Hücre kültürü bölgelerini PLL çözümüyle doldurun. Kaplama solüsyonunu yavaşça ileri geri manuel olarak pompalar. Çözeltiyi kültür bölgelerine kapatmak için iki 3 yönlü stopcock'u kapatın.
  6. MOE çipini %5 CO2 atmosferi ile dolu bir inkübatörde bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.

3. Tuz köprüsü ağının hazırlanması

  1. 2.6. adımı takiben, iki şırınnayı kullanarak kaplama solüsyonunu kanala ileri geri manuel olarak pompalayarak iki 3 yönlü stopcock'u açın ve kanallardaki kabarcıkları yıkayın.
  2. 3 mL komple ortam çizin (Dulbecco'nun modifiye Eagle orta/Ham besin karışımı F-12 (DMEM/F12), %2 B-27 takviyesinden oluşan kök hücre bakım ortamı, 20 ng/mL EGF ve 20 ng/mL bFGF), orta girişin 3 yönlü stopcock'una bağlanan 3 mL şırınna (Şekil 4B- figure-protocol-6091 ve Şekil 4B- figure-protocol-6225 ).
  3. Hücre kültürü bölgelerindeki kaplama çözeltisini değiştirmek için 3 mL tam orta ekleyin. Orta çıkışın 3 yönlü stopcock'una boş bir 5 mL şırıngır bağlayın (Şekil 4B- figure-protocol-6524 ).
  4. Tuz köprüsü ağını hazırlayın (Şekil 5).
    1. Bir boşluk oluşturmak için siyah kauçuk bung'u kesin ve gümüş (Ag)/gümüş klorür (AgCl) elektrotlarını siyah kauçuk bung'dan geçirip Luer kilit şırıngına yerleştirin (Şekil 4A).
    2. Beyaz parmak ucu fişini Luer adaptörü ile değiştirin ve Luer adaptörünü doldurmak için% 3 sıcak agarose enjekte edin.
      NOT: Sıcak agazozun hazırlanması için, 3 g agarose tozunun 100 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün ve 121 °C'de bir otoklavda 30 dakika sterilize edin.
    3. Luer kilit şırındını Luer adaptörüne bağlayın. Şırıngayı iğneyle kullanarak Luer kilit şırıngasını doldurmak için siyah kauçuk bung'dan% 3 sıcak agarose enjekte edin. Agarose'un soğuması ve katılaşması için 10 ila 20 dakika bekleyin.
      NOT: Agarose'un hacim kapasitesini artırmak için, Luer kilit şırıngası Luer adaptörüne monte edilir (Şekil 4 ve Şekil 5). Daha sonra, büyük elektrotlar Luer kilit şırındıcına yerleştirilir. Elektrot, uzun süreli deney için istikrarlı bir elektriksel uyarım sağlayabilir.

4. MNPC'lerin Hazırlanması

  1. MNPC'leri1'i% 5 CO 2 atmosferi ile dolu bir inkübatörde 37 ° C'de25T hücre kültürü şişesinde tam ortamda kültür edin. Hücreleri her 3-4 günde bir alt kültüre alın ve orijinal kaynaktan 3-8 geçiş geçirmiş hücrelerle tüm deneyleri yapın.
  2. Hücre süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarın ve nörosferleri 5 dakika boyunca 100 × g'da aşağı çevirin. Süpernatantı aspire edin ve nörosferleri 1x Dulbecco PBS (DPBS) ile yıkayın. Nörosferleri 5 dakika boyunca 100 × g'da aşağı çevirin.
  3. 1x DPBS'yi aspire edin ve ardından nörosferleri tam ortamda yeniden diriltin. İyice ve nazikçe karıştırın.
  4. Çıkışın 3 yönlü stopcock'una bağlanan 1 mL şırıngır kullanarak nörosfer süspansiyonunun 1 mL'lik kısmını ekleyin (Şekil 4B- figure-protocol-8688 ).

