ניתוח אזורי של Cerebellar לניתוח מולקולרי

Summary

אזורים מוחיים שונים כבר מעורבים לשחק תפקיד תפוקות התנהגותיות ברורות, עדיין המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין לא ידוע. עבודה זו מתארת שיטה להתרבות במהירות ולנתח קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור, האזורים הקדמיים והאחוריים של ורמיס, ואת גרעיני המוח הקטן העמוקים על מנת לחקור הבדלים מולקולריים על ידי בידוד RNA ובדיקת הבדלים בביטוי הגנים.

Abstract

Cerebellum ממלא תפקיד חשוב במספר פונקציות מפתח כולל שליטה בתנועה, איזון, קוגניציה, תגמול, השפעה. מחקרי הדמיה מצביעים על כך שאזורים מוחיים נפרדים תורמים לפונקציות שונות אלה. מחקרים מולקולריים הבוחנים הבדלים במוח הקטן האזורי מפגרים כפי שהם נעשים בעיקר על תמציות מוחין שלמות ובכך להסוות כל הבחנות על פני אזורים מוחיים ספציפיים. כאן אנו מתארים טכניקה לשחזור ובמהירות של ארבעה אזורי מוח הקטן שונים: גרעיני המוח הקטן העמוקים (DCN), קליפת המוח המוח הקדמית והאחורית, קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור. ניתוח אזורים נפרדים אלה מאפשר לחקור מנגנונים מולקולריים שעשויים לעמוד בבסיס תרומתם הייחודית לאיזון, תנועה, השפעה וקוגניציה. טכניקה זו עשויה לשמש גם כדי לחקור הבדלים ברגישות הפתולוגית של אזורים ספציפיים אלה על פני מודלים שונים של מחלות עכבר.

Introduction

המוח הקטן מכיל יותר ממחצית הנוירונים במוח, מבחינה היסטורית המכונה מרכז שליטה ואיזון מוטורי במוח¹. לאחרונה, מחקרים הראו כי המוח הקטן ממלא תפקיד מפתח בפונקציות שונות אחרות, כולל קוגניציה, עיבוד תגמול, ולהשפיע^{על 2,3,4,5}.

המוח הקטן יש אנטומיה המתוארת היטב: אזור קליפת המוח מורכב גרגר, Purkinje, ושכבות מולקולריות. תאי גרגר יוצרים את שכבת תא הגרגר ושולחים קלט באמצעות סיבים מקבילים לדנדריטים של תאי Purkinje של השכבה המולקולרית אשר מקבלים גם קלט מסיבי טיפוס שמקורם בזית נחות. תאי Purkinje לשלוח תחזיות מעכבות לתאים גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN), אשר משמש את הפלט העיקרי מן המוח הקטן. הפלט של מעגל המוח הקטן הזה מווסת עוד יותר על ידי הפעילות של interneurons מעכב בקליפת המוח הקטן, כולל Golgi, stellate, ותאי סל⁴. יחידה תפקודית מוחית זו מופצת בכל האונים של קליפת המוח הקטן. למרות מעגלים אחידים יחסית זה על פני המוח הקטן, עדויות מספרות דימות מוחי אנושי ומחקרים סבלניים מצביעים על הטרוגניות תפקודית של המוח הקטן^6,7.

קליפת המוח הקטן יכולה להיות מחולקת לשני אזורים עיקריים: ורמיס המוגדר על קו האמצע, וחצי הכדור לרוחב. ניתן לחלק את הוורמוי עוד יותר לאופות הקדמיות והאחוריות. אזורים נפרדים אלה של המוח הקטן היו מעורבים בתרומה להתנהגויות שונות. דפוסי פעילות מעוררי משימות או נטולי משימות סיבכו את העובדה שאזורים הקדמיים של הוורמיס תורמים יותר לתפקוד המוטורי בעוד שהרמיס האחורי תורם יותר לקוגניציה^6,7. ורמיס מקושר גם עם השפעה ורגשות, בעוד חצי הכדור המוחי לתרום מנהל, חזותי-מרחבי, שפה, ופונקציות mnemonic אחרים⁸. בנוסף, מחקרים אנטומיים סיפקו ראיות לכך שאזורי המוח הקטן הייחודיים מבחינה תפקודית מחוברים לאזורים קליפתיים שונים⁹. מיפוי תסמיני נגע גילה כי חולים עם שבץ המשפיעים על lobules הקדמי (מתרחב לתוך lobule VI) היו ביצועים ירודים יותר על משימות מוטוריות עדינות, בעוד חולים עם נזק לאזורי האונה האחורית וחצי הכדורים הראו ליקויים קוגניטיביים בהיעדר תסמונת מוטורית מוחית¹⁰. לבסוף, פתולוגיה מוחית אזורית במחלה מצביעה על כך שאזורי המוח הקטן הייחודיים מבחינה תפקודית רגישים גם הם באופן שונה למחלה^11,12.

