Differenziazione delle cellule precursori neurali indotte dal campo elettrico nei dispositivi microfluidici

Riepilogo

In questo studio, presentiamo un protocollo per la differenziazione delle cellule staminali neurali e progenitrici (NPC) indotte esclusivamente dalla stimolazione dell'impulso a corrente continua (DC) in un sistema microfluidico.

Abstract

I campi elettrici fisiologici (EF) svolgono un ruolo vitale nella migrazione cellulare, nella differenziazione, nella divisione e nella morte. Questo articolo descrive un sistema di coltura cellulare microfluidico che è stato utilizzato per uno studio di differenziazione cellulare a lungo termine usando la microscopia. Il sistema microfluidico è costituito dai seguenti componenti principali: un chip elettrotattico otticamente trasparente, un riscaldatore ITO (Indium-Tin-Oxide) trasparente, una pompa di riempimento dei supporti di coltura, un alimentatore elettrico, un amplificatore di potenza ad alta frequenza, un multiplexer EF, uno stadio motorizzato X-Y-Z programmabile e un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di una fotocamera digitale. Il sistema microfluidico è utile per semplificare l'impostazione sperimentale complessiva e, a sua volta, il reagente e il consumo del campione. Questo lavoro comporta la differenziazione delle cellule staminali neurali e progenitrici (NPC) indotte dalla stimolazione dell'impulso a corrente continua (DC). Nel mezzo di manutenzione delle cellule staminali, i PNG del topo (mNPC) si differenziarono in neuroni, astrociti e oligodendrociti dopo la stimolazione dell'impulso DC. I risultati suggeriscono che un semplice trattamento a impulsi CC potrebbe controllare il destino degli mNPC e potrebbe essere utilizzato per sviluppare strategie terapeutiche per i disturbi del sistema nervoso. Il sistema può essere utilizzato per la coltura cellulare in più canali, per la stimolazione EF a lungo termine, per l'osservazione morfologica cellulare e per l'acquisizione automatica di immagini time-lapse. Questo sistema microfluidico non solo riduce i tempi sperimentali richiesti, ma aumenta anche l'accuratezza del controllo sul microambiente.

Introduzione

Le cellule precursori neurali (NPC, note anche come cellule staminali neurali e progenitrici) possono essere un candidato promettente per la strategia terapeutica neurodegenerativa¹. I PNG indifferenziati hanno capacità di auto-rinnovo, multipotenza e capacità proliferativa^2,3. Uno studio precedente ha riferito che la matrice extracellulare e i mediatori molecolari regolano la differenziazione dell'NPC. Il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) promuovono la proliferazione dei NPC, mantenendo così lo stato indifferenziato⁴.

Studi precedenti hanno riferito che la stimolazione elettrica può regolare le attività fisiologiche cellulari come la^{divisione 5,}la^{migrazione 6,7,8,}la^{differenziazione 1,9,10}e la morte cellulare¹¹. I campi elettrici (EFs) svolgono un ruolo vitale nello sviluppo e nella rigenerazione dello sviluppo del sistema^{nervoso centrale 12,13,14}. Dal 2009 al 2019, questo laboratorio ha studiato le risposte cellulari all'applicazione di EF nel sistema microfluidico^{1,6,7,8,15,16,17}. Un chip elettrotattico multicanale, otticamente trasparente (MOE) è stato progettato per essere adatto per la colorazione dell'immunofluorescenza per la microscopia confocale. Il chip aveva un'elevata trasparenza ottica e una buona durata e permetteva lo svolgimento simultaneo di tre esperimenti di stimolazione indipendenti e diverse condizioni immunostained in un unico studio. Il sistema microfluidico è utile per semplificare l'impostazione sperimentale complessiva e, a sua volta, il reagente e il consumo del campione. Questo documento descrive lo sviluppo di un sistema di coltura cellulare microfluidico che è stato utilizzato per uno studio di differenziazione cellulare a lungo termine.

