マイクロ流体デバイスにおける電界誘発神経前駆細胞分化

要約

本研究では、マイクロ流体系における直流(DC)パルス刺激によってのみ誘導される神経幹および前駆細胞(NPC)の分化に関するプロトコルを提示する。

要約

生理的電界(EF)は、細胞の移動、分化、分裂、死に重要な役割を果たしています。本論文では、顕微鏡を用いた長期細胞分化研究に用いたマイクロ流体細胞培養システムについて述べている。マイクロ流体システムは、光学的に透明な電気戦術チップ、透明なインジウムスズ酸化物(ITO)ヒーター、培養メディア充填ポンプ、電力供給、高周波パワーアンプ、EFマルチプレクサ、プログラマブルX-Y-Z電動ステージ、およびデジタルカメラを搭載した逆位相対向顕微鏡の主要コンポーネントで構成されています。マイクロ流体システムは、全体的な実験のセットアップを簡素化し、さらに試薬とサンプルの消費を簡素化する上で有益です。この研究は、直流(DC)パルス刺激によって誘導される神経幹および前駆細胞(NPC)の分化を伴う。幹細胞維持培地では、マウスNPC(mNPC)は、DCパルス刺激後にニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化した。この結果は、単純なDCパルス治療がmNPCの運命を制御し、神経系障害の治療戦略を開発するために使用できることを示唆している。このシステムは、複数のチャネルでの細胞培養、長期EF刺激、細胞形態観察、および自動タイムラプス画像取得に使用できます。このマイクロ流体システムは、必要な実験時間を短縮するだけでなく、微小環境の制御精度を向上させます。

概要

神経前駆細胞(NPC、神経幹および前駆細胞とも呼ばれる)は、神経変性治療戦略1の有望な候補となり得^る。未分化NPCは自己再生能力、多効力、増殖能力^2,3を有する。以前の研究では、細胞外マトリックスと分子メディエーターがNPCの分化を調節することが報告されています。表皮成長因子(EGF)及び塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)はNPC増殖を促進し、従って未分化状態を維持する^4。

これまでの研究では、電気刺激は、除算^5、移動^6、7、8、分化1、9、10、および細胞死¹¹のような細胞生理学的活動を調節することができるという報告がある。電気分野(EF)は、中枢神経系の発達^12,13,14の発達と再生において重要な役割^を果たす。2009年から2019年にかけて、この研究室は、マイクロ流体システム^{1、6、7、8、15、16、17}におけるEFの適用に対する細胞応答^を調査した。マルチチャネル、光学的に透明な電気戦術(MOE)チップは、共焦点顕微鏡用の免疫蛍光染色に適するように設計された。このチップは、高い光学透過性と耐久性を有し、1回の研究で3つの独立した刺激実験といくつかの免疫染色条件の同時実施を可能にした。マイクロ流体システムは、全体的な実験のセットアップを簡素化し、さらに試薬とサンプルの消費を簡素化する上で有益です。本論文では、長期細胞分化研究に用いたマイクロ流体細胞培養システムの開発について述べた。

