Elektrisch-Feld-induzierte neuronale Vorläuferzelldifferenzierung in mikrofluidischen Geräten

Zusammenfassung

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Differenzierung von neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen (NPCs) vor, das ausschließlich durch Gleichstrom-Pulsstimulation (DC) in einem mikrofluidischen System induziert wird.

Zusammenfassung

Physiologische elektrische Felder (EF) spielen eine wichtige Rolle bei der Zellmigration, Differenzierung, Teilung und tod. Dieses Papier beschreibt ein mikrofluidisches Zellkultursystem, das für eine Langzeit-Zelldifferenzierungsstudie mittels Mikroskopie verwendet wurde. Das mikrofluidische System besteht aus folgenden Hauptkomponenten: einem optisch transparenten elektrotaktischen Chip, einer transparenten Indium-Zinnoxid-Heizung (ITO), einer Kulturmedienfüllpumpe, einer elektrischen Stromversorgung, einem Hochfrequenz-Leistungsverstärker, einem EF-Multiplexer, einer programmierbaren X-Y-Z-Motorbühne und einem invertierten Phasenkontrastmikroskop mit Digitalkamera. Das mikrofluidische System ist vorteilhaft bei der Vereinfachung des gesamten Versuchsaufbaus und damit des Reagenz- und Probenverbrauchs. Diese Arbeit beinhaltet die Differenzierung von neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen (NPCs), die durch Gleichstrom-Pulsstimulation (DC) induziert werden. Im Stammzellerhaltungsmedium unterschieden sich die Maus-NPCs (mNPCs) nach der DC-Pulsstimulation in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine einfache DC-Pulsbehandlung das Schicksal von mNPCs steuern und zur Entwicklung therapeutischer Strategien für Erkrankungen des Nervensystems verwendet werden könnte. Das System kann für die Zellkultur in mehreren Kanälen, für die langfristige EF-Stimulation, für die zellmorphologische Beobachtung und für die automatische Zeitrafferbildaufnahme verwendet werden. Dieses mikrofluidische System verkürzt nicht nur die benötigte Versuchszeit, sondern erhöht auch die Genauigkeit der Kontrolle auf der Mikroumgebung.

Einleitung

Neurale Vorläuferzellen (NPCs, auch bekannt als neuronale Stamm- und Vorläuferzellen) können ein vielversprechender Kandidat für neurodegenerative therapeutische Strategie^{sein 1}. Die undifferenzierten NPCs haben Selbsterneuerungskapazität, Multipotenz und proliferative Fähigkeit^2,3. Eine frühere Studie hat berichtet, dass die extrazelluläre Matrix und molekulare Mediatoren die Differenzierung von NPC regulieren. Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und der grundlegende Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) fördern die NPC-Proliferation und behalten so den undifferenzierten Zustand^{bei 4}.

Frühere Studien haben berichtet, dass elektrische Stimulation zellphysiologische Aktivitäten wie Abteilung^5,Migration^6,7,8, Differenzierung^1,9,10und Zelltod¹¹regulieren kann. Elektrische Felder (EFs) spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Regeneration der Entwicklung des zentralen Nervensystems^12,13,14. Von 2009 bis 2019 hat dieses Labor zelluläre Reaktionen auf die Anwendung von EF im mikrofluidischen System^{1,6,7,8,15,16,17}untersucht. Ein mehrkanalig, optisch transparenter, elektrotaktischer (MOE) Chip wurde entwickelt, um für die Immunfluoreszenzfärbung für die konfokale Mikroskopie geeignet zu sein. Der Chip hatte eine hohe optische Transparenz und eine gute Haltbarkeit und ermöglichte die gleichzeitige Durchführung von drei unabhängigen Stimulationsexperimenten und mehreren immunbefleckten Bedingungen in einer einzigen Studie. Das mikrofluidische System ist vorteilhaft bei der Vereinfachung des gesamten Versuchsaufbaus und damit des Reagenz- und Probenverbrauchs. Dieser Beitrag beschreibt die Entwicklung eines mikrofluidischen Zellkultursystems, das für eine Langzeit-Zelldifferenzierungsstudie verwendet wurde.

