Региональное рассечение мозжечка для молекулярного анализа

Резюме

Различные мозжечковые области были замешаны в том, чтобы играть роль в различных поведенческих выходах, но основные молекулярные механизмы остаются неизвестными. В этой работе описывается метод воспроизводимого и быстрого рассечения коры мозжечка полушарий, передней и задней областей вермиса и глубоких ядер мозжечка с целью исследования молекулярных различий путем выделения РНК и тестирования различий в экспрессии генов.

Аннотация

Мозжечок играет важную роль в нескольких ключевых функциях, включая контроль движения, равновесия, познания, вознаграждения и аффекта. Исследования изображений показывают, что различные мозжечковые области способствуют этим различным функциям. Молекулярные исследования, изучающие региональные различия мозжечка, отстают, поскольку они в основном проводятся на целых экстрактах мозжечка, тем самым маскируя любые различия в конкретных мозжечковых областях. Здесь мы описываем технику воспроизводимого и быстрого рассечения четырех различных мозжечковых областей: глубоких ядер мозжечка (DCN), передней и задней вермальной мозжечковой коры и мозжечковой коры полушарий. Анализ этих различных областей позволяет исследовать молекулярные механизмы, которые могут лежать в основе их уникального вклада в баланс, движение, аффект и познание. Этот метод также может быть использован для изучения различий в патологической восприимчивости этих конкретных областей в различных моделях заболеваний мышей.

Введение

Мозжечок содержит более половины нейронов в мозге и исторически упоминается как центр управления и равновесия в мозге^1. Совсем недавно исследования показали, что мозжечок играет ключевую роль в различных других функциях, включая познание, обработку вознаграждения и влияние^2,3,4,5.

Мозжечок имеет хорошо описанную анатомию: область коры состоит из гранул, Пуркинье и молекулярных слоев. Грануляные клетки образуют грануляный клеточный слой и посылают вход через параллельные волокна в клеточные дендриты Пуркинье молекулярного слоя, которые также получают входные данные от вьющихся волокон, возникших в нижней оливе. Клетки Пуркинье посылают ингибирующие проекции клеткам в глубоких мозжечковых ядрах (DCN), которые служат основным выходом из мозжечка. Выход этого мозжечкового контура дополнительно модулируется активностью ингибирующих интернейронов в коре мозжечка, включая гольджи, звездчатые и корзинчатые клетки^4. Этот мозжечковой функциональный блок распределен по всем долочкам коры мозжечка. Несмотря на эту относительно однородную схему по всему мозжечку, данные из литературы по нейровизуализации человека и исследований пациентов указывают на функциональную гетерогенность мозжечка^6,7.

Кору мозжечка можно разделить на две основные области: среднюю, определенную вермисом, и боковые полушария. Вермис можно далее разделить на переднюю и заднюю дольки. Эти различные области мозжечка были причастны к содействию различному поведению. Паттерны активности, вызванные задачами или без задач, связаны с тем, что передние области вермиса вносят больший вклад в двигательную функцию, в то время как задние вермисы вносят больший вклад в познание^6,7. Вермис также связан с аффектами и эмоциями, в то время как полушария мозжечка способствуют исполнительным, визуально-пространственным, языковым и другим мнемоническим функциям^8. Кроме того, анатомические исследования предоставили доказательства того, что функционально различные мозжечковые области связаны с различными областями коры^9. Картирование симптомов поражения показало, что пациенты с инсультами, затрагивающими передние дольки (распространяющиеся в дольку VI), имели более низкую производительность при выполнении мелкомоторных задач, в то время как пациенты с повреждением областей задней доли и полушарий демонстрировали когнитивный дефицит при отсутствии мозжечкового моторного синдрома^10. Наконец, регионарная мозжечковая патология при заболевании указывает на то, что функционально различные мозжечковые области также по-разному восприимчивы к заболеванию^11,12.

Хотя предварительные данные гораздо менее изучены, они демонстрируют различные сигнатуры экспрессии генов в мозжечковых корковых областях. Экспрессия клеток Пуркинье Зебрина II показывает специфическую для области структуру в вермисе, так что в задних дочках больше положительных клеток Зебрина II и меньше в передних долеках^13. Это также коррелирует с регионально отличной физиологической функцией, поскольку отрицательные клетки Зебрина II Пуркинье демонстрируют более высокую частоту тонического возбуждения, чем клетки Пуркинье, которые являются положительными Зебрином II^14.

В дополнение к коре мозжечка, мозжечок включает глубокие мозжечковые ядра (DCN), которые служат основным выходом для мозжечка. Ядра состоят из медиал (MN), интерпозиции (IN) и боковых ядер (LN). Функциональная визуализация и исследования пациентов продемонстрировали, что DCN также участвует в различных поведенческих действиях^15,но очень немногие исследования изучают изменение экспрессии генов в DCN.