プロトコル

1. MOEチップの設計と製作

1. 適切なソフトウェアを使用して、個々のポリメチルメタクリレート(PMMA)層と両面テープのパターンを描画します(図1A、材料表)。PMMAシートと両面テープの両方を_CO2レーザーマシンスクライバで切ります(図1B)。
   1. CO2レーザースクライバの電源を入れ、パソコンに接続します。ソフトウェアを使用して、設計されたパターンファイルを開きます。
   2. レーザースクライバのプラットフォーム上にPMMAシート(275mm x 400 mm)または両面テープ(210mm x 297 mm)を置きます(図2A)。オートフォーカスツールを使用して、レーザーをPMMAシートまたは両面テープの表面に焦点を合わせます。
   3. レーザースクリバをプリンタとして選択し、レーザースクリバを使用してPMMAシートまたは両面テープ上で直接切り捨てを開始し、PMMAシートまたはテープ上の個々のパターンを取得するパターンを「印刷」します(図2B)。
2. PMMAシートから保護フィルムを取り出し、窒素ガスを使用して表面を洗浄します。
   注:PMMAパターンの描画とPMMAシートの直接加工は、前のレポート¹⁷に従って行われました。
3. PMMAシートの複数の層を結合する場合は、1mm PMMAシート(層1、2、および3)の3枚を積み重ね、110°Cで30分間熱ボンダーで5kg/cm2の圧力で結合し、流れ/電気刺激チャネルアセンブリを形成する(図2C)。
   注:市販のPMMAシートの異なるバッチは、わずかに異なるガラス転移温度(Tg)を有する。最適なボンディング温度は、Tgに近い5°Cの増分でテストする必要があります。
4. MOEチップアセンブリのレイヤ1の個々の開口部に、高速作用のシアノアクリレート接着剤で12個のアダプタを貼付します。
   注: アダプターは射出成形によって PMMA で作られています。底面の平らな面はMOEチップに接続するための。1/4W-28メスねじねじを持つアダプターは、白い指密栓、平底コネクタ、またはLuerアダプタを接続するためのものです。速効性シアノアクリル酸接着剤を使用する場合は注意してください。目に飛び散らないように。
5. チップを組み立てる前に30分間紫外線(UV)照射を用いて、1mmPMMA基板(層1~3)、両面テープ(層4)、3mm光学グレードPMMA(UV)照射を用いて消毒する(図1A)。
6. 3 mm の光学グレード PMMA (レイヤー 5) に 1 mm の PMMA 基板 (レイヤ 1~3) を両面テープ (レイヤ 4) に付着して PMMA アセンブリを完成させます (図1A)。
7. チップのアセンブリ用に清潔なカバーガラスを用意します。
   1. 汚れた瓶に洗剤の10倍の希釈を充填し( 材料のテーブルを参照)、15分間超音波洗浄機を使用して、この洗剤のカバーガラスをきれいにします。
   2. 水道水の下で染色瓶を十分に洗い流し、洗剤の痕跡をすべて取り除きます。
   3. 蒸留水ですすい続け、水道水の痕跡をすべて取り除き、ステップ1.7.2を2回繰り返します。
   4. 洗浄したカバーガラスを窒素ガスで吹き付けて乾燥させます。
8. PMMAアセンブリ(層1~5)、両面テープ(層6)、およびカバーガラス(レイヤ7)をバイオセーフティキャビネット内で30分間UV照射して、チップを組み立てる前に消毒する(図1A)。
9. 洗浄されたカバーガラス(レイヤ7)を、両面テープ(レイヤ6)でPMMAアセンブリ(レイヤ1~5)に貼り付けます(図1A)。
10. MOEチップを真空チャンバーに一晩インキュベートします。後の手順には MOE チップ アセンブリを使用します (図 3)。

2. 細胞培養領域の基質にポリL-リジン(PLL)をコーティング

1. ポリテトラフルオロエチレンチューブ、フラットボトムコネクタ、コーンコネクタ、コーンルエルアダプタ、白指密プラグ(ストッパーとも呼ばれる)、ルアーアダプタ、ルアーロックシリンジ、ブラックラバーバン(図4A、材料表)を準備します。121°Cでオートクレーブ内の上記のコンポーネントをすべて30分間殺菌します。
2. 寒天ブリッジアダプター(図1A)の開口部を白い指密プラグでシールします。フラットボトムコネクタを、中型の入口アダプタとコンセントアダプタを介してMOEチップアセンブリに接続します(図4B)。コーン-ルアーアダプターを3ウェイストップコックに接続します。
3. 0.01% PLL溶液の2 mLを加え、3 mLのシリンジを使用して、媒体の入口の3方向のストップコックに接続します(図4B- )。
4. 空の3 mLシリンジを、媒体出口の3方向ストップコックに接続します(図4B- )。
5. PLL溶液で細胞培養領域を充填します。手動でコーティング溶液をゆっくりと前後にポンプで送ります。2つの三方ストップコックを閉じて、培養地域内の溶液を密封します。
6. MOEチップを5%CO2雰囲気で満たしたインキュベーターで一晩37°Cでインキュベートします。