Protokoll

1. Design und Herstellung des MOE-Chips

1. Zeichnen Sie Muster für einzelne Polymethylmethacrylatschichten (PMMA) und das doppelseitige Band mit entsprechender Software (Abbildung 1A, Materialtabelle). Schneiden Sie sowohl die PMMA-Platten als auch das doppelseitige Band mit einem CO 2-Lasermaschinenschreiber (Abbildung 1B).
   1. Schalten Sie den CO 2-Laserschreiber ein und schließen Sie ihn an einen PC an. Öffnen Sie die entworfene Musterdatei mit der Software.
   2. Stellen Sie die PMMA-Platten (275 mm x 400 mm) oder das doppelseitige Klebeband (210 mm x 297 mm) auf die Plattform des Laserschreibers(Abbildung 2A). Richten Sie den Laser mit dem Autofokus-Werkzeug auf die Oberfläche der PMMA-Platten oder das doppelseitige Band.
   3. Wählen Sie den Laserschreiber als Drucker aus, und "drucken" Sie dann das Muster mit dem Laserschreiber, um die direkte Ablation auf dem PMMA-Blatt oder doppelseitigen Band zu starten und individuelle Muster auf dem PMMA-Blatt oder -Band zu erhalten (Abbildung 2B).
2. Entfernen Sie den Schutzfilm von den PMMA-Platten und reinigen Sie die Oberfläche mit Stickstoffgas.
   ANMERKUNG: Die Zeichnung des PMMA-Musters und die direkte Bearbeitung des PMMA-Blatts wurden gemäß einem früheren Bericht¹⁷durchgeführt.
3. Zum Verkleben mehrerer Schichten von PMMA-Platten drei Stück von 1 mm PMMA-Platten (Schichten 1, 2 und 3) stapeln und unter einem Druck von 5 kg/cm² in einem thermischen Bonder für 30 min bei 110 °C verkleben, um die Strömungs-/elektrische Stimulationskanalbaugruppe zu bilden (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Verschiedene Chargen von kommerziell erhaltenen PMMA-Platten haben eine leicht unterschiedliche Glasübergangstemperatur (Tg). Die optimale Klebetemperatur muss in 5 °C-Schritten in der Nähe des Tg getestet werden.
4. 12 Stück Adapter an den einzelnen Öffnungen in Schicht 1 der MOE-Chip-Baugruppe mit schnell wirkendem Cyanoacrylatkleber kleben.
   HINWEIS: Die Adapter werden aus PMMA durch Spritzgießen hergestellt. Die flachen Flächen an der Unterseite sind für den Anschluss an den MOE-Chip. Die Adapter mit 1/4W-28 Innengewinde sind für den Anschluss von weißen fingerdichten Steckern, flachen Bodenverbindern oder Luer-Adaptern. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie schnell wirkenden Cyanoacrylatkleber verwenden. Vermeiden Sie es, in die Augen zu spritzen.
5. Desinfizieren Sie die 1 mm PMMA-Substrate (Schichten 1-3), das doppelseitige Band (Schicht 4) und das 3 mm optische PMMA (Schicht 5) mit ultravioletter (UV) Bestrahlung für 30 min vor der Montage des Chips (Abbildung 1A).
6. Verkleben Sie die 1 mm PMMA-Substrate (Schichten 1-3) auf dem 3 mm optischen PMMA (Schicht 5) mit dem doppelseitigen Band (Schicht 4), um die PMMA-Baugruppe (Schichten 1-5) abzuschließen (Abbildung 1A).
7. Bereiten Sie das saubere Deckglas für die Montage auf dem Chip vor.
   1. Füllen Sie eine zehnfache Verdünnung des Reinigungsmittels in ein Färbeglas (siehe Materialtabelle), und reinigen Sie das Deckglas in diesem Reinigungsmittel mit einem Ultraschallreiniger für 15 min.
   2. Spülen Sie das Färbeglas unter fließendem Leitungswasser gründlich ab, um alle Spuren des Reinigungsmittels zu entfernen.
   3. Spülen Sie mit destilliertem Wasser weiter, um alle Spuren von Leitungswasser zu entfernen, und wiederholen Sie Schritt 1.7.2 zweimal.
   4. Trocknen Sie das gereinigte Deckglas, indem Sie es mit Stickstoffgas blasen.
8. Desinfizieren Sie die PMMA-Baugruppe (Schichten 1-5), das doppelseitige Band (Schicht 6) und das Deckglas (Schicht 7) mit UV-Bestrahlung in einem Biosicherheitsschrank für 30 min vor der Montage des Chips (Abbildung 1A).
9. Das gereinigte Deckglas (Schicht 7) mit dem doppelseitigen Klebeband (Schicht 6)(Abbildung 1A)an der PMMA-Baugruppe (Schichten 1-5) aufkleben
10. Inkubieren Sie den MOE-Chip über Nacht in einer Vakuumkammer; verwenden Sie die MOE-Chip-Baugruppe für nachfolgende Verfahren (Abbildung 3).

2. Beschichtung von Poly-L-Lysin (PLL) auf dem Substrat in den Zellkulturbereichen

1. Vorbereiten des Polytetrafluorethylen-Rohrs, des Flachbodensteckers, des Kegelverbinders, des Kegel-Luer-Adapters, des weißen Finger-Tight-Plugs (auch Stopper genannt), des Luer-Adapters, der Luer-Sperrspritze und der schwarzen Gummi-Bung (Abbildung 4A, Materialtabelle). Sterilisieren Sie alle oben genannten Komponenten in einem Autoklaven bei 121 °C für 30 min.
2. Versiegeln Sie die Öffnungen der Agarbrückenadapter (Abbildung 1A) mit den weißen fingerdichten Steckern. Schließen Sie den Flachbodenstecker über die mittleren Ein- und Auslassadapter an die MOE-Chipbaugruppe an (Abbildung 4B). Schließen Sie den Kegel-Luer-Adapter an die 3-Wege-Stoppcocks an.
3. Fügen Sie 2 ml 0,01% PLL-Lösung mit einer 3 ml Spritze hinzu, die mit dem 3-Wege-Stopphahn des mittleren Einlasses verbunden ist (Abbildung 4B- ).
4. Schließen Sie eine leere 3 ml Spritze an den 3-Wege-Stopphahn des mittleren Auslasses an (Abbildung 4B- ).
5. Füllen Sie die Zellkulturbereiche mit der PLL-Lösung. Die Beschichtungslösung langsam hin und her pumpen. Schließen Sie die beiden 3-Wege-Stoppcocks, um die Lösung innerhalb der Kulturregionen zu versiegeln.
6. Inkubieren Sie den MOE-Chip bei 37 °C über Nacht in einem Inkubator, der mit 5%_{CO2-Atmosphäre} gefüllt ist.

3. Vorbereitung des Salzbrückennetzes

1. Öffnen Sie nach Schritt 2.6 die beiden 3-Wege-Stoppcocks und spülen Sie die Blasen in den Kanälen weg, indem Sie die Beschichtungslösung mit den beiden Spritzen manuell hin und her in den Kanal pumpen.
2. Zeichnen Sie 3 ml komplettes Medium (Stammzellerhaltungsmedium bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium/Schinken-Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F12), 2% B-27-Ergänzung, 20 ng/mL EGF und 20 ng/mL bFGF) in eine 3 ml Spritze, die sich mit dem 3-Wege-Stopphahn des Mittleren Einlasses verbindet(Abbildung 4B- und Abbildung 4B- ).
3. Fügen Sie 3 ml komplettes Medium hinzu, um die Beschichtungslösung in den Zellkulturbereichen zu ersetzen. Schließen Sie eine leere 5 ml Spritze an den 3-Wege-Stopphahn des mittleren Auslasses an (Abbildung 4B- ).
4. Vorbereiten des Salzbrückennetzes (Abbildung 5).
   1. Schneiden Sie die schwarze Gummi-Bung, um einen Spalt zu produzieren, und legen Sie die Silber (Ag)/Silberchlorid (AgCl) Elektroden durch die schwarze Gummi-Bung und in die Luer-Sperrspritze(Abbildung 4A).
   2. Ersetzen Sie den weißen fingerdichten Stecker durch den Luer-Adapter, und injizieren Sie 3% heiße Agarose, um den Luer-Adapter zu füllen.
      HINWEIS: Zur Herstellung der heißen Agarose 3 g Agarosepulver in 100 ml phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) auflösen und in einem Autoklaven bei 121 °C für 30 min sterilisieren.
   3. Schließen Sie die Luer-Verriegelungsspritze an den Luer-Adapter an. Injizieren Sie 3% heiße Agarose durch den schwarzen Gummi-Bung, um die Luer-Sperrspritze mit der Spritze mit Nadel zu füllen. 10 bis 20 Min. für die Agarose abkühlen und erstarren lassen.
      HINWEIS: Um die Volumenkapazität der Agarose zu erhöhen, ist die Luer-Schlossspritze am Luer-Adapter montiert(Abbildung 4 und Abbildung 5). Anschließend werden die großen Elektroden in die Luer-Sperrspritze eingeführt. Die Elektrode ist in der Lage, eine stabile elektrische Stimulation für das Langzeitexperiment zu bieten.

4. Vorbereitung von mNPCs

1. Kultur die mNPCs¹ im gesamten Medium in einem 25T Zellkulturkolben bei 37 °C in einem Inkubator mit 5%_{CO2-Atmosphäre} gefüllt. Subkultur die Zellen alle 3-4 Tage, und führen Sie alle Experimente mit Zellen, die 3-8 Passagen aus der ursprünglichen Quelle durchlaufen haben.
2. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr und spinnen Sie die Neurosphären bei 100 × g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Neurosphären mit 1x Dulbecco s PBS (DPBS). Spin-down der Neurosphären bei 100 × g für 5 min.
3. Aspirieren Sie die 1x DPBS und setzen Sie dann die Neurosphären im gesamten Medium wieder aus. Gründlich und sanft mischen.
4. Fügen Sie 1 ml der Neurosphäresuspension mit einer 1 ml Spritze hinzu, die mit dem 3-Wege-Hahn des Auslasses verbunden ist (Abbildung 4B- ).

5. Einrichtung des mikrofluidischen Systems zur DC-Pulsstimulation (Abbildung 6)

1. Installieren Sie den zellsäenden MOE-Chip auf der transparenten ITO-Heizung, die auf einer programmierbaren X-Y-Z motorisierten Bühne befestigt ist.
   HINWEIS: Die ITO-Oberflächentemperatur wird von einem proportional-integral-derivative-controller gesteuert und bei 37 °C gehalten. Ein K-Thermoelement wird zwischen dem Chip und der ITO-Heizung eingeklemmt, um die Temperatur der Zellkulturbereiche innerhalb des Chips zu überwachen. Der MOE-Chip ist auf einer programmierbaren X-Y-Z motorisierten Bühne installiert und eignet sich für die automatische Zeitraffer-Bildaufnahme an einzelnen Kanalabschnitten. Die Herstellung der ITO-Heizung und der Aufbau der Zellkulturheizung wurden zuvor beschrieben^18,19.
2. Infundieren Sie die mNPCs durch manuelles Pumpen in den MOE-Chip über den mittleren Auslass. Inkubieren Sie den zellsamen MOE-Chip auf dem 37 °C ITO-Heizer für 4 h.
3. Nach 4 h das komplette Medium mit einer Spritzenpumpe über den mittleren Einlass mit einer Durchflussrate von 20 l/h durch den MOE-Chip pumpen.
   HINWEIS: Die mNPCs werden im Chip für weitere 24 h vor der EF-Stimulation angebaut und gewartet, um Zellanhaftung und Wachstum zu ermöglichen. Die Abfallflüssigkeit wird in einer leeren 5 ml Spritze gesammelt, die mit dem 3-Wege-Hahn des Auslasses verbunden ist, der in Abbildung 6Aals "Abfall" dargestellt ist. Die MOE mikrofluidische Systemkonfiguration ist in Abbildung 6dargestellt. Dieses mikrofluidische System versorgt die Zellen kontinuierlich mit Nahrung. Das komplette frische Medium wird kontinuierlich in den MOE-Chip gepumpt, um einen konstanten pH-Wert zu halten. Daher können die Zellen außerhalb eines CO2-Inkubators kultiviert werden.
4. Verwenden Sie elektrische Drähte, um einen EF-Multiplexer über die Ag/AgCl-Elektroden auf dem Chip mit dem MOE-Chip zu verbinden. Schließen Sie einen EF-Multiplexer und einen Funktionsgenerator an einen Verstärker an, um rechteckige DC-Impulse mit einer Magnitude von 300 mV/mm bei einer Frequenz von 100 Hz bei 50 % Betriebszyklen (50 % Time-on und 50% Time-off) auszugeben (Abbildung 6B).
   1. Schließen Sie die elektrischen Drähte an den EF-Multiplexer an. Schließen Sie die elektrischen Drähte über die Ag/AgCl-Elektroden an den MOE-Chip an.
   2. Schließen Sie den EF-Multiplexer über elektrische Drähte an den Verstärker an. Schließen Sie den Funktionsgenerator an den Verstärker und das digitale Oszilloskop an.
      HINWEIS: Der EF-Multiplexer ist eine Schaltung, die die Impedanz der Kulturkammer in der Schaltung enthält und alle einzelnen Kammern in einem parallelen elektronischen Netzwerk verbindet. Jede der drei Kulturkammern ist seriell mit einem variablen Widerstand (Vr) und einem Amperemeter (in Abbildung 6Adargestellt) im Multiplexer elektrisch verbunden. Der elektrische Strom durch jede Kulturkammer wird durch Die Steuerung des Vr variiert, und der Strom wird auf dem entsprechenden Amperemeter angezeigt. Die elektrische Feldstärke in jeder Zellkulturregion wurde durch Das Ohm-Gesetz I= EA berechnet, wobei ich der elektrische Strom bin, σ (eingestellt auf 1,38 Sm^-1 für DMEM/F12²⁰⁾die elektrische Leitfähigkeit des Kulturmediums ist, E das elektrische Feld und A der Querschnittsbereich der elektrotaktischen Kammer. Für die in Abbildung 1dargestellte Dimension des Zellkulturbereichs beträgt der elektrische Strom 87 mA bzw. 44 mA für DC- und DC-Puls bei 50 % Betriebszyklus.
5. Unterziehen Sie die mNPCs quadratischen DC-Impulsen mit einer Magnitude von 300 mV/mm bei einer Frequenz von 100 Hz für 48h. Das gesamte Medium kontinuierlich mit einer Rate von 10 l/h pumpen, um die Zellen ausreichend mit Nahrung zu versorgen und einen konstanten pH-Wert im Medium aufrechtzuerhalten.