בעוד הרבה פחות נחקר, ראיות ראשוניות מדגים חתימות ביטוי גנים ברורים על פני אזורים קליפת המוח הקטן. ביטוי התא Purkinje של Zebrin II מראה דפוס ספציפי לאזור vermis, כך שיש יותר תאים חיוביים Zebrin II ב lobules האחוריים ופחות ב lobules הקדמי¹³. זה גם מתואם עם תפקוד פיזיולוגי ייחודי אזורי כמו תאי Purkinje שלילי זברין II להציג תדירות גבוהה יותר של ירי טוניק מאשר תאי Purkinje כי הם זברין II חיובי¹⁴.

בנוסף קליפת המוח הקטן, המוח הקטן כולל גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN) המשמשים את הפלט העיקרי עבור המוח הקטן. הגרעינים מורכבים מהמידל (MN), משולבים (IN) וגרעיני לרוחב (LN). הדמיה פונקציונלית ומחקרי מטופלים הראו כי DCN גם להשתתף בהתנהגויות שונות¹⁵, אבל מעט מאוד מחקרים לבחון שינוי ביטוי גנים ב- DCN.

ההתקדמות בטכניקות מולקולריות אפשרה להעריך ביטוי גנים אזורי במוח וחשפו הטרוגניות על פני ובתוך אזורי מוח שונים הן במצבים פיזיולוגיים והן במצבי מחלה¹⁶. מחקרים כאלה מסבכים כי המוח הקטן שונה מאזורי מוח אחרים. לדוגמה, היחס בין נוירונים לתאי גליה הפוך במוח הקטן בהשוואה לאזורי מוח אחרים¹. אפילו בתנאים פיזיולוגיים רגילים, הביטוי של גנים פרו-דליקים הוא upregulated במוח הקטן לעומת אזורי המוח^{האחרים 17}. טכניקות מולקולריות היו גם מאוד שימושי בזיהוי המסלולים התורמים פתוגנזה של מחלות מוחיות. לדוגמה, רצף RNA של כל תמציות המוח הקטן זיהה גנים שהשתנו במודל עכבר מהונדס ספציפי לתא Purkinje של spinocerebellar אטקסיה סוג 1 (SCA1) בהשוואה לבקרות סוג הבר שלהם. ראיות כאלה חשפו מסלולים מולקולריים מרכזיים שבבסיס פתוגנזה בתאי פורקיניה במוח הקטן ועזרו לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות¹⁸. עם זאת, מחקרים אחרונים מראים כי ישנם הבדלים בפגיעות למחלות ברחבי אזורי המוח הקטן^11,12,19. זה יכול להצביע על כך שיש שינויים מרכזיים המתרחשים באזורים מוחיים נפרדים, אשר עשוי להיות רעול פנים או מבלי שיבחינו עם תמציות מוחין שלם. לכן, יש צורך לפתח טכניקות המאפשרות לחוקרים לבחון פרופילים מולקולריים באזורים מוחיים שונים.