5. DC darbe stimülasyonu için mikroakışkan sistemin kurulumu (Şekil 6)

  1. Hücre tohumlu MOE çipini programlanabilir bir X-Y-Z motorlu sahneye tutturulmuş şeffaf ITO ısıtıcıya takın.
    NOT: ITO yüzey sıcaklığı orantılı-integral türev kontrolör tarafından kontrol edilir ve 37 °C'de tutulur. Çip içindeki hücre kültürü bölgelerinin sıcaklığını izlemek için çip ve ITO ısıtıcısı arasına K tipi bir termokuple kenetlenir. MOE çipi programlanabilir bir X-Y-Z motorlu sahneye monte edilir ve tek tek kanal bölümlerinde otomatik zaman atlamalı görüntü alımı için uygundur. ITO ısıtıcının imalatı ve hücre kültürü ısıtma sisteminin kurulumu daha önceaçıklanmıştır 18,19.
  2. MNPC'leri, orta çıkış üzerinden MOE çipine manuel pompalayarak demleyin. Hücre tohumlu MOE çipini 37 °C ITO ısıtıcıda 4 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
  3. 4 saat sonra, bir şırıng pompası kullanarak 20 μL/ s akış hızında orta giriş yoluyla MOE çipi aracılığıyla tam ortamı pompalayın.
    NOT: MNPC'ler, hücre bağlanmasına ve büyümesine izin vermek için EF stimülasyonundan önce 24 saat daha çipte yetiştirilir ve korunur. Atık sıvı, Şekil 6A'da"atık" olarak gösterilen çıkışın 3 yönlü stopcock'una bağlı boş bir 5 mL şırınna içinde toplanır. MOE mikroakışkan sistem yapılandırması Şekil 6'da gösterilmiştir. Bu mikroakışkan sistem hücrelere sürekli beslenme sağlar. Tam taze ortam, sabit bir pH değerini korumak için sürekli olarak MOE çipine pompalanır. Bu nedenle, hücreler bir CO2 inkübatörü dışında kültürlenebilir.
  4. Çip üzerindeki Ag/AgCl elektrotları aracılığıyla MOE çipine bir EF çoklayıcı bağlamak için elektrik kablolarını kullanın. %50 görev döngüsünde (%50 zaman açık ve %50 zaman kaybetme) 100 Hz frekansta 300 mV/mm şiddetinde kare dalga DC darbeleri çıkarmak için bir EF çoklayıcı ve bir fonksiyon üreteciyi amplifikatöre bağlayın(Şekil 6B).
    1. Elektrik kablolarını EF çoklayıcıya bağlayın. Elektrik kablolarını Ag/AgCl elektrotları aracılığıyla MOE çipine bağlayın.
    2. EF çoklayıcıyı elektrik tellerini kullanarak amplifikatöre bağlayın. Fonksiyon jeneratörünü amplifikatöre ve dijital osiloskopa bağlayın.
      NOT: EF çoklayıcı, devredeki kültür odasının empedansını içeren ve tüm bireysel odaları paralel bir elektronik ağa bağlayan bir devredir. Üç kültür odasının her biri, çoklayıcıdaki değişken bir direnç (Vr) ve bir ammetreye (Şekil 6A'da μAolarak gösterilir) seri olarak bağlanır. Her kültür odasındaki elektrik akımı Vr'ı kontrol ederek değişir ve akım ilgili ammetrede gösterilir. Her hücre kültürü bölgesindeki elektrik alanı gücü Ohm Yasası, I= φEA, elektrik akımı olduğum, σ (DMEM/ F12 20 için1.38 S·m-1olarak ayarlanır) kültür ortamının elektrik iletkenliği, E elektrik alanı ve A elektrottik odanın kesit alanıdır. Şekil 1'degösterilen hücre kültürü bölge boyutu için, elektrik akımı sırasıyla %50 görev döngüsünde DC ve DC darbesi için ~87 mA ve ~44 mA'dır.
  5. MNPC'leri 48 saat boyunca 100 Hz frekansta 300 mV/mm büyüklüğünde kare DC darbelere tabi edin. Hücrelere yeterli beslenmeyi sağlamak ve ortamda sabit bir pH değerini korumak için tam ortamı 10 μL/s hızında sürekli pompalayın.

6. Darbeli DC stimülasyonundan sonra mNPC'lerin immünofluoresans tahlilleri

NOT: Bu adımda, tüm reaktifler bir şırınna pompası kullanılarak orta giriş yoluyla pompalanır.