6. Immunfluoreszenz-Assays von mNPCs nach gepulsten DC-Stimulation

HINWEIS: In diesem Schritt wird das gesamte Reagenz über den mittleren Einlass mit einer Spritzenpumpe gepumpt.

1. Nach 3, 7 oder 14 Tagen in vitro (DIV) Kultivierung nach der Aussaat^1,waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 25 l/min für 20 min.
2. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA). Pumpen Sie 4% PFA in den Chip mit einer Durchflussrate von 25 l/min für 20 min, um die 1x PBS zu ersetzen. Um die 4% PFA zu ersetzen, waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 25 l/min für 20 min.
3. Pumpe 0,1% Triton X-100 in den Chip mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min, um die Zellen zu permeabilisieren. Reduzieren Sie den Durchfluss auf 50 l/h, damit weitere 30 min mit den Zellen reagieren. Um den 0,1% Triton X-100 zu ersetzen, waschen Sie die Zellen mit 1x PBS bei einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min.
4. Blockieren Sie die Zellen mit PBS, die 1% Rinderserumalbumin (BSA) enthalten, um die unspezifische Antikörperbindung zu reduzieren. Pumpe 1% BSA in den Chip mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min. Reduzieren Sie den Durchfluss auf 100 l/h und pumpen Sie 1 h.
5. Die Antikörper zur doppelten Immunfärbung mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min in den Chip pumpen und den Chip für 18 h bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 15 min.
6. Pumpen Sie die Alexa Fluor-konjugierten Sekundärantikörper mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min in den Chip. Reduzieren Sie den Durchfluss auf 50 l/h, und pumpen Sie die Antikörper bei Raumtemperatur im Dunkeln 1 h. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 15 min.
7. Für die Kernfärbung, pumpe Hoechst 33342 in den Chip mit einer Durchflussrate von 20 l/min für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 15 min.
8. Beobachten Sie die Zellen nach der Immunfärbung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop.

7. Bildanalyse und Datenverarbeitung

1. Analysieren Sie die fluoreszierenden Bilder mit Software mit integrierten Messwerkzeugen (siehe Tabelle der Materialien).
2. Vergleichen Sie die Hoechst-counterstainierten Kerne (Gesamtanzahl der Zellen) in den Kontroll- und Behandlungsgruppen, und berechnen Sie den Prozentsatz der Zellen, die jeden phänotypchenden Marker exemittieren.

Ergebnisse

Die detaillierte Konfiguration des MOE-Chips ist in Abbildung 1dargestellt. Der mikrofluidische Chip bietet einen vorteilhaften Ansatz zur Reduzierung der Versuchsaufbaugröße, des Probenvolumens und des Reagenzvolumens. Der MOE-Chip wurde entwickelt, um drei unabhängige EF-Stimulationsexperimente und mehrere Immunflecken gleichzeitig in einer einzigen Studie durchzuführen (Abbildung 3). Darüber hinaus eignet sich der MOE-Chi...

