Disección regional cerebelosa para análisis molecular

Resumen

Se ha implicado que diferentes regiones cerebelosas desempeñan un papel en distintos resultados conductuales, sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo desconocidos. Este trabajo describe un método para diseccionar de manera reproducible y rápida la corteza cerebelosa de los hemisferios, las regiones anterior y posterior del vermis y los núcleos cerebelosos profundos con el fin de sondear las diferencias moleculares mediante el aislamiento del ARN y la prueba de las diferencias en la expresión génica.

Resumen

El cerebelo juega un papel importante en varias funciones clave, incluido el control del movimiento, el equilibrio, la cognición, la recompensa y el afecto. Los estudios de imágenes indican que las distintas regiones cerebelosas contribuyen a estas diferentes funciones. Los estudios moleculares que examinan las diferencias cerebelosas regionales están rezagados, ya que se realizan principalmente en extractos cerebelosos enteros, enmascarando así cualquier distinción en regiones cerebelosas específicas. Aquí describimos una técnica para diseccionar de manera reproducible y rápida cuatro regiones cerebelosas diferentes: los núcleos cerebelosos profundos (DCN), la corteza cerebelosa vermal anterior y posterior y la corteza cerebelosa de los hemisferios. La disección de estas distintas regiones permite la exploración de los mecanismos moleculares que pueden subyacer a sus contribuciones únicas al equilibrio, el movimiento, el afecto y la cognición. Esta técnica también se puede utilizar para explorar las diferencias en la susceptibilidad patológica de estas regiones específicas en varios modelos de enfermedad de ratón.

Introducción

El cerebelo contiene más de la mitad de las neuronas en el cerebro e históricamente se ha referido como un centro de control motor y equilibrio en el cerebro¹. Más recientemente, los estudios han demostrado que el cerebelo juega un papel clave en varias otras funciones, incluida la cognición, el procesamiento de recompensas y afectan^{a 2,3,4,5.}

El cerebelo tiene una anatomía bien descrita: la región de la corteza está compuesta de gránulos, Purkinje y capas moleculares. Las células granulares forman la capa celular granulada y envían entrada a través de fibras paralelas a las dendritas celulares de Purkinje de la capa molecular que también reciben entrada de fibras trepadoras que se originaron en la aceituna inferior. Las células de Purkinje envían proyecciones inhibitorias a las células en los núcleos cerebelosos profundos (DCN), que sirve como la principal salida del cerebelo. La salida de este circuito cerebeloso se modula aún más por la actividad de las interneuronas inhibitorias en la corteza cerebelosa, incluidas las células de Golgi, estrelladas y cesta⁴. Esta unidad funcional cerebelosa se distribuye por todos los lóbulos de la corteza cerebelosa. A pesar de este circuito relativamente uniforme a través del cerebelo, la evidencia de la literatura de neuroimagen humana y los estudios de pacientes indican heterogeneidad funcional del cerebelo^6,7.

La corteza cerebelosa se puede dividir en dos regiones principales: el vermis definido en la línea media y los hemisferios laterales. El vermis se puede dividir en lóbulos anterior y posterior. Estas distintas regiones del cerebelo han sido implicadas en contribuir a diferentes comportamientos. Los patrones de actividad evocados por tareas o sin tareas implicaron que las regiones anteriores del vermis contribuyen más a la función motora, mientras que el vermis posterior contribuye más a la cognición^6,7. El vermis también está relacionado con el afecto y las emociones, mientras que los hemisferios cerebelosos contribuyen a las funciones ejecutivas, visuales-espaciales, del lenguaje y otras funciones mnemotécnicas⁸. Además, los estudios anatómicos proporcionaron evidencia de que las regiones cerebelosas funcionalmente distintas están conectadas con diferentes regiones corticales⁹. El mapeo lesión-síntoma reveló que los pacientes con accidentes cerebrovasculares que afectan los lóbulos anteriores (que se extienden hacia el lóbulo VI) tuvieron un rendimiento más pobre en las tareas motoras finas, mientras que los pacientes con daño en las regiones del lóbulo posterior y los hemisferios exhibieron déficits cognitivos en ausencia de síndrome motor cerebeloso¹⁰. Finalmente, la patología cerebelosa regional en la enfermedad indica que las regiones cerebelosas funcionalmente distintas también son susceptibles de manera diferente a la enfermedad^11,12.