הטכניקה המוצעת כאן מתארת שיטה ניתנת לשחזור לנתח ארבעה אזורים נפרדים של המוח הקטן של העכבר על מנת לבודד RNA מאזורים אלה ולחקור הבדלים אזוריים בביטוי גנים. השרטוט של המוח הקטן של העכבר באיור 1A מדגיש את הוורמיס בכחול, ואת ההמיספרות בצהוב. באופן ספציפי, טכניקה זו מאפשרת לבודד ארבעה אזורים: גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN) (תיבות מנוקדות באדום באיור 1A),קליפת המוח הקטן של ורמיס הקדמי (CCaV) (כחול כהה באיור 1A), קליפת המוח המוח של ורמיס האחורי (CCpV) (כחול בהיר באיור 1A),וקליפת המוח הקטן של האונה הקדמית (CCH) (צהוב באיור 1A). על ידי הערכת ביטוי גנים של אזורים אלה בנפרד, ניתן יהיה לחקור מנגנונים מולקולריים שבביסת פונקציות נפרדות של אזורים שונים אלה, כמו גם הבדלים פוטנציאליים בפגיעותם במחלות.

Protocol

1. התקנה

1. לאסוף את הציוד הדרוש כולל מספריים עריפת ראש, מלקחיים קהים, מספריים ביתוש, מספריים וסקולריים, microspatula, מטריצת המוח של עכבר קשת, סכיני גילוח, 200 קצות צינור μL, צלחת פטרי זכוכית, שקופית זכוכית, ודלי קרח. הניחו את כל הציוד על כרית סופגת.
2. מניחים צלחת פטרי, צלחת זכוכית ומטריצת מוח על קרח.
3. בעזרת סכין גילוח בזווית אנכית, לקצץ כ 5 מ"מ את הקצה של קצה צינור 200 μL אחד. זה עושה את גודל הפתח בסוף הקצה על 1 מ"מ רוחב. זה צריך להיות מספיק כדי להכות את DCN. אבל זה יכול גם להיות מותאם לפי הצורך בהתאם לנתח. יש טיפים רבים מוכנים להחלפה קלה והתאמה.
4. תווית 1.5 mL צינורות מיקרופוגה עם זיהוי בעלי חיים ואזור המוח הקטן (ארבעה צינורות לכל חיה).
5. מלא מיכל קריוsafe עם חנקן נוזלי פלאש להקפיא רקמה לאחר החילוץ.

2. מיצוי מוח ותח

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות הוועדות לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת מינסוטה.