Diskussion

Bei der Herstellung des MOE-Chips werden die Adapter mit schnell wirkendem Cyanoacrylatkleber am Layer 1 des MOE-Chips befestigt. Der Kleber wird auf 4 Ecken der Adapter aufgetragen, und dann wird der Druck gleichmäßig über die Adapter aufgebracht. Überschüssige Klebstoffmenge muss vermieden werden, um eine vollständige Polymerisation des Klebers zu gewährleisten. Darüber hinaus wird die fertige MOE-Chip-Montage in einer Vakuumkammer inkubiert. Dieser Schritt hilft, die Blasen zwischen der PMMA-Schicht, dem doppe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mm PMMA substrates (Layers 1-3)	BHT	K2R20	Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL plastic tube	Protech Technology Enterprise Co., Ltd	CT-15-PL-TW	Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized
3 mL syringe	TERUMO	DVR-3413	3 mL oral syringes, without needle
3 mm optical grade PMMA (Layer 5)	CHI MEI Corporation	ACRYPOLY PMMA Sheet	Optical grade PMMA
3-way stopcock	NIPRO	NCN-3L	Sterile disposable 3-way stopcock
5 mL syringe	TERUMO	DVR-3410	5 mL oral syringes, without needle
Adaptor	Dong Zhong Co., Ltd.	Customized	PMMA adaptor
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	Agarose, low gelling temperature
Amplifier	A.A. Lab Systems Ltd	A-304	High voltage amplifier
AutoCAD software	Autodesk	Educational Version	Drafting
B-27 supplement	Gibco	12587-010	B-27 supplement (50x), minus vitamin A
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Peprotech	AF-100-18B	Also called recombinant human FGF-basic
Black rubber bung	TERUMO	DVR-3413	From 3 mL oral syringes, without needle
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B4287	Blocking reagent
Centrifuge	HSIANGTAI	CV2060	Centrifuge
CO2 laser scriber	Laser Tools and Technics Corp.	ILS-II	Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm
Cone connector	IDEX Health & Science	F-120X	One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural
Cone-Luer adaptor	IDEX Health & Science	P-659	Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK
Confocal fluorescence microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Digital camera	OLYMPUS	E-330	Automatic time-lapse image acquisition
Digital oscilloscope	Tektronix	TDS2024	Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency.
Double-sided tape	3M	PET 8018	Purchased from http://en.thd.com.tw/
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	12400024	DMEM/F-12, powder, HEPES
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21600010	DPBS, powder, no calcium, no magnesium
EF multiplexer	Asiatic Sky Co., Ltd.	Customized	Monitor and control the electric current in individual channels
Epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Also called recombinant human EGF
Fast-acting cyanoacrylate glue	3M	7004T	Strength instant adhesive (liquid)
Flat bottom connector	IDEX Health & Science	P-206	Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue
Function generator	Agilent Technologies	33120A	High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability
Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150117	Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed
Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555)	Abcam	ab150086	Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
ImageJ software	National Institutes of Health	1.48v	Analyze the fluorescent images
Indium–tin–oxide (ITO) glass	Merck	300739	For ITO heater
Inverted phase contrast microscope	OLYMPUS	CKX41	For cell morphology observation
K-type thermocouple	Tecpel	TPK-02A	Temperature thermocouples
Luer adapter	IDEX Health & Science	P618-01	Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene
Luer lock syringe	TERUMO	DVR-3413	For agar salt bridges
Mouse anti-GFAP	eBioscience	14-9892	Astrocytes marker
Oligodendrocyte  marker  O4  antibody	R&D Systems	MAB1326	Oligodendrocytes marker
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148	Fixing agent
Phosphate buffered saline (PBS)	Basic Life	BL2651	Washing solution
Poly-L-Lysine (PLL)	SIGMA	P4707	Coating solution
Precision cover glasses thickness No. 1.5H	MARIENFELD	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programmable X-Y-Z motorised stage	Tanlian Inc	Customized	Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportional–integral–derivative (PID) controller	Toho Electronics	TTM-J4-R-AB	Temperature controller
PTFE tube	Professional Plastics Inc. Taiwan Branch	Outer diameter 1/16 Inches	White translucent PTFE tubing
Rabbit anti-Tuj1	Abcam	ab18207	Neuron marker
Syringe pump	New Era Systems Inc	NE-1000	NE-1000 programmable single syringe pump
TFD4 detergent	FRANKLAB	TFD4	Cover glass cleaner
Thermal bonder	Kuan-MIN Tech Co.	Customized	Purchased from http://kmtco.com.tw/
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Permeabilized solution
Ultrasonic cleaner	LEO	LEO-300S	Ultrasonic steri-cleaner
Vacuum chamber	DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.	DOV-30	Vacuum drying oven
White fingertight plug	IDEX Health & Science	P-316	1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html