미세 유체 장치에서 전기장 유발 신경 전구체 세포 분화

요약

이 연구에서는, 우리는 신경 줄기와 전구 세포 (NPC)의 분화를 위한 프로토콜을 제시합니다(NPC) 전적으로 미세 유체 시스템에서 직접 전류 (DC) 펄스 자극에 의해 유도.

초록

생리전기장(EF)은 세포 이동, 분화, 분열 및 사망에 중요한 역할을 합니다. 이 논문은 현미경 검사를 사용하여 장기 세포 분화 연구에 사용 된 미세 유체 세포 배양 시스템을 설명합니다. 미세 유체 시스템은 광학적으로 투명한 전기 전술 칩, 투명한 인듐 틴-옥사이드(ITO) 히터, 배양 미디어 충전 펌프, 전기 전원 공급 장치, 고주파 파워 앰프, EF 멀티플렉서, 프로그래밍 가능한 X-Y-Z 동력 단계, 그리고 디지털 카메라가 장착된 반전 위상 마이크로 콘트라스트 등 다음과 같은 주요 구성 요소로 구성됩니다. 미세 유체 시스템은 전반적인 실험 설정을 단순화하고 시약 및 시료 소비를 단순화하는 데 유용합니다. 이 작업은 직접 전류 (DC) 펄스 자극에 의해 유도 된 신경 줄기 및 전구 세포 (NPC)의 분화를 포함한다. 줄기 세포 유지 배지에서, 마우스 NPC (mNPC)는 DC 펄스 자극 후 뉴런, 성상 세포 및 올리고드 엔드로시테로 분화되었다. 결과는 간단한 DC 펄스 처리가 mNpCs의 운명을 통제할 수 있고 신경계 무질서를 위한 치료 전략을 개발하는 것을 이용될 수 있었다는 것을 건의합니다. 이 시스템은 여러 채널의 세포 배양, 장기 EF 자극, 세포 형태 학적 관찰 및 자동 시간 경과 이미지 수집에 사용할 수 있습니다. 이 미세 유체 시스템은 필요한 실험 시간을 단축할 뿐만 아니라 미세 환경에 대한 제어 정확도도 증가합니다.

서문

신경 전구체 세포(NPC, 신경 줄기 및 전구세포라고도 함)는 신경퇴행성 치료 전략^1에대한 유망한 후보일 수 있다. 차별화되지 않은 NPC는 자체 갱신 능력, 다중 효능 및 증식 능력^2,3을가지고 있습니다. 이전 연구는 세포외 매트릭스와 분자 중재자가 NPC의 분화를 조절한다고 보고했습니다. 표피 성장 인자(EGF) 및 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF)는 NPC 증식을 촉진하여 미분화 상태^4를유지한다.

이전 연구는 전기 자극이 분열^5,마이그레이션^6,7,8,분화^1,9,10및 세포 사멸(11)과 같은 세포 생리적 활동을 조절할 수 있다고^{보고하였다.} 전기장(EF)은 중추신경계 개발^12,13,14의개발 및 재생에 중요한 역할을 한다. 2009년부터 2019년까지, 이 실험실은 미세유체 시스템^{1,6,7,8,15,16,}17에서 EF의^적용에대한 세포 반응을^{조사했다.} 멀티채널, 광학적으로 투명한, 전기전술(MOE) 칩은 공초점 현미경검사법에 면역형광 염색에 적합하도록 설계되었습니다. 칩은 높은 광학 투명성과 좋은 내구성을 가지고 있으며, 하나의 연구에서 세 개의 독립적 인 자극 실험과 여러 면역 스테인드 조건의 동시 수행을 허용했다. 미세 유체 시스템은 전반적인 실험 설정을 단순화하고 시약 및 시료 소비를 단순화하는 데 유용합니다. 이 논문은 장기 세포 분화 연구에 사용 된 미세 유체 세포 배양 시스템의 개발을 설명합니다.