Достижения в области молекулярных методов позволили оценить региональную экспрессию генов в мозге и выявили гетерогенность между и внутри различных областей мозга как в физиологическом, так и в заболевании состояний^16. Такие исследования показывают, что мозжечок отличается от других областей мозга. Например, отношение нейронов к глиальным клеткам инвертируется в мозжечке по сравнению с другими областями мозга^1. Даже в нормальных физиологических условиях экспрессия провоспалительных генов повышается в мозжечке по сравнению с другими областями мозга^17. Молекулярные методы также были очень полезны для выявления путей, которые способствуют патогенезу мозжечковых заболеваний. Например, секвенирование РНК всех экстрактов мозжечка идентифицировало гены, измененные в специфической для клетки Пуркинье трансгенной мышиной модели спиноцеребеллярной атаксии типа 1 (SCA1) по сравнению с их контролем дикого типа. Такие данные выявили ключевые молекулярные пути, лежащие в основе патогенеза в мозжечковых клетках Пуркинье, и помогли идентифицировать потенциальные терапевтические мишени^18. Однако последние исследования показывают, что существуют различия в уязвимости к заболеваниям в мозжечковых областях^11,12,19. Это может указывать на то, что существуют ключевые изменения, происходящие в различных мозжечковых областях, которые могут быть замаскированы или незамечены целыми экстрактами мозжечка. Таким образом, существует необходимость в разработке методов, которые позволят исследователям изучать молекулярные профили в различных мозжечковых областях.

Предлагаемый здесь метод описывает воспроизводимый метод рассечения четырех различных областей мозжечка мыши, чтобы изолировать РНК из этих областей и исследовать региональные различия в экспрессии генов. Схема мозжечка мыши на рисунке 1А выделяет вермис синим цветом, а полушария желтым. В частности, этот метод позволяет выделить четыре области: глубокие ядра мозжечка (DCN) (красные пунктирные коробки на рисунке 1A),мозжечковая кора передней вермисы (CCaV) (темно-синий на рисунке 1A),мозжечковая кора задней вермисы (CCpV) (светло-синяя на рисунке 1A)и мозжечковая кора полушарий (CCH) (желтый на рисунке 1A). Оценивая экспрессию генов этих областей отдельно, можно будет исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе дискретных функций этих различных областей, а также потенциальные различия в их уязвимости при заболевании.

протокол

1. Настройка

1. Соберите необходимое оборудование, включая обезглавленные ножницы, тупые щипцы, ножницы для рассечения, сосудистые ножницы, микропатул, сагиттальную матрицу мозга мыши, лезвия бритвы, наконечники пипетки 200 мкл, стеклянную чашку Петри, стеклянную горку и ведро со льдом. Разложите все оборудование на абсорбирующей прокладке.
2. Поместите чашку Петри, стеклянную пластину и мозговую матрицу на лед.
3. Используя лезвие бритвы под перпендикулярным углом, отрежьте около 5 мм от кончика одного наконечника пипетки 200 мкл. Это делает размер отверстия на конце наконечника шириной около 1 мм. Этого должно быть достаточно, чтобы выбить DCN. Но это также может быть скорректировано по мере необходимости в зависимости от рассечения. Есть много советов, готовых к легкой замене и регулировке.
4. Маркировка микрофьюжных трубок 1,5 мл с идентификацией животных и мозжечковой областью (четыре трубки на животное).
5. Наполните контейнер криосафе жидким азотом, чтобы мгновенно заморозить ткань после экстракции.

2. Извлечение и рассечение мозга

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами комитетов по уходу за животными Университета Миннесоты.