  1. Tohumlamadan sonra 3, 7 veya 14 gün in vitro (DIV) kültlemeden sonra1, hücreleri 25 μL / dk akış hızında 1x PBS ile 20 dakika yıkayın.
  2. Hücreleri %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitle. 1x PBS'yi değiştirmek için 20 dakika boyunca 25 μL/dk akış hızında çipe %4 PFA pompala. % 4 PFA'yı değiştirmek için, hücreleri 20 dakika boyunca 25 μL / dk akış hızında 1x PBS ile yıkayın.
  3. Hücrelerin dengesini sağlamak için 6 dakika boyunca 50 μL/dk akış hızında çipe %0,1 Triton X-100 pompala. Hücrelere tepki vermek için 30 dakika daha akış hızını 50 μL/s'ye düşürün. % 0,1 Triton X-100'ü değiştirmek için, hücreleri 6 dakika boyunca 50 μL / dk akış hızında 1x PBS ile yıkayın.
  4. Spesifik olmayan antikor bağlanmasını azaltmak için % 1 sığır serum albümini (BSA) içeren PBS ile hücreleri engelleyin. Çipe 6 dakika boyunca 50 μL/dk debide %1 BSA pompala. Debiyi 100 μL/s'ye düşürün ve 1 saat pompaya düşürün.
  5. Çift immünostaining için antikorları 6 dakika boyunca 50 μL/ dk akış hızında çipe pompala ve çipi 4 °C'de 18 saat kuluçkaya yatır. Hücreleri 1x PBS ile 50 μL/dk akış hızında 15 dakika boyunca yıkayın.
  6. Alexa Fluor konjuge ikincil antikorları 6 dakika boyunca 50 μL/dk akış hızında çipe pompala. Akış hızını 50 μL/s'ye düşürün ve antikorları karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat pompalayın. Hücreleri 1x PBS ile 50 μL/dk akış hızında 15 dakika boyunca yıkayın.
  7. Nükleer boyama için Hoechst 33342'yi karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 20 μL/dk akış hızında talaşın içine pompalayın. Hücreleri 1x PBS ile 50 μL/dk akış hızında 15 dakika boyunca yıkayın.
  8. İmmünasyondan sonra, konfokal floresan mikroskop kullanarak hücreleri gözlemleyin.

7. Görüntü analizi ve veri işleme

  1. Floresan görüntüleri yerleşik ölçüm araçlarıyla yazılım kullanarak analiz edin (Bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Kontrol ve tedavi gruplarındaki Hoechst-counterstained çekirdeklerini (toplam hücre sayısı) karşılaştırın ve her fenotipik işaretçiyi ifade eden hücrelerin yüzdesini hesaplayın.

Sonuçlar

MOE çipinin ayrıntılı yapılandırması Şekil 1'de gösterilmiştir. Mikroakışkan çip, deneysel kurulum boyutunu, numune hacmini ve reaktif hacmini azaltmak için yararlı bir yaklaşım sağlar. MOE çipi, tek bir çalışmada aynı anda üç bağımsız EF stimülasyon deneyi ve birkaç immünostaining koşulu gerçekleştirmek için tasarlanmıştır (Şekil 3). Ek olarak, yüksek optik şeffaflığa sahip MOE çipi ko...

Tartışmalar

MOE çipinin imalatı sırasında, adaptörler hızlı etkili siyanoakrilat tutkal ile MOE çipinin Katman 1'ine bağlanır. Tutkal adaptörlerin 4 köşesine uygulanır ve daha sonra adaptörlerin üzerine eşit basınç uygulanır. Tutkalın tam polimerizasyonunu sağlamak için fazla miktarda tutkaldan kaçınılmalıdır. Ayrıca, tamamlanan MOE talaş montajı bir vakum odasında inkübe edilir. Bu adım PMMA katmanı, çift taraflı bant ve kapak camı arasındaki kabarcıkların giderilmesine yardımcı olur.