Protocollo

1. Progettazione e fabbricazione del chip MOE

1. Disegnare modelli per singoli strati di metacrilato di polimetile (PMMA) e il nastro a doppia parte utilizzando un software appropriato (Figura 1A, Tabella dei materiali). Tagliare sia i fogli PMMA che il nastro a doppia mano con uno scriber per macchine laser CO₂ (Figura 1B).
   1. Accendere lo scriber laser CO₂ e collegarlo a un personal computer. Aprire il file del modello progettato utilizzando il software.
   2. Posizionare i fogli PMMA (275 mm x 400 mm) o il nastro a doppia mano (210 mm x 297 mm) sulla piattaforma dello scriber laser(Figura 2A). Mettere a fuoco il laser sulla superficie dei fogli PMMA o sul nastro a doppia mano utilizzando lo strumento di messa a fuoco automatica.
   3. Selezionare lo scriber laser come stampante, quindi "stampare" il modello utilizzando lo scriber laser per avviare l'ablazione diretta sul foglio PMMA o sul nastro a doppia mano e ottenere singoli motivi sul foglio o sul nastro PMMA (Figura 2B).
2. Rimuovere il film protettivo dai fogli PMMA e pulire la superficie utilizzando gas azoto.
   NOTA: Il disegno del modello PMMA e la lavorazione diretta del foglio PMMA sono stati eseguiti secondo un precedente rapporto¹⁷.
3. Per legare insieme più strati di fogli PMMA, impilare tre pezzi di fogli PMMA da 1 mm (strati 1, 2 e 3) e incollarli sotto una pressione di 5 kg /cm² in un bonder termico per 30 minuti a 110 °C per formare l'assemblaggio del canale di flusso /stimolazione elettrica(Figura 2C).
   NOTA: Diversi lotti di lamiere PMMA ottenute commercialmente hanno una temperatura di transizione del vetro leggermente diversa (Tg). La temperatura di incollaggio ottimale deve essere testata a incrementi di 5 °C vicino al Tg.
4. Aderire a 12 pezzi di adattatori alle singole aperture nello strato 1 dell'assemblaggio del chip MOE con colla cianoacrilato ad azione rapida.
   NOTA: Gli adattatori sono realizzati in PMMA mediante stampaggio a iniezione. Le superfici piane nella parte inferiore sono per il collegamento al chip MOE. Gli adattatori con filetto a vite femmina da 1/4W-28 sono per il collegamento di spine bianche a tenuta di dita, connettori inferiori piatti o adattatori Luer. Fai attenzione quando usi colla cianoacrilato ad azione rapida. Evitare di spruzzi negli occhi.
5. Disinfettare i substrati PMMA da 1 mm (strati 1-3), il nastro a doppia fronte (Strato 4) e il PMMA di grado ottico da 3 mm (strato 5) utilizzando l'irradiazione ultravioletta (UV) per 30 minuti prima di assemblare il chip(Figura 1A).
6. Aderire ai substrati PMMA da 1 mm (strati 1-3) sul PMMA di grado ottico da 3 mm (Strato 5) con il nastro a doppia aspetto (Strato 4) per completare l'assieme PMMA (Layers 1-5)(Figura 1A).
7. Preparare il vetro di copertura pulito per l'assemblaggio sul chip.
   1. Riempire una diluizione dieci volte del detergente in un barattolo di colorazione (vedere il tavolo dei materiali) e pulire il vetro di copertura in questo detergente utilizzando un pulitore ad ultrasuoni per 15 minuti.
   2. Risciacquare accuratamente il barattolo di colorazione sotto l'acqua corrente del rubinetto per rimuovere tutte le tracce del detergente.
   3. Continuare il risciacquo con acqua distillata per rimuovere tutte le tracce di acqua del rubinetto e ripetere il passaggio 1.7.2 due volte.
   4. Asciugare il vetro di copertura pulito soffiandolo con gas azoto.
8. Disinfettare l'assieme PMMA (Strati 1-5), il nastro a doppia parte (Strato 6) e il vetro di copertura (Strato 7) utilizzando l'irradiazione UV all'interno di un armadio di biosicurezza per 30 minuti prima di assemblare il truciolo(Figura 1A).
9. Aderire al vetro di copertura pulito (Strato 7) all'assieme PMMA (Livelli 1-5) con il nastro a doppia fronte (Livello 6)(Figura 1A).
10. Incubare il chip MOE in una camera a vuoto durante la notte; utilizzare l'assieme chip MOE per le procedure successive (Figura 3).

2. Rivestimento della poli-L-lisina (PLL) sul substrato nelle regioni di coltura cellulare

1. Preparare il tubo in politetrafluoroetilene, il connettore a fondo piatto, il connettore cono, l'adattatore cono-Luer, la spina bianca a tenuta di dita (chiamata anche tappo), l'adattatore Luer, la siringa di blocco Luer e il bung in gomma nera(Figura 4A,Tabella dei materiali). Sterilizzare tutti i componenti di cui sopra in autoclave a 121 °C per 30 min.
2. Sigillare le aperture degli adattatori a ponte di agar(Figura 1A)con le spine bianche a tenuta di dita. Collegare il connettore flat-bottom all'assieme del chip MOE tramite gli adattatori di ingresso e di uscita medi (Figura 4B). Collegare l'adattatore cono-Luer ai fermavi a 3.
3. Aggiungere 2 ml di soluzione PLL allo 0,01% utilizzando una siringa da 3 ml che si collega al fermallo a 3 via dell'ingresso medio (Figura 4B- ).
4. Collegare una siringa vuota da 3 ml al fermago a 3 strade della presa media (Figura 4B- ).
5. Riempire le aree di coltura cellulare con la soluzione PLL. Pompare manualmente la soluzione di rivestimento avanti e indietro lentamente. Chiudi i due fermacock a 3 via per sigillare la soluzione all'interno delle regioni culturali.
6. Incubare il chip MOE a 37 °C durante la notte in un incubatore pieno di atmosfera di CO_{2 al 5%.}

3. Preparazione della rete di ponti salati

1. Dopo il passaggio 2.6, aprire i due fermavi a 3 via e sciacquare le bolle nei canali pompando manualmente la soluzione di rivestimento avanti e indietro nel canale utilizzando le due siringhe.
2. Prelevare 3 mL di mezzo completo (mezzo di manutenzione delle cellule staminali costituito dal mezzo di aquila modificato di Dulbecco / miscela nutritiva del prosciutto F-12 (DMEM / F12), supplemento B-27 al 2%, 20 ng/mL EGF e 20 ng/mL bFGF) in una siringa da 3 ml che si collega al fermallo a 3 way dell'ingresso medio (Figura 4B- e Figura 4B- ).
3. Aggiungere 3 mL di mezzo completo per sostituire la soluzione di rivestimento nelle regioni di coltura cellulare. Collegare una siringa vuota da 5 ml al fermago a 3 strade della presa media (Figura 4B- ).
4. Preparare la rete di ponti di sale (Figura 5).
   1. Tagliare il bung di gomma nera per produrre uno spazio e inserire gli elettrodi argento (Ag)/cloruro d'argento (AgCl) attraverso il bung di gomma nera e nella siringa di blocco Luer(Figura 4A).
   2. Sostituire la spina bianca con l'adattatore Luer e iniettare il 3% di agarosio caldo per riempire l'adattatore Luer.
      NOTA: Per la preparazione dell'agarosio caldo, sciogliere 3 g di polvere di agarosio in 100 mL di salina tamponata da fosfati (PBS) e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 30 min.
   3. Collegare la siringa di blocco Luer all'adattatore Luer. Iniettare il 3% di agarosa calda attraverso il bung di gomma nera per riempire la siringa di blocco Luer usando la siringa con ago. Lasciare raffreddare e solidificare da 10 a 20 minuti per l'agarosio.
      NOTA: Per aumentare la capacità di volume dell'agarosio, la siringa di blocco Luer è montata sull'adattatore Luer(figura 4 e figura 5). Quindi, i grandi elettrodi vengono inseriti nella siringa di blocco Luer. L'elettrodo è in grado di fornire una stimolazione elettrica stabile per l'esperimento a lungo termine.

4. Preparazione di mNPC

1. Coltura degli mNPC¹ nel mezzo completo in un pallone da coltura cellulare 25T a 37 °C in un incubatore pieno di atmosfera di CO_{2 al 5%.} Sottocultura le cellule ogni 3-4 giorni, ed eseguire tutti gli esperimenti con cellule che hanno subito 3-8 passaggi dalla fonte originale.
2. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml e spin-down delle neurosfere a 100 × g per 5 min. Aspirare il supernatante e lavare le neurosfere con pbs (DPBS) di 1x Dulbecco. Spin-down delle neurosfere a 100 × g per 5 min.
3. Aspirare il 1x DPBS e quindi rimpiorsi le neurosfere nel mezzo completo. Mescolare accuratamente e delicatamente.
4. Aggiungere 1 ml della sospensione della neurosfera utilizzando una siringa da 1 ml che si collega al fermallo a 3 via dell'uscita (Figura 4B- ).

5. Installazione del sistema microfluidico per la stimolazione dell'impulso CC (Figura 6)

1. Installare il chip MOE semisezionato sulla stufa ITO trasparente fissata su uno stadio motorizzato X-Y-Z programmabile.
   NOTA: La temperatura superficiale ITO è controllata da un controller proporzionale-integrale-derivato e mantenuta a 37 °C. Una termocopia di tipo K viene bloccata tra il chip e il riscaldatore ITO per monitorare la temperatura delle regioni di coltura cellulare all'interno del chip. Il chip MOE è installato su uno stadio motorizzato X-Y-Z programmabile ed è adatto per l'acquisizione automatica di immagini time-lapse nelle singole sezioni del canale. La fabbricazione del riscaldatore ITO e l'installazione del sistema di riscaldamento a coltura cellulare sono stati descritti in^{precedenza 18,19}.
2. Infondere gli mNPC pompando manualemente nel chip MOE tramite la presa media. Incubare il chip MOE semisemito di cellule sul riscaldatore ITO a 37 °C per 4 ore.
3. Dopo 4 ore, pompare il mezzo completo attraverso il chip MOE tramite l'ingresso medio a una portata di 20 μL/h utilizzando una pompa per siringhe.
   NOTA: Gli mNPC vengono coltivati e mantenuti nel chip per ulteriori 24 ore prima della stimolazione EF per consentire l'attacco cellulare e la crescita. Il liquido di scarto viene raccolto in una siringa vuota da 5 ml collegata al fermallo a 3 strade dell'uscita, indicata come "rifiuto" nella figura 6A. La configurazione del sistema microfluidico MOE è illustrata nella figura 6. Questo sistema microfluidico fornisce un continuo apporto di nutrizione alle cellule. Il mezzo fresco completo viene continuamente pompato nel chip MOE per mantenere un valore di pH costante. Pertanto, le cellule possono essere coltivate al di fuori di un incubatore di CO_2.
4. Utilizzare fili elettrici per collegare un multiplexer EF al chip MOE tramite gli elettrodi Ag/AgCl sul chip. Collegare un multiplexer EF e un generatore di funzioni a un amplificatore per emettere impulsi CC ad onda quadra con una magnitudine di 300 mV/mm ad una frequenza di 100 Hz a cicli di servizio del 50% (50% di time-on e 50% di tempo libero)(Figura 6B).
   1. Collegare i fili elettrici al multiplexer EF. Collegare i fili elettrici al chip MOE tramite gli elettrodi Ag/AgCl.
   2. Collegare il multiplexer EF all'amplificatore utilizzando fili elettrici. Collegare il generatore di funzioni all'amplificatore e all'oscilloscopio digitale.
      NOTA: Il multiplexer EF è un circuito che include l'impedenza della camera di coltura nel circuito e collega tutte le singole camere in una rete elettronica parallela. Ognuna delle tre camere di coltura è collegata elettricamente in serie a un resistore variabile (Vr) e un amperometro (mostrato come μA nella figura 6A) nel multiplexer. La corrente elettrica attraverso ogni camera di coltura è variata controllando la Vr, e la corrente è mostrata sull'ammetro corrispondente. La forza del campo elettrico in ogni regione di coltura cellulare è stata calcolata dalla legge di Ohm, I= σEA, dove I è la corrente elettrica, σ (impostata come 1,38 S·m^-1 per DMEM/F12²⁰) è la conduttività elettrica del mezzo di coltura, E è il campo elettrico, e A è l'area trasversale della camera elettrotassica. Per la dimensione della regione di coltura cellulare mostrata nella figura 1, la corrente elettrica è rispettivamente ~87 mA e ~44 mA per l'impulso DC e DC al 50% del ciclo di servizio.
5. Sottosezione degli mNPC a impulsi CC quadrati con una magnitudine di 300 mV/mm alla frequenza di 100 Hz per 48h. Pompare continuamente il mezzo completo ad una velocità di 10 μL/h per fornire un'alimentazione adeguata alle cellule e mantenere un valore di pH costante nel mezzo.

6. Test di immunofluorescenza degli MNPC dopo stimolazione CC pulsata

NOTA: In questo passaggio, tutto il reagente viene pompato tramite l'ingresso medio utilizzando una pompa per siringhe.

1. Dopo 3, 7 o 14 giorni di coltivazione in vitro (DIV) dopo la semina¹, lavare le cellule con 1x PBS ad una portata di 25 μL/min per 20 min.
2. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (PFA). Pompare il 4% di PFA nel chip ad una portata di 25 μL/min per 20 min per sostituire il 1x PBS. Per sostituire il 4% di PFA, lavare le celle con 1x PBS a una portata di 25 μL/min per 20 min.
3. Pompare lo 0,1% di Tritone X-100 nel chip ad una portata di 50 μL/min per 6 minuti per permeabilizzare le cellule. Ridurre la portata a 50 μL/h per altri 30 minuti per reagire con le cellule. Per sostituire lo 0,1% di Tritone X-100, lavare le celle con 1x PBS ad una portata di 50 μL/min per 6 min.
4. Bloccare le cellule con PBS contenente l'1% di albumina siere bovina (BSA) per ridurre il legame anticorpale non specifico. Pompare l'1% di BSA nel chip ad una portata di 50 μL/min per 6 min. Ridurre la portata a 100 μL/h e pompare per 1 h.
5. Pompare gli anticorpi per la doppia immunosocienza nel chip ad una portata di 50 μL/min per 6 min e incubare il truciolo per 18 ore a 4 °C. Lavare le celle con 1x PBS ad una portata di 50 μL/min per 15 min.
6. Pompare gli anticorpi secondari coniugati con Fluor Alexa nel chip ad una portata di 50 μL/min per 6 min. Ridurre la portata a 50 μL/h e pompare gli anticorpi per 1 h a temperatura ambiente al buio. Lavare le celle con 1x PBS ad una portata di 50 μL/min per 15 min.
7. Per la colorazione nucleare, pompare hoechst 33342 nel chip ad una portata di 20 μL/min per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Lavare le celle con 1x PBS ad una portata di 50 μL/min per 15 min.
8. Dopo l'immunosocienza, osservare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale.

7. Analisi delle immagini ed elaborazione dei dati

1. Analizzare le immagini fluorescenti utilizzando il software con strumenti di misurazione integrati (vedere la tabella dei materiali).
2. Confrontare i nuclei controsostenibili hoechst (numero totale di cellule) nei gruppi di controllo e trattamento e calcolare la percentuale di cellule che esprimono ciascun marcatore fenotipico.

Risultati

La configurazione dettagliata del chip MOE è illustrata nella figura 1. Il chip microfluidico fornisce un approccio vantaggioso per ridurre le dimensioni di configurazione sperimentale, il volume del campione e il volume del reagente. Il chip MOE è stato progettato per eseguire tre esperimenti di stimolazione EF indipendenti e diverse condizioni di immunosocienza simultaneamente in un unico studio (Figura 3). Inoltre, il chip M...

Discussione

Durante la fabbricazione del chip MOE, gli adattatori sono attaccati allo Strato 1 del chip MOE con colla cianoacrilato ad azione rapida. La colla viene applicata su 4 angoli degli adattatori e quindi la pressione viene applicata uniformemente sugli adattatori. L'eccesso di quantità di colla deve essere evitato per garantire la completa polimerizzazione della colla. Inoltre, l'assemblaggio del chip MOE completato viene incubato in una camera a vuoto. Questo passaggio aiuta a rimuovere le bolle tra lo strato PMMA, il nas...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mm PMMA substrates (Layers 1-3)	BHT	K2R20	Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL plastic tube	Protech Technology Enterprise Co., Ltd	CT-15-PL-TW	Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized
3 mL syringe	TERUMO	DVR-3413	3 mL oral syringes, without needle
3 mm optical grade PMMA (Layer 5)	CHI MEI Corporation	ACRYPOLY PMMA Sheet	Optical grade PMMA
3-way stopcock	NIPRO	NCN-3L	Sterile disposable 3-way stopcock
5 mL syringe	TERUMO	DVR-3410	5 mL oral syringes, without needle
Adaptor	Dong Zhong Co., Ltd.	Customized	PMMA adaptor
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	Agarose, low gelling temperature
Amplifier	A.A. Lab Systems Ltd	A-304	High voltage amplifier
AutoCAD software	Autodesk	Educational Version	Drafting
B-27 supplement	Gibco	12587-010	B-27 supplement (50x), minus vitamin A
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Peprotech	AF-100-18B	Also called recombinant human FGF-basic
Black rubber bung	TERUMO	DVR-3413	From 3 mL oral syringes, without needle
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B4287	Blocking reagent
Centrifuge	HSIANGTAI	CV2060	Centrifuge
CO2 laser scriber	Laser Tools and Technics Corp.	ILS-II	Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm
Cone connector	IDEX Health & Science	F-120X	One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural
Cone-Luer adaptor	IDEX Health & Science	P-659	Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK
Confocal fluorescence microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Digital camera	OLYMPUS	E-330	Automatic time-lapse image acquisition
Digital oscilloscope	Tektronix	TDS2024	Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency.
Double-sided tape	3M	PET 8018	Purchased from http://en.thd.com.tw/
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	12400024	DMEM/F-12, powder, HEPES
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21600010	DPBS, powder, no calcium, no magnesium
EF multiplexer	Asiatic Sky Co., Ltd.	Customized	Monitor and control the electric current in individual channels
Epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Also called recombinant human EGF
Fast-acting cyanoacrylate glue	3M	7004T	Strength instant adhesive (liquid)
Flat bottom connector	IDEX Health & Science	P-206	Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue
Function generator	Agilent Technologies	33120A	High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability
Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150117	Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed
Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555)	Abcam	ab150086	Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
ImageJ software	National Institutes of Health	1.48v	Analyze the fluorescent images
Indium–tin–oxide (ITO) glass	Merck	300739	For ITO heater
Inverted phase contrast microscope	OLYMPUS	CKX41	For cell morphology observation
K-type thermocouple	Tecpel	TPK-02A	Temperature thermocouples
Luer adapter	IDEX Health & Science	P618-01	Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene
Luer lock syringe	TERUMO	DVR-3413	For agar salt bridges
Mouse anti-GFAP	eBioscience	14-9892	Astrocytes marker
Oligodendrocyte  marker  O4  antibody	R&D Systems	MAB1326	Oligodendrocytes marker
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148	Fixing agent
Phosphate buffered saline (PBS)	Basic Life	BL2651	Washing solution
Poly-L-Lysine (PLL)	SIGMA	P4707	Coating solution
Precision cover glasses thickness No. 1.5H	MARIENFELD	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programmable X-Y-Z motorised stage	Tanlian Inc	Customized	Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportional–integral–derivative (PID) controller	Toho Electronics	TTM-J4-R-AB	Temperature controller
PTFE tube	Professional Plastics Inc. Taiwan Branch	Outer diameter 1/16 Inches	White translucent PTFE tubing
Rabbit anti-Tuj1	Abcam	ab18207	Neuron marker
Syringe pump	New Era Systems Inc	NE-1000	NE-1000 programmable single syringe pump
TFD4 detergent	FRANKLAB	TFD4	Cover glass cleaner
Thermal bonder	Kuan-MIN Tech Co.	Customized	Purchased from http://kmtco.com.tw/
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Permeabilized solution
Ultrasonic cleaner	LEO	LEO-300S	Ultrasonic steri-cleaner
Vacuum chamber	DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.	DOV-30	Vacuum drying oven
White fingertight plug	IDEX Health & Science	P-316	1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html