프로토콜

1. MOE 칩의 설계 및 제조

1. 개별 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 레이어 및 적절한 소프트웨어를 사용하여 양면 테이프에 대한 패턴을그립니다(그림 1A,재료의 표). CO₂ 레이저 기계 스크라이브(도1B)로PMMA 시트와 양면 테이프를 모두 잘라냅니다.
   1. CO₂ 레이저 스크라이브를 켜고 개인용 컴퓨터에 연결합니다. 소프트웨어를 사용하여 설계된 패턴 파일을 엽니다.
   2. PMMA 시트(275mm x 400mm) 또는 양면 테이프(210mm x 297mm)를 레이저 스크라이브(그림2A)의플랫폼에 놓습니다. 자동 초점 도구를 사용하여 PMMA 시트 또는 양면 테이프의 표면에 레이저를 집중합니다.
   3. 레이저 스크라이브를 프린터로 선택한 다음 레이저 스크라이브를 사용하여 패턴을 "인쇄"하여 PMMA 시트 또는 양면 테이프에서 직접 절제를 시작하고 PMMA 시트 또는테이프(도 2B)에서개별 패턴을 얻습니다.
2. PMMA 시트에서 보호 필름을 제거하고 질소 가스를 사용하여 표면을 청소하십시오.
   참고: PMMA 패턴의 도면 및 PMMA 시트의 직접 가공은 이전 보고서^17에따라 수행되었다.
3. PMMA 시트의 여러 층을 결합하기 위해, 1mm PMMA 시트의 3 개 조각 (레이어 1, 2 및 3)을 쌓고 110 °C에서 30 분 동안 열 본더에서 5kg / cm^2의 압력하에서 결합하여 유동 / 전기 자극 채널 어셈블리(그림 2C)를형성합니다.
   참고: 상업적으로 획득한 PMMA 시트의 상이한 배치는 약간 다른 유리 전이 온도(Tg)를 가지는 데. 최적의 접합 온도는 Tg에 가까운 5°C 증분에서 테스트해야 합니다.
4. 빠르게 작용하는 시아노아크라일트 접착제로 MOE 칩 어셈블리의 레이어 1의 개별 개구부에 12개의 어댑터를 부착합니다.
   참고: 어댑터는 사출 성형에 의해 PMMA로 만들어집니다. 하단의 평평한 표면은 MOE 칩에 연결하기 위한 것입니다. 1/4W-28 의 여성 나사 스레드가 있는 어댑터는 흰색 손가락이 단단한 플러그, 평평한 바닥 커넥터 또는 Luer 어댑터를 연결하기 위한 것입니다. 빠르게 작용하는 시아노아크라일트 접착제를 사용할 때는 주의하십시오. 눈에 튀는 것을 피하십시오.
5. 칩 조립 전에 30분 동안 자외선(UV) 조사를 이용하여 1mm PMMA 기판(Layer 1-3), 양면 테이프(Layer 4), 및 3mm 광학 등급PMMA(Layer 5)를 소독한다.
6. PMMA 어셈블리(도 1-5)를 완료하기 위해 양면 테이프(Layer 4)와 함께 3mm 광학 등급 PMMA(Layer 5)에 1mmPMMA 기판(Layer 1-3)을 부착한다.
7. 칩의 조립을 위해 깨끗한 커버 유리를 준비합니다.
   1. 스테인링 항아리에 세제의 10배 희석제를 채우고(재료의 표참조) 초음파 클리너를 사용하여 이 세제의 커버 글래스를 15분 간 청소합니다.
   2. 흐르는 수돗물 아래에 염색 항아리를 철저히 헹구어 세제의 모든 흔적을 제거합니다.
   3. 증류수로 헹구어 수돗물의 모든 흔적을 제거하고 1.7.2단계를 두 번 반복합니다.
   4. 질소 가스로 불어 청소 된 커버 유리를 건조.
8. PMMA 어셈블리(레이어 1-5), 양면 테이프(Layer 6), 및 칩 조립 전에 30분 동안 생물안전 캐비닛 내부의 UV 조사를 사용하여 커버글래스(Layer7)를 소독한다.
9. 양면 테이프(도 6)로 청소된 커버 글래스(레이어7)를PMMA 어셈블리(레이어 1-5레이어)에 부착한다.
10. 하룻밤 진공 챔버에서 MOE 칩을 배양; 후속 절차에 대한 MOE 칩 어셈블리를사용합니다(그림 3).