...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, Fare sinir sapı ve progenitör hücrelerin (mNPC' ler) sağlanmasındaki yardımı için Academia Sinica Biyomedikal Bilimler Enstitüsü'nden Profesör Tang K. Tang'a teşekkür ediyor. Yazarlar ayrıca Profesör Tang K. Tang ve Bayan Ying-Shan Lee'ye MNPC'lerin farklılaşması konusundaki değerli tartışmaları için teşekkür ediyor.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mm PMMA substrates (Layers 1-3)BHTK2R20Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL plastic tubeProtech Technology Enterprise Co., LtdCT-15-PL-TWConical bottomed tube with cap, assembled, presterilized
3 mL syringeTERUMODVR-34133 mL oral syringes, without needle
3 mm optical grade PMMA (Layer 5)CHI MEI CorporationACRYPOLY PMMA SheetOptical grade PMMA
3-way stopcockNIPRONCN-3LSterile disposable 3-way stopcock
5 mL syringeTERUMODVR-34105 mL oral syringes, without needle
AdaptorDong Zhong Co., Ltd.CustomizedPMMA adaptor
AgaroseSigma-AldrichA9414Agarose, low gelling temperature
AmplifierA.A. Lab Systems LtdA-304High voltage amplifier
AutoCAD softwareAutodeskEducational VersionDrafting
B-27 supplementGibco12587-010B-27 supplement (50x), minus vitamin A
Basic fibroblast growth factor (bFGF) PeprotechAF-100-18BAlso called recombinant human FGF-basic
Black rubber bungTERUMODVR-3413From 3 mL oral syringes, without needle
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichB4287Blocking reagent 
CentrifugeHSIANGTAICV2060Centrifuge
CO2 laser scriberLaser Tools and Technics Corp. ILS-IIPurchased from http://www.lttcorp.com/index.htm
Cone connectorIDEX Health & ScienceF-120XOne-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural
Cone-Luer adaptorIDEX Health & ScienceP-659Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK
Confocal fluorescence microscopeLeica MicrosystemsTCS SP5Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Digital cameraOLYMPUSE-330Automatic time-lapse image acquisition
Digital oscilloscopeTektronixTDS2024Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency.
Double-sided tape3M PET 8018Purchased from http://en.thd.com.tw/
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)Gibco12400024DMEM/F-12, powder, HEPES
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Gibco21600010DPBS, powder, no calcium, no magnesium
EF multiplexerAsiatic Sky Co., Ltd.CustomizedMonitor and control the electric current in individual channels
Epidermal growth factor (EGF)PeprotechAF-100-15Also called recombinant human EGF
Fast-acting cyanoacrylate glue3M 7004TStrength instant adhesive (liquid)
Flat bottom connectorIDEX Health & ScienceP-206Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue
Function generatorAgilent Technologies33120AHigh-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability
Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150117Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed
Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555)Abcamab150086Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed
Hoechst 33342InvitrogenH3570Nuclear staining
ImageJ softwareNational Institutes of Health1.48vAnalyze the fluorescent images 
Indium–tin–oxide (ITO) glassMerck300739For ITO heater
Inverted phase contrast microscopeOLYMPUSCKX41For cell morphology observation
K-type thermocoupleTecpelTPK-02ATemperature thermocouples
Luer adapterIDEX Health & ScienceP618-01Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene
Luer lock syringeTERUMODVR-3413For agar salt bridges
Mouse anti-GFAPeBioscience14-9892Astrocytes marker
Oligodendrocyte  marker  O4  antibodyR&D SystemsMAB1326Oligodendrocytes marker
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148Fixing agent
Phosphate buffered saline (PBS)Basic LifeBL2651Washing solution
Poly-L-Lysine (PLL)SIGMAP4707Coating solution
Precision cover glasses thickness No. 1.5HMARIENFELD107242https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programmable X-Y-Z motorised stageTanlian IncCustomizedPurchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportional–integral–derivative (PID) controllerToho ElectronicsTTM-J4-R-ABTemperature controller 
PTFE tubeProfessional Plastics Inc. Taiwan BranchOuter diameter 1/16 InchesWhite translucent PTFE tubing
Rabbit anti-Tuj1Abcamab18207Neuron marker
Syringe pumpNew Era Systems IncNE-1000NE-1000 programmable single syringe pump
TFD4 detergentFRANKLABTFD4Cover glass cleaner
Thermal bonderKuan-MIN Tech Co.CustomizedPurchased from http://kmtco.com.tw/
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Permeabilized solution
Ultrasonic cleanerLEOLEO-300SUltrasonic steri-cleaner
Vacuum chamberDENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.DOV-30Vacuum drying oven
White fingertight plugIDEX Health & ScienceP-3161/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html

Referanslar

  1. Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
  2. Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
  3. Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
  4. Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
  5. Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
  6. Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
  7. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
  8. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
  9. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
  10. Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
  11. Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
  12. Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
  13. Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
  14. Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
  15. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
  16. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
  17. Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
  19. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
  20. Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
  21. AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
  22. Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 170Elektrik alanlarn ral k k ve progenit r h crelerfarkl la mapolimetil methakrilatPMMAmikroak kan sistem

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır