Elektrisch-Feld-induzierte neuronale Vorläuferzelldifferenzierung in mikrofluidischen Geräten

Zusammenfassung

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Differenzierung von neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen (NPCs) vor, das ausschließlich durch Gleichstrom-Pulsstimulation (DC) in einem mikrofluidischen System induziert wird.

Zusammenfassung

Physiologische elektrische Felder (EF) spielen eine wichtige Rolle bei der Zellmigration, Differenzierung, Teilung und tod. Dieses Papier beschreibt ein mikrofluidisches Zellkultursystem, das für eine Langzeit-Zelldifferenzierungsstudie mittels Mikroskopie verwendet wurde. Das mikrofluidische System besteht aus folgenden Hauptkomponenten: einem optisch transparenten elektrotaktischen Chip, einer transparenten Indium-Zinnoxid-Heizung (ITO), einer Kulturmedienfüllpumpe, einer elektrischen Stromversorgung, einem Hochfrequenz-Leistungsverstärker, einem EF-Multiplexer, einer programmierbaren X-Y-Z-Motorbühne und einem invertierten Phasenkontrastmikroskop mit Digitalkamera. Das mikrofluidische System ist vorteilhaft bei der Vereinfachung des gesamten Versuchsaufbaus und damit des Reagenz- und Probenverbrauchs. Diese Arbeit beinhaltet die Differenzierung von neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen (NPCs), die durch Gleichstrom-Pulsstimulation (DC) induziert werden. Im Stammzellerhaltungsmedium unterschieden sich die Maus-NPCs (mNPCs) nach der DC-Pulsstimulation in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine einfache DC-Pulsbehandlung das Schicksal von mNPCs steuern und zur Entwicklung therapeutischer Strategien für Erkrankungen des Nervensystems verwendet werden könnte. Das System kann für die Zellkultur in mehreren Kanälen, für die langfristige EF-Stimulation, für die zellmorphologische Beobachtung und für die automatische Zeitrafferbildaufnahme verwendet werden. Dieses mikrofluidische System verkürzt nicht nur die benötigte Versuchszeit, sondern erhöht auch die Genauigkeit der Kontrolle auf der Mikroumgebung.

Einleitung

Neurale Vorläuferzellen (NPCs, auch bekannt als neuronale Stamm- und Vorläuferzellen) können ein vielversprechender Kandidat für neurodegenerative therapeutische Strategie^{sein 1}. Die undifferenzierten NPCs haben Selbsterneuerungskapazität, Multipotenz und proliferative Fähigkeit^2,3. Eine frühere Studie hat berichtet, dass die extrazelluläre Matrix und molekulare Mediatoren die Differenzierung von NPC regulieren. Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und der grundlegende Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) fördern die NPC-Proliferation und behalten so den undifferenzierten Zustand

Protokoll

1. Design und Herstellung des MOE-Chips

1. Zeichnen Sie Muster für einzelne Polymethylmethacrylatschichten (PMMA) und das doppelseitige Band mit entsprechender Software (Abbildung 1A, Materialtabelle). Schneiden Sie sowohl die PMMA-Platten als auch das doppelseitige Band mit einem CO 2-Lasermaschinenschreiber (Abbildung 1B).
   1. Schalten Sie den CO 2-Laserschreiber ein und schließen Sie ihn an einen PC an. Öffnen Sie die entworfene Musterdatei mit der Software.
   2. Stellen Sie die PMMA-Platten (275 mm x 400 mm) oder das doppelseitige Klebeband (210 mm x....

Ergebnisse

Die detaillierte Konfiguration des MOE-Chips ist in Abbildung 1dargestellt. Der mikrofluidische Chip bietet einen vorteilhaften Ansatz zur Reduzierung der Versuchsaufbaugröße, des Probenvolumens und des Reagenzvolumens. Der MOE-Chip wurde entwickelt, um drei unabhängige EF-Stimulationsexperimente und mehrere Immunflecken gleichzeitig in einer einzigen Studie durchzuführen (Abbildung 3). Darüber hinaus eignet sich der MOE-Chi.......

Diskussion

Bei der Herstellung des MOE-Chips werden die Adapter mit schnell wirkendem Cyanoacrylatkleber am Layer 1 des MOE-Chips befestigt. Der Kleber wird auf 4 Ecken der Adapter aufgetragen, und dann wird der Druck gleichmäßig über die Adapter aufgebracht. Überschüssige Klebstoffmenge muss vermieden werden, um eine vollständige Polymerisation des Klebers zu gewährleisten. Darüber hinaus wird die fertige MOE-Chip-Montage in einer Vakuumkammer inkubiert. Dieser Schritt hilft, die Blasen zwischen der PMMA-Schicht, dem doppe.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mm PMMA substrates (Layers 1-3)	BHT	K2R20	Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL plastic tube	Protech Technology Enterprise Co., Ltd	CT-15-PL-TW	Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized
3 mL syringe	TERUMO	DVR-3413	3 mL oral syringes, without needle
3 mm optical grade PMMA (Layer 5)	CHI MEI Corporation	ACRYPOLY PMMA Sheet	Optical grade PMMA
3-way stopcock	NIPRO	NCN-3L	Sterile disposable 3-way stopcock
5 mL syringe	TERUMO	DVR-3410	5 mL oral syringes, without needle
Adaptor	Dong Zhong Co., Ltd.	Customized	PMMA adaptor
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	Agarose, low gelling temperature
Amplifier	A.A. Lab Systems Ltd	A-304	High voltage amplifier
AutoCAD software	Autodesk	Educational Version	Drafting
B-27 supplement	Gibco	12587-010	B-27 supplement (50x), minus vitamin A
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Peprotech	AF-100-18B	Also called recombinant human FGF-basic
Black rubber bung	TERUMO	DVR-3413	From 3 mL oral syringes, without needle
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B4287	Blocking reagent
Centrifuge	HSIANGTAI	CV2060	Centrifuge
CO2 laser scriber	Laser Tools and Technics Corp.	ILS-II	Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm
Cone connector	IDEX Health & Science	F-120X	One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural
Cone-Luer adaptor	IDEX Health & Science	P-659	Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK
Confocal fluorescence microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Digital camera	OLYMPUS	E-330	Automatic time-lapse image acquisition
Digital oscilloscope	Tektronix	TDS2024	Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency.
Double-sided tape	3M	PET 8018	Purchased from http://en.thd.com.tw/
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	12400024	DMEM/F-12, powder, HEPES
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21600010	DPBS, powder, no calcium, no magnesium
EF multiplexer	Asiatic Sky Co., Ltd.	Customized	Monitor and control the electric current in individual channels
Epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Also called recombinant human EGF
Fast-acting cyanoacrylate glue	3M	7004T	Strength instant adhesive (liquid)
Flat bottom connector	IDEX Health & Science	P-206	Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue
Function generator	Agilent Technologies	33120A	High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability
Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150117	Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed
Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555)	Abcam	ab150086	Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
ImageJ software	National Institutes of Health	1.48v	Analyze the fluorescent images
Indium–tin–oxide (ITO) glass	Merck	300739	For ITO heater
Inverted phase contrast microscope	OLYMPUS	CKX41	For cell morphology observation
K-type thermocouple	Tecpel	TPK-02A	Temperature thermocouples
Luer adapter	IDEX Health & Science	P618-01	Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene
Luer lock syringe	TERUMO	DVR-3413	For agar salt bridges
Mouse anti-GFAP	eBioscience	14-9892	Astrocytes marker
Oligodendrocyte  marker  O4  antibody	R&D Systems	MAB1326	Oligodendrocytes marker
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148	Fixing agent
Phosphate buffered saline (PBS)	Basic Life	BL2651	Washing solution
Poly-L-Lysine (PLL)	SIGMA	P4707	Coating solution
Precision cover glasses thickness No. 1.5H	MARIENFELD	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programmable X-Y-Z motorised stage	Tanlian Inc	Customized	Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportional–integral–derivative (PID) controller	Toho Electronics	TTM-J4-R-AB	Temperature controller
PTFE tube	Professional Plastics Inc. Taiwan Branch	Outer diameter 1/16 Inches	White translucent PTFE tubing
Rabbit anti-Tuj1	Abcam	ab18207	Neuron marker
Syringe pump	New Era Systems Inc	NE-1000	NE-1000 programmable single syringe pump
TFD4 detergent	FRANKLAB	TFD4	Cover glass cleaner
Thermal bonder	Kuan-MIN Tech Co.	Customized	Purchased from http://kmtco.com.tw/
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Permeabilized solution
Ultrasonic cleaner	LEO	LEO-300S	Ultrasonic steri-cleaner
Vacuum chamber	DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.	DOV-30	Vacuum drying oven
White fingertight plug	IDEX Health & Science	P-316	1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html