Aunque mucho menos explorada, la evidencia preliminar demuestra distintas firmas de expresión génica en las regiones corticales cerebelosas. La expresión celular de Purkinje de Zebrin II muestra patrones específicos de la región en el vermis de tal manera que hay más células positivas de Zebrin II en los lóbulos posteriores y menos en los lóbulos anteriores¹³. Esto también se correlaciona con una función fisiológica regionalmente distinta, ya que las células de Purkinje negativas de Zebrin II muestran una mayor frecuencia de disparo tónico que las células de Purkinje que son Zebrin II^{positivas 14}.

Además de la corteza cerebelosa, el cerebelo incluye los núcleos cerebelosos profundos (DCN) que sirven como la salida primaria para el cerebelo. Los núcleos están formados por los núcleos medial (MN), interpuesto (IN) y lateral (LN). Las imágenes funcionales y los estudios de pacientes han demostrado que el DCN también participa en varios comportamientos¹⁵, pero muy pocos estudios examinan el cambio de la expresión génica en dcN.

Los avances en las técnicas moleculares han hecho posible evaluar la expresión génica regional en el cerebro y han descubierto heterogeneidad a través y dentro de diferentes regiones del cerebro tanto en estados fisiológicos como de enfermedad¹⁶. Tales estudios implican que el cerebelo es diferente de otras regiones del cerebro. Por ejemplo, la proporción de neuronas a células gliales se invierte en el cerebelo en comparación con otras regiones del cerebro¹. Incluso en condiciones fisiológicas normales, la expresión de genes proinflamatorios está regulada al alza en el cerebelo en comparación con las otras regiones del cerebro¹⁷. Las técnicas moleculares también han sido muy útiles para identificar las vías que contribuyen a la patogénesis de las enfermedades cerebelosas. Por ejemplo, la secuenciación de ARN de los extractos cerebelosos completos identificó genes alterados en un modelo de ratón transgénico específico de células de Purkinje de ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1) en comparación con sus controles de tipo salvaje. Dicha evidencia ha revelado vías moleculares clave que subyacen a la patogénesis en las células cerebelosas de Purkinje y ha ayudado a identificar posibles objetivos terapéuticos¹⁸. Sin embargo, estudios recientes sugieren que existen diferencias en la vulnerabilidad a las enfermedades en las regiones cerebelosas^11,12,19. Esto podría indicar que hay cambios clave que ocurren en distintas regiones cerebelosas, que pueden enmascararse o no detectarse con extractos cerebelosos completos. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar técnicas que permitan a los investigadores examinar los perfiles moleculares en diferentes regiones cerebelosas.

La técnica propuesta aquí describe un método reproducible para diseccionar cuatro regiones distintas del cerebelo de ratón con el fin de aislar el ARN de esas regiones y explorar las diferencias regionales en la expresión génica. El esquema del cerebelo del ratón en la Figura 1A resalta el vermis en azul y los hemisferios en amarillo. En concreto, esta técnica permite aislar cuatro regiones: núcleos cerebelosos profundos (DCN) (cuadros de puntos rojos en la Figura 1A),la corteza cerebelosa del vermis anterior (CCaV) (azul oscuro en la Figura 1A),la corteza cerebelosa del vermis posterior (CCpV) (azul claro en la Figura 1A),y la corteza cerebelosa de los hemisferios (CCH) (amarillo en la Figura 1A). Al evaluar la expresión génica de estas regiones por separado, será posible investigar los mecanismos moleculares subyacentes a las funciones discretas de estas diferentes regiones, así como las posibles diferencias en su vulnerabilidad a la enfermedad.

Protocolo

1. Configuración

1. Reúna el equipo necesario, incluidas las tijeras de decapitación, las yempadoras romas, las tijeras de disección, las tijeras vasculares, la microespatula, la matriz cerebral del ratón sagital, las cuchillas de afeitar, las puntas de pipeta de 200 μL, la placa de Petri de vidrio, el portaobjetos de vidrio y el cubo de hielo. Coloca todo el equipo en una almohadilla absorbente.
2. Coloque la placa de Petri, la placa de vidrio y la matriz cerebral sobre hielo.
3. Usando una cuchilla de afeitar en un ángulo perpendicular, recorte aproximadamente 5 mm de la punta de una punta de pipeta de 200 μL. Esto hace que el tamaño de la abertura en el extremo de la punta sea de aproximadamente 1 mm de ancho. Esto debería ser suficiente para perforar el DCN. Pero esto también se puede ajustar según sea necesario dependiendo de la disección. Tenga muchos consejos listos para un fácil reemplazo y ajuste.
4. Etiquete los tubos de microfuge de 1,5 ml con identificación animal y región cerebelosa (cuatro tubos por animal).
5. Llene el recipiente crioseguro con nitrógeno líquido para congelar el tejido después de la extracción.