3. 塩橋網の整備

1. ステップ2.6に続いて、2つの3ウェイストップコックを開き、2つのスポイジを使用してチャネル内でコーティング溶液を前後に手動でポンピングすることによって、チャネル内の気泡を洗い流します。
2. 完全な培地(ダルベックの修飾イーグルの培地/ハムの栄養素混合物F-12(DMEM/ F12)からなる幹細胞維持培地)の3 mLを、2%B-27サプリメント、20 ng/mL EGF、および20 ng/mL bFGFを3mLのシンジに引き込み、中型図4B(4B)の3ウェイストップコックに接続する。
3. 完全培地の3 mLを加えて、細胞培養領域のコーティング溶液を交換します。空の5 mLシリンジを、媒体出口の3方向ストップコックに接続します(図4B- )。
4. ソルトブリッジネットワークを準備します(図5)。
   1. 黒いゴムバンを切ってギャップを作り出し、銀(Ag)/塩化銀(AgCl)電極を黒いゴム製のバンを通してルアーロックシリンジに挿入します(図4A)。
   2. 白い指密プラグをLuerアダプタに交換し、3%の熱いアガロースを注入してLuerアダプタを充填します。
      注:熱いアガロースの調製のために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の100 mLにアガロース粉末の3gを溶解し、30分間121°Cでオートクレーブで殺菌します。
   3. ルアーロックシリンジをLuerアダプタに接続します。黒いゴム製のバンを通して3%の熱いアガロースを注入し、注射器を針で使用してルアーロックシリンジを充填します。アガロースが冷めて固めるのに10〜20分を許します。
      メモ: アガロースのボリューム容量を増やすために、Luerロックシリンジは Luer アダプタに取り付けられています(図 4 および 図 5)。次いで、大きな電極をルアーロックシリンジに挿入する。電極は、長期実験に安定した電気刺激を提供することができる。

4. mNPCの準備

1. mNPC1を完全培地で37°Cで25T細胞培養フラスコで培養し、5%CO2雰囲気で満たしたインキュベーターに培養する。細胞を3〜4日ごとにサブ培養し、元のソースから3〜8回の通過を受けた細胞を用いて全ての実験を行う。
2. 細胞懸濁液を15 mL円錐状チューブに移し、5分間100×gで神経球をスピンダウンします。上清を吸引し、1xダルベッコのPBS(DPBS)で神経球を洗う。神経球を100×gで5分間スピンダウンします。
3. 1x DPBSを吸引し、その後、完全な培地中の神経球を再中断します。よくやさしく混ぜます。
4. 出口の3方向の停止コックに接続する1 mLのシリンジを使用して、神経圏懸濁液の1 mLを加える(図4B- )。

DCパルス刺激用マイクロ流体システムのセットアップ (図6)

1. プログラム可能な X-Y-Z の電動ステージに取り付けられている透明な ITO ヒーターにセルシード MOE チップを取り付けます。
   メモ:ITO表面温度は、比例積分誘導制御装置によって制御され、37°Cに維持されます。 K型熱電対は、チップとITOヒーターの間にクランプされ、チップ内の細胞培養領域の温度を監視します。MOEチップはプログラム可能なX-Y-Zのモーター化された段階で取付けられ、個々のチャネルセクションの自動タイムラプス画像獲得のために適している。ITOヒーターの製造と細胞培養加熱システムの設定については、前に^18,19を説明した。
2. MNPCを、媒体出口を介してMOEチップに手動でポンピングして注入します。セルシードの MOE チップを 37 °C ITO ヒーターに 4 時間インキュベートします。
3. 4時間経過後、シリンジポンプを使用して、20 μL/hの流量で媒体入口を介してMOEチップを介して完全な媒体をポンプします。
   注: mNPC は、細胞の取り付けと増殖を可能にする EF 刺激の前に、さらに 24 時間、チップ内で成長および維持されます。廃液は、出口の3方向停止コックに接続された空の5mLシリンジに集め、 図6Aの「廃棄物」として示す。MOE マイクロ流体システム構成を 図 6に示します。このマイクロ流体システムは、細胞に栄養の連続的な供給を提供します。完全な新鮮な媒体は連続的に一定のpH値を維持するためにMOEチップにポンプで送られます。したがって、細胞は_CO2 インキュベーターの外側で培養することができる。
4. 電線を使用して、EF マルチプレクサをチップの Ag/AgCl 電極を介して MOE チップに接続します。EF マルチプレクサとファンクション ジェネレータをアンプに接続して、50% デューティ サイクルで 100 Hz の周波数で 300 mV/mm の大波 DC パルスを出力します (50% タイムオンと 50% のタイムアウト) (図 6B)。
   1. 電線をEFマルチプレクサに接続します。Ag/AgCl電極を介して電気線をMOEチップに接続します。
   2. EF マルチプレクサを電気線でアンプに接続します。ファンクション・ジェネレータをアンプとデジタル・オシロスコープに接続します。
      メモ:EFマルチプレクサは、回路内の培養チャンバのインピーダンスを含み、並列電子ネットワーク内のすべての個々のチャンバーを接続する回路です。3つの培養チャンバのそれぞれは、マルチプレクサ内の可変抵抗(Vr)とアンメクタ(図6AでμAとして示す)に直列で電気的に接続されています。各培養チャンバーを通る電流はVrを制御することによって変化し、電流は対応する電流計に示される。各細胞培養領域の電界強度はオームの法則によって計算され、I=σEAは電流、σ(DMEM/F122^用1.38S・m-1に設定)は、培養媒体の電気伝導率、Eは電界、Aは電気戦術室の断面積である。図1に示す細胞培養領域寸法の場合、電流は、DCおよびDCパルスの場合、それぞれ50%デューティサイクルで〜87mA、〜44mAである。
5. mNPC を 48h の 100 Hz の周波数で 300 mV/mm のマグニチュードで正方形 DC パルスにします。完全な培地を10 μL/hの速度で連続的にポンプで送り、細胞に十分な栄養を供給し、培地中で一定のpH値を維持します。