2. 세포 배양 영역의 기판에 폴리 L-리신(PLL)을 코팅

1. 폴리테트라플루오로틸렌 튜브, 플랫 바텀 커넥터, 콘 커넥터, 콘-루어 어댑터, 화이트 핑거 타이트 플러그(스토퍼라고도 함), 루어 어댑터, 루어 잠금 주사기 및 검은 고무붕(그림 4A,재료 표)을 준비한다. 위의 모든 부품을 121°C에서 30분 동안 자동 복제로 살균합니다.
2. 흰색 손가락 꽉 플러그와 함께 천 교량 어댑터(그림 1A)의개구부를 밀봉합니다. 중간 입구 및 콘센트 어댑터(도4B)를통해 평평한 하단 커넥터를 MOE 칩 어셈블리에 연결합니다. 콘 루어 어댑터를 3방향 스톱콕에 연결합니다.
3. 중간 입구의 3방향 스톱콕에 연결되는 3mL 주사기를 사용하여 0.01% PLL 용액2mL을 추가합니다(도4B -).
4. 중간 콘센트의 3 방향 스톱콕에 빈 3 mL 주사기를 연결(도 4B -).
5. PLL 용액으로 세포 배양 영역을 채웁니다. 코팅 용액을 천천히 앞뒤로 펌핑합니다. 문화 영역 내부의 솔루션을 밀봉하기 위해 두 개의 3 방향 스톱콕을 닫습니다.
6. 5% CO₂ 대기로 채워진 인큐베이터에서 하룻밤 동안 37°C에서 MOE 칩을 배양합니다.

3. 소금 교량 네트워크 준비

1. 다음 단계 2.6, 두 개의 3 방향 스톱콕을 열고 수동으로 두 주사기를 사용하여 채널에서 코팅 용액을 앞뒤로 펌핑하여 채널의 거품을 플러시.
2. 완벽한 매체(덜벡코의 수정된 이글의 매체/햄의 영양소 혼합물 F-12(DMEM/F12)로 구성된 줄기세포 유지보수 배지, 2% B-27 보충제, 20 ng/mL EGF, 및 20 ng/mL bFGF) 3 mL 주사기로 배지 입구의 3방향 스톱콕에연결(도 4B- 및 도 4B -).
3. 세포 배양 영역에서 코팅 용액을 대체하기 위해 완전한 배지 3mL를 추가합니다. 중간 콘센트의 3 방향 스톱콕에 빈 5 mL 주사기를 연결(도 4B -).
4. 소금 교량네트워크(그림 5)를준비합니다.
   1. 검은 고무 덩어리를 잘라 틈새를 생성하고, 검은 고무 붕을 통해 및 루어 잠금 주사기(도 4A)에은 (Ag)/실버 염화물 (AgCl) 전극을 삽입합니다.
   2. 흰색 손가락 밀폐 플러그를 Luer 어댑터로 교체하고 3% 뜨거운 아가로즈를 주입하여 Luer 어댑터를 채웁니다.
      참고: 뜨거운 아가로즈를 준비하기 위해, 100mL의 인산염 완충식식염수(PBS)에 아가로즈 분말 3g을 용해하고 121°C에서 30분 동안 오토클레이브로 살균한다.
   3. Luer 잠금 주사기를 Luer 어댑터에 연결합니다. 검은 고무 붕을 통해 3 % 뜨거운 아가로즈를 주입하여 주사기를 바늘로 사용하여 Luer 잠금 주사기를 채웁니다. 아가로즈가 식히고 굳어지도록 10-20분 간 허용합니다.
      참고: 아가로즈의 부피 용량을 늘리기 위해 Luer 잠금 주사기가 Luer 어댑터(그림4 및 도 5)에장착됩니다. 그런 다음 대형 전극을 Luer 잠금 주사기에 삽입합니다. 전극은 장기 실험을 위해 안정적인 전기 자극을 제공할 수 있습니다.