2. Extracción y disección cerebral

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Comités de Cuidado de Animales de la Universidad de Minnesota.

1. Eutanasiar al ratón usando un 5% de exposición al CO_2. Una vez que la respiración haya cesado, realice una luxación cervical. Decapita al ratón con las tijeras de decapitación y desecha el cadáver en el receptáculo apropiado.
2. Haga una incisión con una cuchilla de afeitar a lo largo de la línea sagital medial de la cabeza comenzando en la nariz y continuando todo el camino hacia atrás. Separe la piel, separe a cada lado de la línea media. Use la cuchilla de afeitar para cortar el músculo de cada lado, cortando más allá de los canales auditivos.
3. Usando tijeras de disección, recorte cualquier región de la médula espinal, hasta donde el tronco encefálico se encuentre con el cerebelo, con cuidado de no dañar el cerebelo.
4. Inserte una de las hojas de tijera vascular en el espacio entre el tronco encefálico y la columna vertebral y corte hacia el canal auditivo, levantándose sobre las tijeras para cortar limpiamente el hueso pero limitar el daño al tejido.
5. Continúe cortando a lo largo del borde del cráneo hacia los bulbos olfativos, continuando levantándose mientras corta para limitar el daño al tejido cerebral.
6. Usando los bórceps contundentes, despegue suavemente la parte posterior del cráneo descubriendo la región posterior del cerebro y el cerebelo.
7. Usando las pórceps romas a lo largo del borde del cráneo que se acaba de cortar, pelar el resto del cráneo hacia arriba y sobre el cerebro. Este paso debe eliminar la mayoría de la tapa del cráneo, revelando el cerebro.
8. Recorte el resto del cráneo con las tijeras vasculares y las yórceps romas, limpiando la mayor parte del cráneo de la parte superior del cerebro.
9. Usando la microespatula, levante el cerebro ligeramente y recoja debajo y deslice hacia arriba para eliminar los bulbos olfativos del cráneo restante y desconectar las fibras del tracto óptico. El cerebro debería liberarse fácilmente en este punto.
10. Coloque el cerebro en la placa de Petri sentada sobre hielo y retire el cráneo restante u otros desechos.
11. Usando la microespatula, coloque suavemente el cerebro en la matriz cerebral con el lado dorsal hacia arriba. Tómese el tiempo para asegurarse de que esté establecido en el nivel de la matriz, especialmente que la línea media caiga al centro de la matriz. Esta matriz está diseñada para el tejido cerebral de ratón adulto, el tejido de animales más jóvenes o enfermos puede descansar más abajo en la matriz, pero aún así debería ser posible lograr resultados reproducibles en todas las muestras.
12. Coloque una cuchilla de afeitar a lo largo de la línea media sagital, asegurándose de que la cuchilla empuje hasta la parte inferior de la matriz(Figura 1B).
13. Coloque otra hoja de afeitar de 1 mm al lado de la primera cuchilla (Figura 1B). Coloque dos cuchillas más a 1 mm de distancia entre sí. El resultado final debe ser tres cuchillas colocadas en un lado del cerebro, todas separadas por 1 mm. Haz lo mismo con el otro lado. En total, se colocarán 7 cuchillas separadas por 1 mm(Figura 1C).
14. Con cuidado, agarre los extremos delantero y posterior de las cuchillas de afeitar y levántelas directamente de la matriz. El tejido en el exterior de las cuchillas de afeitar se puede desechar.
15. Lentamente, separe una hoja de afeitar a la vez de las demás, teniendo cuidado de no dañar las secciones de tejido.
16. Deslice con cuidado la sección de tejido de la hoja de afeitar y sobre el portaobjetos de vidrio con la microespatula. En total habrá seis secciones cerebrales sagitales(Figura 1D).
17. Las 4 secciones más laterales tendrán DCN visible (cuadro púrpura, Figura 1D). Para aislar el DCN, sostenga la punta de pipeta recortada de 200 μL perpendicularmente sobre el DCN y empuje hacia abajo a través del tejido firmemente, balanceándose en todas las direcciones para diseccionar completamente el DCN del tejido circundante. Levante hacia arriba para eliminar limpiamente el DCN y confirme visualmente la presencia del tejido en la punta.
18. Coloque un dedo en la parte superior de la punta y empuje hacia abajo, haciendo que el tejido sobresalga. Coloque la punta en un tubo de microfuge correctamente etiquetado y asegúrese de que el punzón de tejido se coloque en la parte inferior del tubo. Repita 2.17 para las tres secciones restantes, colocando los punzones DCN en el mismo tubo. Coloque el tubo en nitrógeno líquido para congelar el flash. Representación del tamaño de cada punzón en la Figura 1E.
19. Las secciones que tenían DCN extraído califican como hemisferio cerebeloso. Aleje el resto del tejido cerebral alrededor del cerebelo en estas secciones. Use fórceps contundentes y recoja suavemente estas secciones de la corteza cerebelosa del hemisferio y colóquelas en el tubo de microfugio respectivo. Congelación de flash.
20. Para las dos últimas secciones vermales (cuadro azul claro, Figura 1D),aleje el tejido cerebral circundante dejando solo el cerebelo. Con una cuchilla de afeitar, haga un corte que separe los lóbulos anteriores de los lóbulos posteriores. El corte debe ser justo después de la formación del lóbulo 6 y no debe incluir el lóbulo 10(Figura 1F).
21. Usando fórceps contundentes, coloque cuidadosamente las secciones de la corteza cerebelosa anterior y las secciones de la corteza cerebelosa posterior en sus respectivos tubos de microfugios y congele el flash dejando los tubos en nitrógeno líquido durante 5 minutos. A partir de aquí, avance a la extracción de ARN, o puede almacenar los tubos a -80 ° C.