1. המתת חסד את העכבר באמצעות חשיפה 5% CO_2. לאחר הנשימה נפסק, לבצע נקע צוואר הרחם. לערוף את ראש העכבר עם מספרי עריפת ראש ולהשליך את הפגר בכלי הקיבול המתאים.
2. לעשות חתך עם סכין גילוח לאורך קו הקשת המשיאלי של הראש מתחיל באף וממשיך כל הדרך חזרה. להפריד את העור, פרידה לכל צד של קו האמצע. השתמש בסכין הגילוח כדי לחתוך את השריר בכל צד, חיתוך מעבר לתעלות האוזן.
3. באמצעות מספריים לנתח, לקצץ את כל אזורי חוט השדרה, עד שבו גזע המוח פוגש את המוח הקטן, זהיר לא לפגוע במוח הקטן.
4. הכנס את אחד להבי המספריים של כלי הדם לחלל שבין גזע המוח לעמוד החוליות וחתכו לכיוון תעלת האוזן, הרימו את המספריים כדי לחתוך את העצם בצורה נקייה אך הגבילו את הנזק לרקמה.
5. המשך לחתוך לאורך קצה הגולגולת כלפי מעלה לכיוון נורות הריח, ממשיך להרים תוך כדי חיתוך כדי להגביל את הנזק לרקמת המוח.
6. באמצעות מלקחיים קהים, בעדינות לקלף את החלק האחורי של הגולגולת לחשוף את האזור האחורי של המוח ואת המוח הקטן.
7. באמצעות המלקחיים הקהים לאורך קצה הגולגולת שנחתכו זה עתה, לקלף את שאר הגולגולת למעלה ומעל המוח. שלב זה צריך להסיר את רוב כובע הגולגולת, חושף את המוח.
8. לקצץ את שאר הגולגולת עם מספריים וסקולריים ומלקחיים קהים, ניקוי רוב הגולגולת מהחלק העליון של המוח.
9. בעזרת המיקרו-המרית, הרימו מעט את המוח והכופפו מתחת והחליקו למעלה כדי להסיר את נורות הריח מהגולגולת הנותרת ולנתק את הסיבים האופטיים. המוח צריך לצאת לחופשי בקלות בשלב זה.
10. מניחים את המוח לתוך צלחת הפטרי היושב על קרח ולהסיר כל גולגולת שנותרה או פסולת אחרת.
11. באמצעות המיקרו-המרית, הניחו בעדינות את המוח במטריצה של המוח עם צד גב למעלה. קח זמן כדי לוודא שהוא מוגדר ברמה במטריצה, במיוחד כי קו האמצע נופל במרכז המטריצה. מטריצה זו מיועדת לרקמת מוח עכבר בוגרת, רקמה מבעלי חיים צעירים או חולים עשויים לנוח נמוך יותר במטריצה, אך עדיין ניתן להשיג תוצאות ניתנות לשחזור על פני דגימות.
12. הניחו סכין גילוח אחד לאורך קו האמצע של הקשת, וודאו שהלהב דוחף עד לתחתית המטריצה(איור 1B).
13. מניחים סכין גילוח נוסף 1 מ"מ בצד הלהב הראשון(איור 1B). מניחים עוד שני להבים במרחק של 1 מ"מ זה מזה. התוצאה הסופית צריכה להיות שלושה להבים הממוקמים בצד אחד של המוח, כולם במרחק של 1 מ"מ זה מזה. תעשה את אותו הדבר לצד השני. בסך הכל, 7 להבים יוצבו 1 מ"מ זה מזה(איור 1C).
14. בזהירות, לתפוס את הקצוות הקדמיים והאחזוריים של סכיני הגילוח ולהרים ישר מתוך המטריצה. ניתן להשליך את הרקמה בצד החיצוני של סכיני הגילוח.
15. לאט, להפריד סכין גילוח אחד בכל פעם מהאחרים, נזהר לא לפגוע בקטעי הרקמה.
16. להחליק בזהירות את קטע הרקמה את סכין הגילוח על שקופית הזכוכית עם microspatula. בסך הכל יהיו שישה מקטעי מוח קשתיים(איור 1D).
17. ב-4 המקטעים הרחבים ביותר יהיה DCN גלוי (תיבה סגולה, איור 1D). כדי לבודד את DCN, להחזיק את קצה צינור 200 μL קצוץ בניצב מעל DCN ולדחוף למטה דרך הרקמה בחוזקה, מתנדנד בכל הכיוונים כדי לנתח באופן מלא את DCN מן הרקמה שמסביב. הרם ישר למעלה כדי להסיר את ה- DCN בצורה נקייה, ואשר חזותית את נוכחות הרקמה בקצה.
18. מניחים אצבע אחת בחלק העליון של הקצה ולדחוף למטה, גורם לרקמה להתבלט החוצה. מניחים את הקצה לתוך צינור microfuge שכותרתו נכונה ולוודא כי ניקוב רקמה ממוקם בתחתית הצינור. חזור על 2.17 עבור שלושת החלקים הנותרים, הצבת אגרופי DCN באותו צינור. מניחים את הצינור לתוך חנקן נוזלי להקפאת הבזק. ייצוג הגודל של כל אגרוף באיור 1E.
19. חלקים שחולצו DCN זכאים לחצי הכדור במוח הקטן. תרחיק את שאר רקמת המוח סביב המוח הקטן בחלקים האלה. השתמש במלקחיים קהים והרים בעדינות את מקטעי קליפת המוח הקטן בחצי הכדור והכניס לצינור המיקרו-פוגה המתאים. קיפאון פלאש.
20. בשני החלקים האחרונים של המלל (תיבה כחולה בהירה, איור1D),הרחיקה את רקמת המוח המקיפה רק את המוח הקטן. בעזרת סכין גילוח, לעשות חתך המפריד בין lobules הקדמיים מן lobules האחורי. החתך צריך להיות רק לאחר היווצרות של lobule 6 ולא צריך לכלול lobule 10(איור 1F).
21. באמצעות מלקחיים קהים, בזהירות למקם את החלקים קליפת המוח הקטן הקדמי ואת החלקים קליפת המוח הקטן האחורי לתוך צינורות microfuge שלהם בהתאמה להקפיא פלאש על ידי השארת הצינורות בחנקן נוזלי במשך 5 דקות. מכאן להמשיך להפקת RNA, או יכול לאחסן את הצינורות ב -80 °C (50 °F).