4. mNPC 준비

1. mNNP^1을 5%_CO2 대기로 채워진 인큐베이터에서 37°C에서 37°C에서 25T 세포 배양 플라스크에서 완전한 배지로 배양한다. 세포를 3-4일마다 배양하고, 원래 소스로부터 3-8개의 구절을 거친 세포를 가진 모든 실험을 수행한다.
2. 세포 현탁액을 15mL 원문 튜브로 옮기고, 신경구를 100 × g에서 5분 동안 스핀다운한다. 슈퍼나탈을 흡인시키고, 1x 덜벡코의 PBS(DPBS)로 신경구를 씻는다. 신경구를 100 × g에서 5분 동안 스핀다운합니다.
3. 1x DPBS를 흡인한 다음 전체 배지에서 신경구를 다시 분리합니다. 철저하고 부드럽게 섞습니다.
4. 콘센트의 3방향 스톱콕에 연결되는 1mL 주사기를 사용하여 신경권 서스펜션 1mL를 추가한다(도4B -).

5. DC 펄스 자극을위한 미세 유체 시스템의 설정(그림 6)

1. 프로그래밍 가능한 X-Y-Z 전동 스테이지에 고정된 투명 ITO 히터에 셀 시드 MOE 칩을 설치합니다.
   참고: ITO 표면 온도는 비례 일체형 유도체 제어기에 의해 제어되고 37°C에서 유지됩니다. K형 열전대는 칩 내의 세포 배양 영역의 온도를 모니터링하기 위해 칩과 ITO 히터 사이에 고정된다. MOE 칩은 프로그래밍 가능한 X-Y-Z 전동 단계에 설치되며 개별 채널 섹션에서 자동 타임랩스 이미지 획득에 적합합니다. ITO 히터의 제조 및 세포 배양 가열 시스템의 설정은 이전에^18,19로기술되었다.
2. 중간 콘센트를 통해 MOE 칩에 수동 펌핑하여 mNPC를 주입합니다. 세포 시드 MOE 칩을 37°C ITO 히터에 4시간 동안 배양한다.
3. 4시간 후, 주사기 펌프를 사용하여 20 μL/h의 유량으로 매체 입구를 통해 MOE 칩을 통해 전체 배지를 펌핑한다.
   참고: mNNC는 EF 자극 전에 추가로 24시간 동안 칩에서 재배되고 유지되어 세포 부착 및 성장을 허용합니다. 폐액은 도 6A에서"폐기물"로 표시된 콘센트의 3방향 스톱콕에 연결된 빈 5mL 주사기로 수거된다. MOE 미세 유체 시스템 구성은 도 6에도시되어 있다. 이 미세 유체 시스템은 세포에 영양의 지속적인 공급을 제공합니다. 완전한 신선한 매체는 일정한 pH 값을 유지하기 위해 MOE 칩으로 지속적으로 펌핑됩니다. 따라서, 세포는 CO₂ 인큐베이터 외부에서 배양될 수 있다.
4. 전기 전선을 사용하여 칩의 Ag/AgCl 전극을 통해 EF 멀티플렉서를 MOE 칩에 연결합니다. EF 멀티플렉서와 기능 발생기를 증폭기에 연결하여 50% 듀티 사이클(50% 시간 켜기 및 50% 시간 간격)에서 100Hz의 주파수에서 300mV/mm의 크기로 출력제곱파 DC 펄스를 출력합니다(50% 시간 온 및 50% 시간 끄기)(그림6B).
   1. 전선을 EF 멀티플렉서에 연결합니다. Ag/AgCl 전극을 통해 전기 와이어를 MOE 칩에 연결합니다.
   2. EF 멀티플렉서를 전선을 사용하여 증폭기에 연결합니다. 기능 생성기를 앰프 및 디지털 오실로스코프에 연결합니다.
      참고: EF 멀티플렉서는 회로내 배양 챔버의 임피던스를 포함하고 병렬 전자 네트워크의 모든 개별 챔버를 연결하는 회로입니다. 3개의 배양 챔버는 각각 멀티플렉스에서 가변 저항기(Vr) 및 심미터(도 6A에서μA로 도시됨)에 연재되어 전기적으로 연결된다. 각 배양챔버를 통한 전류는 Vr을 제어하여 다양하며, 전류는 해당 심미터상에 도시된다. 각 세포 배양 영역의 전기장 강도는 옴의 법칙, I=θEA에 의해 계산되었으며, 여기서 나는 전류, σ(DMEM/F12^20에대한 1.38^S·m-1로 설정)은 배양 배지의 전기 전도도이며, E는 전기장이며, A는 전기챔버의 단면 영역이다. 도 1에도시된 세포 배양 영역 치수의 경우, 전류는 DC 및 DC 펄스에 대해 각각 50% 듀티 사이클에서 ~87mA 및 ~44mA이다.
5. mNPC를 48h의 100Hz 주파수에서 300mV/mm의 크기로 DC 펄스를 제곱하도록 합니다. 세포에 적절한 영양을 공급하고 매체에서 일정한 pH 값을 유지하기 위해 10 μL/h의 속도로 전체 배지를 지속적으로 펌핑합니다.

6. 펄스 DC 자극 후 mNpC의 면역 불광 분석

참고: 이 단계에서는 모든 시약이 주사기 펌프를 사용하여 중간 입구를 통해 펌핑됩니다.

1. 1번 시드 후 3, 7일 또는 14일 동안체외(DIV)를 배양한 후, 20분 동안 25 μL/min의 유속도로 1x PBS로 세포를 세척한다.
2. 4% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 수정합니다. 1x PBS를 대체하기 위해 25 μL/min의 유속으로 칩에 4% PFA를 펌프합니다. 4% PFA를 대체하려면 20분 동안 25 μL/min의 유속도로 1x PBS로 셀을 세척하십시오.
3. 0.1% 트리톤 X-100을 50 μL/분의 유속으로 칩에 넣고 6분 동안 투과하여 세포를 침투한다. 유량을 50 μL/h로 줄여 30분 동안 세포와 반응합니다. 0.1% 트리톤 X-100을 대체하려면 6분 동안 50 μL/min의 유속도로 셀을 1x PBS로 세척합니다.
4. 비특이적 항체 결합을 감소시키기 위해 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 PBS를 사용하여 세포를 차단한다. 1% BSA를 칩에 50 μL/min의 유속으로 6분 동안 펌핑합니다. 유량을 100 μL/h로 줄이고 1시간 동안 펌프합니다.
5. 6분 동안 50 μL/min의 유속으로 칩내내면역스테인링을 위한 항체를 펌핑하고, 칩을 4°C에서 18시간 동안 배양한다. 15 분 동안 50 μL /min의 유속도로 1 x PBS로 셀을 씻으셔.
6. 알렉사 플루오르-컨쥬게이드 이차 항체를 6분 동안 50 μL/min의 유속으로 칩에 펌핑한다. 유량을 50 μL/h로 줄이고 어두운 실온에서 항체를 1시간 동안 펌핑합니다. 15 분 동안 50 μL /min의 유속도로 1 x PBS로 셀을 씻으셔.
7. 핵 염색의 경우, 호흐트스트 33342를 20 μL/분의 유속으로 칩에 넣고 어둠 속에서 실온에서 10분 동안 펌핑합니다. 15 분 동안 50 μL /min의 유속도로 1 x PBS로 셀을 씻으셔.
8. 면역 염색 후, 공초점 형광 현미경을 사용하여 세포를 관찰한다.

7. 이미지 분석 및 데이터 처리

1. 내장 된 측정 도구가있는 소프트웨어를 사용하여 형광 이미지를 분석합니다 (재료 표참조).
2. 대조군 및 치료군에서 Hoechst-counterstained 핵(총 세포 수)을 비교하고 각 표현성 마커를 발현하는 세포의 백분율을 계산합니다.

결과

MOE 칩의 상세한 구성은 도 1에도시된다. 미세 유체 칩은 실험 설정 크기, 샘플 볼륨 및 시약 볼륨을 줄이는 데 유익한 접근 방식을 제공합니다. MOE 칩은 단일 연구에서 3개의 독립적인 EF 자극 실험 및 여러 면역 염색 조건을 동시에 수행하도록설계되었습니다(그림 3). 또한 광학 적 투명성이 높은 MOE 칩은 공초점 현미경 검사에 적...

토론

MOE 칩을 제작하는 동안 어댑터는 빠르게 작용하는 시아노아크라일트 접착제를 사용하여 MOE 칩의 레이어 1에 부착됩니다. 접착제는 어댑터의 4 모서리에 적용된 다음 어댑터 위에 압력이 균등하게 적용됩니다. 접착제의 완전한 중합을 보장하기 위해 과도한 양의 접착제를 피해야합니다. 또한 완성된 MOE 칩 어셈블리는 진공 챔버에서 배양됩니다. 이 단계는 PMMA 층, 양면 테이프 및 커버 글래스 사이?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mm PMMA substrates (Layers 1-3)	BHT	K2R20	Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL plastic tube	Protech Technology Enterprise Co., Ltd	CT-15-PL-TW	Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized
3 mL syringe	TERUMO	DVR-3413	3 mL oral syringes, without needle
3 mm optical grade PMMA (Layer 5)	CHI MEI Corporation	ACRYPOLY PMMA Sheet	Optical grade PMMA
3-way stopcock	NIPRO	NCN-3L	Sterile disposable 3-way stopcock
5 mL syringe	TERUMO	DVR-3410	5 mL oral syringes, without needle
Adaptor	Dong Zhong Co., Ltd.	Customized	PMMA adaptor
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	Agarose, low gelling temperature
Amplifier	A.A. Lab Systems Ltd	A-304	High voltage amplifier
AutoCAD software	Autodesk	Educational Version	Drafting
B-27 supplement	Gibco	12587-010	B-27 supplement (50x), minus vitamin A
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Peprotech	AF-100-18B	Also called recombinant human FGF-basic
Black rubber bung	TERUMO	DVR-3413	From 3 mL oral syringes, without needle
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B4287	Blocking reagent
Centrifuge	HSIANGTAI	CV2060	Centrifuge
CO2 laser scriber	Laser Tools and Technics Corp.	ILS-II	Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm
Cone connector	IDEX Health & Science	F-120X	One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural
Cone-Luer adaptor	IDEX Health & Science	P-659	Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK
Confocal fluorescence microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Digital camera	OLYMPUS	E-330	Automatic time-lapse image acquisition
Digital oscilloscope	Tektronix	TDS2024	Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency.
Double-sided tape	3M	PET 8018	Purchased from http://en.thd.com.tw/
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	12400024	DMEM/F-12, powder, HEPES
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21600010	DPBS, powder, no calcium, no magnesium
EF multiplexer	Asiatic Sky Co., Ltd.	Customized	Monitor and control the electric current in individual channels
Epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Also called recombinant human EGF
Fast-acting cyanoacrylate glue	3M	7004T	Strength instant adhesive (liquid)
Flat bottom connector	IDEX Health & Science	P-206	Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue
Function generator	Agilent Technologies	33120A	High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability
Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150117	Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed
Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555)	Abcam	ab150086	Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
ImageJ software	National Institutes of Health	1.48v	Analyze the fluorescent images
Indium–tin–oxide (ITO) glass	Merck	300739	For ITO heater
Inverted phase contrast microscope	OLYMPUS	CKX41	For cell morphology observation
K-type thermocouple	Tecpel	TPK-02A	Temperature thermocouples
Luer adapter	IDEX Health & Science	P618-01	Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene
Luer lock syringe	TERUMO	DVR-3413	For agar salt bridges
Mouse anti-GFAP	eBioscience	14-9892	Astrocytes marker
Oligodendrocyte  marker  O4  antibody	R&D Systems	MAB1326	Oligodendrocytes marker
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148	Fixing agent
Phosphate buffered saline (PBS)	Basic Life	BL2651	Washing solution
Poly-L-Lysine (PLL)	SIGMA	P4707	Coating solution
Precision cover glasses thickness No. 1.5H	MARIENFELD	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programmable X-Y-Z motorised stage	Tanlian Inc	Customized	Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportional–integral–derivative (PID) controller	Toho Electronics	TTM-J4-R-AB	Temperature controller
PTFE tube	Professional Plastics Inc. Taiwan Branch	Outer diameter 1/16 Inches	White translucent PTFE tubing
Rabbit anti-Tuj1	Abcam	ab18207	Neuron marker
Syringe pump	New Era Systems Inc	NE-1000	NE-1000 programmable single syringe pump
TFD4 detergent	FRANKLAB	TFD4	Cover glass cleaner
Thermal bonder	Kuan-MIN Tech Co.	Customized	Purchased from http://kmtco.com.tw/
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Permeabilized solution
Ultrasonic cleaner	LEO	LEO-300S	Ultrasonic steri-cleaner
Vacuum chamber	DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.	DOV-30	Vacuum drying oven
White fingertight plug	IDEX Health & Science	P-316	1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html