3. Extracción de ARN

NOTA: Este protocolo está modificado del Protocolo de Puerto de Cold Spring para la Extracción de ARN con TRIzol^20. TRIzol solubiliza el material biológico, haciendo posible la extracción de ARN.

1. Coloque los tubos de microfuge en hielo para evitar que el tejido se descongele demasiado rápido, aplique 150 μL de TRIzol frío en el tubo de microfuge. Homogeneizar con un mortero esterilizado. Una vez que el tejido esté homogeneizado, pipetee la solución hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que no quede tejido intacto. Rompa aún más cualquier pedazo pequeño de tejido tirando de él en una jeringa de insulina varias veces.
2. Agregue otros 350 μL de TRIzol y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Deje reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
3. Agregue 150 μL de cloroformo al tubo y agite vigorosamente y luego deje reposar durante 2-3 minutos. El cloroformo separa la solución tisular homogeneizada en fases (ARN, ADN y proteína).
4. Centrifugar a 12.000 x g, a 15°C, durante 10 minutos. Asegúrese de que todos los tubos estén en la misma orientación.
5. Retire cuidadosamente los tubos y ajuste la temperatura de la centrífuga a 4 ° C. Retire solo la fase acuosa clara en un nuevo tubo (este es el ARN), con cuidado de no interrumpir la interfase opaca (el ADN).  La fase más baja será roja y contiene proteínas. La solución restante en los tubos se puede guardar o desechar.
6. Agregue alcohol isopropílico al 100% en una proporción de 1: 2 (si se eliminan 200 ul de fase acuosa, agregue 100 μL de alcohol isopropílico). Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El alcohol isopropílico precipita el ARN fuera de la solución.
7. Centrifugar a 12.000 x g, a 4°C, durante 10 minutos. Asegúrese de colocar todos los tubos en la misma orientación para que sea más fácil visualizar el pellet. El pellet resultante será el ARN extraído.
8. Retire cuidadosamente los tubos, retire el sobrenadante con una pipeta teniendo cuidado de no interrumpir el pellet. El pellet es algo parecido a un gel y será difícil de ver, pero debe poder estimar dónde está en función de la orientación de los tubos en la centrífuga.
9. Después de quitar todo el sobrenadante, agregue 500 μL de etanol al 75%, vórtice brevemente y centrífuga a 7500 x g, a 4 ° C, durante 5 minutos. El etanol lava aún más el pellet.
10. Retire el sobrenadante con cuidado, sin interrumpir el pellet. Deje las tapas abiertas para secar la muestra. Esto generalmente toma de 5 a 10 minutos, pero puede variar dependiendo de la cantidad de etanol que quedó en el pellet. No seque en exceso.
11. Una vez seco, vuelva a gastar el pellet en agua libre de DNasa. Agregue 20 μL a las muestras para DCN y 30 μL para todas las demás.
12. Una vez resuspendidas, las muestras pueden almacenarse a -80 °C o proceder a pruebas adicionales.

4. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RTqPCR)

1. Antes de este paso será necesario tratar el ARN con DNasa para eliminar cualquier ADN genómico y generar ADNc utilizando iScript de BioRad. Asegúrese de normalizar la concentración de ARN antes de hacer el ADNc. Además, es importante optimizar los cebadores para qPCR. Siga los métodos descritos aquí para completar este paso²¹. Breve descripción de la qPCR a continuación.
2. Todos los cebadores se compran a IDT. Las secuencias hacia adelante y hacia atrás están en el mismo tubo de muestra y se almacenan a una concentración de 20x.
   Rps18 (gen de control):
   Adelante – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
   Reverso – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
   Parvalbúmina (proteína de unión al calcio, células inhibitorias):
   Adelante – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
   Reverso – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3'
   Kcng4 (subunidad del canal de potasio):
   Adelante – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
   Reverso – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
   Aldolasa C (Zebrin II, expresada diferencialmente a través de la corteza cerebelosa):
   Delantero – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3'
   Reverso – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3'
3. Las condiciones de qPCR fueron las siguientes. Periodo de preincubación, 5 minutos, a 95°C. Período de amplificación, 50 ciclos: 10 minutos a 95°C, 10 minutos a 62°C y 10 minutos a 72°C. Período de curva de fusión, 5 segundos a 95 ° C, un minuto a 65 ° C, y establezca la velocidad de rampa a .07 ° C / segundo hasta la temperatura objetivo de 97 ° C. Luego período de enfriamiento durante 10 minutos a 40 ° C.  Todas las reacciones de qPCR se realizaron por triplicado y la expresión génica se analizó utilizando 2^{- ΔΔCt} con Rps18 como control de carga para normalizar la expresión génica. Se utilizó extracto cerebeloso a granel como referencia.

Resultados

Para estos experimentos, se utilizaron cuatro ratones salvajes hembra de once semanas de edad tipo C57 / Black6. Se utilizó un ratón para realizar una disección cerebelosa completa que se conoce como "cerebelo a granel" y permitió la comparación de los niveles de ARN en regiones disecadas con una disección completa. Los otros tres ratones se utilizaron para realizar la disección cerebelosa descrita en este protocolo. El uso de tres ratones permite garantizar que las tendencias dete...

Discusión

El método descrito aquí permite evaluar la expresión génica subyacente y los mecanismos moleculares dentro de cuatro regiones cerebelosas distintas: los núcleos cerebelosos profundos (DCN), la corteza cerebelosa anterior del vermis (CCaV), la corteza cerebelosa posterior del vermis (CCpV) y la corteza cerebelosa de los hemisferios (CCH). La capacidad de evaluar estas regiones por separado ampliará nuestro conocimiento de la heterogeneidad de regiones cerebelosas específicas y posiblemente arrojará luz sobre su co...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 Microcentrifuge tubes	ThermoScietific	3456
100% Isopropyl Alcohol	VWR Life sciences	1106C361
200 ul Pipet tips	GeneMate	P-1237-200
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal	Kent Scientific Corporation	RBMA-200S
Blunt forceps
Chloroform	Macron	220905
Decapitation Scissors
Dissecting Scissors
Ethyl Alcohol	Pharmco	111000200
Glass Slide (for electrophoresis)	BIORAD
Homogenizer	Kimble	6HAZ6
Ice Bucket
Insulin Syringe (.5ml)	BD	329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR	BIORAD	1725037
Micro Spatula
Needle Nose forceps
Petri Dish	Pyrex
Primetime Primer for Aldolase C	IDT	Mm.PT.58>43415246
Primetime Primer for Kcng4	IDT	Mm.PT.56a.9448518
Primetime Primer for Parvalbumin	IDT	Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18	IDT	Mm.PT.58.12109666
Single Edge Rzor Blades	Personna GEM
Sterile, sigle-use pestles	FisherScientific	12141364
TRIzol Reagent	Ambion by Life technologies	15596018
Vascular Scissors