3. חילוץ RNA

הערה: פרוטוקול זה שונה מפרוטוקול קולד ספרינג הארבור לחילוץ RNA עם TRIzol²⁰. TRIzol solubilizes חומר ביולוגי, מה שמאפשר לחלץ RNA.

1. מניחים את צינורות המיקרו-פוגה בקרח כדי למנוע מהרקמה להפשיר מהר מדי, יש למרוח 150 מיקרו-אל של TRIzol קר בצינור המיקרו-שפך. הומוגניזציה עם עלה מעוקר. ברגע שהרקמה הומוגנית, הזרימו את התמיסה למעלה ולמטה כדי להבטיח שלא נותרה רקמה שלמה. עוד לשבור את כל חתיכות רקמה קטנה על ידי משיכת אותו לתוך מזרק אינסולין כמה פעמים.
2. מוסיפים עוד 350 μL של TRIzol וצינור למעלה ולמטה לערבב ביסודיות. בואו לשבת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
3. הוסף 150 μL של כלורופורם לצינור לנער במרץ ולאחר מכן לתת מנוחה במשך 2-3 דקות. הכלורופורם מפריד את תמיסת הרקמה ההומוגנית לשלבים (רנ"א, DNA וחלבון).
4. צנטריפוגה ב 12,000 x גרם, ב 15°C, במשך 10 דקות. ודא כי כל הצינורות הם באותו כיוון.
5. בזהירות להסיר את הצינורות ולהגדיר את הטמפרטורה של הצנטריפוגה ל 4 מעלות צלזיוס. הסר רק את השלב מימי ברור לתוך צינור חדש (זה RNA), זהיר לא לשבש את interphase אטום (ה- DNA).  השלב הנמוך ביותר יהיה אדום ומכיל חלבון. הפתרון הנותר בצינורות ניתן לשמור או להשליך.
6. הוסף 100% אלכוהול איזופרופיל ביחס 1:2 (אם הוסר 200 ul של שלב מימי, להוסיף 100 μL של אלכוהול איזופרופיל). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה. בואו לנוח בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. אלכוהול איזופרופיל מזרז את הרנ"א מחוץ לפתרון.
7. צנטריפוגה ב 12,000 x גרם, ב 4°C, במשך 10 דקות. הקפד למקם את כל הצינורות באותו כיוון כדי להקל על לדמיין את הכדור. הכדור המתקבל יהיה RNA שחולץ.
8. בזהירות להסיר את הצינורות, להסיר את supernatant עם צינור להיות זהיר לא לשבש את הכדור. הכדור הוא קצת כמו ג'ל ויהיה קשה לראות, אבל צריך להיות מסוגל להעריך איפה הוא מבוסס על הכיוון של הצינורות בצנטריפוגה.
9. לאחר הסרת כל supernatant, להוסיף 500 μL של 75% אתנול, מערבולת לזמן קצר, וצנטריפוגה ב 7500 x גרם, ב 4°C, במשך 5 דקות. האתנול שוטף עוד יותר את הכדור.
10. הסר את supernatant בזהירות, מבלי לשבש את הכדור. השאר כובעים פתוחים כדי לייבש את המדגם. זה בדרך כלל לוקח 5-10 דקות אבל יכול להשתנות בהתאם כמה אתנול נשאר על הכדור. אין להתייבש יתר על המידה.
11. לאחר יבש, respend הכדור במים חינם DNase. הוסף 20 μL לדגימות עבור DCN, ו 30 μL עבור כל האחרים.
12. לאחר resuspended, דגימות ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F) או להמשיך לבדיקות נוספות.

4. תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RTqPCR)

1. לפני שלב זה יהיה צורך DNase לטפל בRNA כדי להסיר כל DNA גנומי, וליצור cDNA ניצול iScript מ BioRad. הקפד לנרמל את הריכוז של RNA לפני ביצוע cDNA. בנוסף, חשוב למטב פריימרים עבור qPCR. בצע את השיטות המתוארות כאן כדי להשלים שלב²¹זה . תיאור קצר של qPCR להלן.
2. פריימרים נרכשים כולם מ-IDT. רצפים קדימה ואחורה נמצאים שניהם באותו צינור מדגם, ומאוחסנים בריכוז של פי 20.
   Rps18 (גן בקרה):
   קדימה – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
   הפוך – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCTCC-3'
   פרבלבומין (חלבון סידן מחייב, תאים מעכבים):
   קדימה – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
   Reverse – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3'
   Kcng4 (תת-unit ערוץ אשלגן):
   Forward – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
   הפוך – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAGCAG-3'
   אלדולאז C (זברין II, המתבטא באופן דיפרנציאלי על פני קליפת המוח הקטן):
   קדימה – 5'-אגאגאקאאאגאטאטאטג-3'
   הפוך – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGTTGGC-3'
3. תנאי qPCR היו כדלקמן. תקופת טרום דגירה, 5 דקות, ב 95 מעלות צלזיוס. תקופת הגברה, 50 מחזורים: 10 דקות ב 95°C, 10 דקות ב 62°C, ו 10 דקות ב 72°C. תקופת עקומת ההיתוך, 5 שניות ב-95°C, דקה אחת ב-65°C, וקצב הרמפה ל-0.07°C/שניה עד טמפרטורת היעד של 97°C. לאחר מכן תקופת קירור במשך 10 דקות עד 40 מעלות צלזיוס.  כל תגובות qPCR בוצעו במשולש וביטוי גנים נותח באמצעות 2^{- ΔΔCt} עם Rps18 כפקד טעינה כדי לנרמל ביטוי גנים. תמצית מוחית בתפזורת שימשה כהפניה.

תוצאות

בניסויים אלה נעשה שימוש בארבעה עכברי בר מסוג נקבה בני 11 שבועות מסוג C57/Black6. עכבר אחד שימש לעריכת ניתוח מוחי מלא המכונה "המוח הקטן בתפזורת" ומאפשר השוואה של רמות RNA באזורים ניתחו לביתור מלא. שלושת העכברים האחרים שימשו לעריכת ניתוח המוח הקטן המתואר בפרוטוקול זה. שימוש בשלושה ...

Discussion

השיטה המתוארת כאן מאפשרת להעריך את ביטוי הגנים הבסיסיים ואת המנגנונים המולקולריים בארבעה אזורי מוח הקטן נפרדים – גרעיני המוח הקטן העמוקים (DCN), קליפת המוח הקדמית של ורמיס (CCaV), קליפת המוח המוח האחורית של הוורמיס (CCPV), ואת קליפת המוח הקטן של חצי הכדור (CCH). היכולת להעריך אזורים אלה בנפרד תרחיב ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 Microcentrifuge tubes	ThermoScietific	3456
100% Isopropyl Alcohol	VWR Life sciences	1106C361
200 ul Pipet tips	GeneMate	P-1237-200
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal	Kent Scientific Corporation	RBMA-200S
Blunt forceps
Chloroform	Macron	220905
Decapitation Scissors
Dissecting Scissors
Ethyl Alcohol	Pharmco	111000200
Glass Slide (for electrophoresis)	BIORAD
Homogenizer	Kimble	6HAZ6
Ice Bucket
Insulin Syringe (.5ml)	BD	329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR	BIORAD	1725037
Micro Spatula
Needle Nose forceps
Petri Dish	Pyrex
Primetime Primer for Aldolase C	IDT	Mm.PT.58>43415246
Primetime Primer for Kcng4	IDT	Mm.PT.56a.9448518
Primetime Primer for Parvalbumin	IDT	Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18	IDT	Mm.PT.58.12109666
Single Edge Rzor Blades	Personna GEM
Sterile, sigle-use pestles	FisherScientific	12141364
TRIzol Reagent	Ambion by Life technologies	15596018
Vascular Scissors