6. パルスDC刺激後のmNPCの免疫蛍光アッセイ

注:このステップでは、すべての試薬は、注射器ポンプを使用して媒体の入口を介してポンプされます。

1. 1を播種した後、3、7、または¹⁴日間のインビトロ(DIV)培養後、25μL/minの流量で細胞を20分間洗浄します。
2. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を固定します。20分間、25 μL/minの流量で4%PFAをチップに送り込み、1x PBSを交換します。4%のPFAを交換するには、25μL/minの流量で20分間、細胞を1x PBSで洗浄します。
3. 0.1%トリトンX-100を50μL/minの流量でチップに送り込み、細胞を透過させます。さらに30分間細胞と反応するために流量を50 μL/hに減らします。0.1%トリトンX-100を交換するには、50μL/minの流量で1x PBSで細胞を6分間洗浄します。
4. 1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSで細胞をブロックし、非特異的抗体結合を低減する。50 μL/min の流量で 1% BSA をチップに 6 分間ポンプで送ります。流量を100μL/hに下げ、ポンプを1時間下げます。
5. 2重免疫染色用の抗体を50 μL/minの流量でチップに6分間ポンプで送り込み、4°Cで18時間インキュベートします。 50 μL/minの流量で1x PBSで細胞を15分間洗浄します。
6. Alexa Fluor結合二次抗体を、50 μL/minの流量でチップに6分間ポンプで送ります。流量を50μL/hに下げ、暗い温度で1時間抗体をポンプで送ります。50 μL/minの流量で1x PBSで細胞を15分間洗浄します。
7. 核染色の場合、Hoechst 33342を20 μL/minの流量で、暗闇の中で室温で10分間チップに送り込みます。50 μL/minの流量で1x PBSで細胞を15分間洗浄します。
8. 免疫染色後、共焦点蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察する。

7. 画像解析とデータ処理

1. 測定ツールを内蔵したソフトウェアを使用して蛍光画像を分析します( 材料表を参照)。
2. コントロール群と治療群におけるHoechstカウンタード核(細胞の総数)を比較し、各表現型マーカーを発現する細胞の割合を計算します。

結果

MOE チップの詳細な構成を図 1に示します。マイクロ流体チップは、実験用セットアップサイズ、サンプル量、試薬量を削減するための有益なアプローチを提供します。MOEチップは、単独の研究で3つの独立したEF刺激実験と複数の免疫染色条件を同時に行うよう設計された(図3)。また、高い光学透過性を有するMOEチップは、?...

ディスカッション

MOEチップの製造中、アダプターは高速作用性シアノアクリレート接着剤でMOEチップのレイヤ1に取り付けられます。接着剤は、アダプターの4つのコーナーに適用され、その後、圧力は、アダプターの上に均等に適用されます。接着剤の完全な重合を確実にするために接着剤の過剰な量を避ける必要があります。さらに、完成したMOEチップアセンブリは真空チャンバ内でインキュベートされま?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mm PMMA substrates (Layers 1-3)	BHT	K2R20	Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL plastic tube	Protech Technology Enterprise Co., Ltd	CT-15-PL-TW	Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized
3 mL syringe	TERUMO	DVR-3413	3 mL oral syringes, without needle
3 mm optical grade PMMA (Layer 5)	CHI MEI Corporation	ACRYPOLY PMMA Sheet	Optical grade PMMA
3-way stopcock	NIPRO	NCN-3L	Sterile disposable 3-way stopcock
5 mL syringe	TERUMO	DVR-3410	5 mL oral syringes, without needle
Adaptor	Dong Zhong Co., Ltd.	Customized	PMMA adaptor
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	Agarose, low gelling temperature
Amplifier	A.A. Lab Systems Ltd	A-304	High voltage amplifier
AutoCAD software	Autodesk	Educational Version	Drafting
B-27 supplement	Gibco	12587-010	B-27 supplement (50x), minus vitamin A
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Peprotech	AF-100-18B	Also called recombinant human FGF-basic
Black rubber bung	TERUMO	DVR-3413	From 3 mL oral syringes, without needle
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B4287	Blocking reagent
Centrifuge	HSIANGTAI	CV2060	Centrifuge
CO2 laser scriber	Laser Tools and Technics Corp.	ILS-II	Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm
Cone connector	IDEX Health & Science	F-120X	One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural
Cone-Luer adaptor	IDEX Health & Science	P-659	Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK
Confocal fluorescence microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Digital camera	OLYMPUS	E-330	Automatic time-lapse image acquisition
Digital oscilloscope	Tektronix	TDS2024	Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency.
Double-sided tape	3M	PET 8018	Purchased from http://en.thd.com.tw/
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	12400024	DMEM/F-12, powder, HEPES
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21600010	DPBS, powder, no calcium, no magnesium
EF multiplexer	Asiatic Sky Co., Ltd.	Customized	Monitor and control the electric current in individual channels
Epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Also called recombinant human EGF
Fast-acting cyanoacrylate glue	3M	7004T	Strength instant adhesive (liquid)
Flat bottom connector	IDEX Health & Science	P-206	Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue
Function generator	Agilent Technologies	33120A	High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability
Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150117	Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed
Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555)	Abcam	ab150086	Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
ImageJ software	National Institutes of Health	1.48v	Analyze the fluorescent images
Indium–tin–oxide (ITO) glass	Merck	300739	For ITO heater
Inverted phase contrast microscope	OLYMPUS	CKX41	For cell morphology observation
K-type thermocouple	Tecpel	TPK-02A	Temperature thermocouples
Luer adapter	IDEX Health & Science	P618-01	Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene
Luer lock syringe	TERUMO	DVR-3413	For agar salt bridges
Mouse anti-GFAP	eBioscience	14-9892	Astrocytes marker
Oligodendrocyte  marker  O4  antibody	R&D Systems	MAB1326	Oligodendrocytes marker
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148	Fixing agent
Phosphate buffered saline (PBS)	Basic Life	BL2651	Washing solution
Poly-L-Lysine (PLL)	SIGMA	P4707	Coating solution
Precision cover glasses thickness No. 1.5H	MARIENFELD	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programmable X-Y-Z motorised stage	Tanlian Inc	Customized	Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportional–integral–derivative (PID) controller	Toho Electronics	TTM-J4-R-AB	Temperature controller
PTFE tube	Professional Plastics Inc. Taiwan Branch	Outer diameter 1/16 Inches	White translucent PTFE tubing
Rabbit anti-Tuj1	Abcam	ab18207	Neuron marker
Syringe pump	New Era Systems Inc	NE-1000	NE-1000 programmable single syringe pump
TFD4 detergent	FRANKLAB	TFD4	Cover glass cleaner
Thermal bonder	Kuan-MIN Tech Co.	Customized	Purchased from http://kmtco.com.tw/
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Permeabilized solution
Ultrasonic cleaner	LEO	LEO-300S	Ultrasonic steri-cleaner
Vacuum chamber	DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.	DOV-30	Vacuum drying oven
White fingertight plug	IDEX Health & Science	P-316	1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html