1. Усыпить мышь, используя 5% воздействия CO_2. Как только дыхание прекратится, выполните вывих шейки матки. Обезглавить мышь обезглавливанием ножницами и выбросить тушу в соответствующий сосуд.
2. Сделайте разрез лезвием бритвы вдоль медиальной сагиттальной линии головы, начиная с носа и продолжаясь до конца. Отделите кожу, разделив по обе стороны от средней линии. Используйте лезвие бритвы, чтобы отрезать мышцу с каждой стороны, срезая мимо ушных каналов.
3. Используя рассекающие ножницы, обрежьте любые области спинного мозга, вплоть до того места, где ствол мозга встречается с мозжечком, осторожно, чтобы не повредить мозжечок.
4. Вставьте одну из лопаток сосудистых ножниц в пространство между стволом мозга и позвоночным столбом и разрезайте к ушным каналу, поднимая ножницы, чтобы чисто разрезать кость, но ограничить повреждение ткани.
5. Продолжайте резать вдоль края черепа вверх к обонятельным луковикам, продолжая поднимать вверх, разрезая, чтобы ограничить повреждение мозговой ткани.
6. Используя тупые щипцы, аккуратно отклейте заднюю часть черепа, обнажив заднюю область мозга и мозжечок.
7. Используя тупые щипцы вдоль края черепа, который был только что разрезан, очистите остальную часть черепа вверх и над мозгом. Этот шаг должен удалить большую часть черепной шапки, раскрывая мозг.
8. Обрежьте остальную часть черепа сосудистыми ножницами и тупыми щипцами, очисщая большую часть черепа от верхней части мозга.
9. Используя микропатулку, слегка приподнимите мозг и зачерпните под и скользите вверх, чтобы удалить обонятельные луковицы из оставшегося черепа и отсоединить волокна зрительного тракта. Мозг должен легко освободиться в этот момент.
10. Поместите мозг в чашку Петри, сидящую на льду, и удалите оставшийся череп или другой мусор.
11. Используя микропатулку, аккуратно поместите мозг в мозговой матрикс дорсальной стороной вверх. Потратьте время, чтобы убедиться, что в матрице установлен уровень, особенно в том, что средняя линия попадает в центр матрицы. Эта матрица предназначена для ткани мозга взрослой мыши, ткань молодых или больных животных может лежать ниже в матрице, но все же должна быть возможность достичь воспроизводимых результатов по образцам.
12. Поместите одно лезвие бритвы вдоль сагиттальной средней линии, убедившись, что лезвие проталкивается до самого дна матрицы(рисунок 1B).
13. Поместите другое лезвие бритвы на 1 мм сбоку от первого лезвия(рисунок 1B). Поместите еще две лопасти на 1 мм друг от друга. Конечным результатом должны быть три лезвия, размещенные на одной стороне мозга, все на 1 мм друг от друга. Проделайте то же самое с другой стороной. В общей сложности 7 лезвий будут размещены на 1 мм друг от друга(рисунок 1C).
14. Осторожно возьмите передний и задний концы лезвий бритвы и поднимите прямо из матрицы. Ткань на внешней стороне лезвий бритвы может быть отброшена.
15. Медленно отделяйте одно лезвие бритвы за раз от других, стараясь не повредить участки тканей.
16. Осторожно соскользните с участка ткани с лезвия бритвы на стеклянную горку с помощью микропатку. Всего будет шесть сагиттальных отделов мозга(рисунок 1D).
17. 4 наиболее боковых участка будут иметь видимый DCN (фиолетовая коробка, рисунок 1D). Чтобы изолировать DCN, держите обрезанный наконечник пипетки 200 мкл перпендикулярно над DCN и плотно протолкивайте ткань, раскачиваясь во всех направлениях, чтобы полностью рассечь DCN от окружающих тканей. Поднимите прямо назад вверх, чтобы чисто удалить DCN, и визуально подтвердить наличие ткани в наконечнике.
18. Поместите один палец в верхнюю часть кончика и надавите вниз, заставляя ткань выпячиваться. Поместите наконечник в правильно маркированную микрофьюжную трубку и убедитесь, что тканевый перфоратор помещен в нижнюю часть трубки. Повторите 2.17 для остальных трех секций, поместив перфораторы DCN в одну трубу. Поместите трубку в жидкий азот, чтобы мгновенно заморозить. Представление размера каждого перфоратора на рисунке 1Е.
19. Участки, в которых был извлечен DCN, квалифицируются как полушарие мозжечка. Оттолкните остальную часть мозговой ткани вокруг мозжечка в этих отделах. Используйте тупые щипцы и осторожно подберите эти участки полушария мозжечковой коры и поместите в соответствующую микрофьюжную трубку. Вспышка зависания.
20. Для последних двух вермальных отделов (светло-синяя коробка, рисунок 1D),отталкивайте окружающие ткани мозга, оставляя только мозжечок. Используя лезвие бритвы, сделайте разрез, отделяющий передние дольки от задних долек. Срез должен быть сразу после образования дольки 6 и не должен включать дольку 10(рисунок 1F).
21. Используя тупые щипцы, осторожно поместите передние отделы коры мозжечка и задние отделы коры мозжечка в соответствующие микрофьюжетные трубки и мгновенно заморозьте, оставив трубки в жидком азоте на 5 минут. Отсюда переходить к экстракции РНК или может хранить трубки при -80 °C.

3. Экстракция РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол модифицирован из протокола Колд-Спринг-Харбор для экстракции РНК с помощью TRIzol^20. TRIzol солюбилизирует биологический материал, что позволяет извлекать РНК.

1. Поместите микрофьюжные трубки в лед, чтобы ткань не оттаивания слишком быстро оттаивания, нанесите 150 мкл холодного TRIzol в микрофьюжную трубку. Гомогенизировать стерилизовано пестиком. Как только ткань гомогенизируется, пипетку раствора вверх и вниз, чтобы убедиться, что ткань не осталась неповрежденной. Далее разбейте любые мелкие кусочки ткани, втянув их в инсулиновый шприц несколько раз.
2. Добавьте еще 350 мкл TRIzol и пипетку вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать. Оставьте на 5 минут.
3. Добавьте в пробирку 150 мкл хлороформа и энергично встряхните, а затем дайте отдохнуть в течение 2-3 минут. Хлороформ разделяет гомогенизированный тканевый раствор на фазы (РНК, ДНК и белок).
4. Центрифуга при 12 000 х г, при 15°C, в течение 10 минут. Убедитесь, что все трубки находятся в одинаковой ориентации.
5. Осторожно снимите трубки и установите температуру центрифуги на 4°C. Удаляйте в новую трубку только прозрачную водные фазы (это РНК), стараясь не нарушить непрозрачную интерфазу (ДНК).  Самая низкая фаза будет красной и содержит белок. Оставшийся раствор в пробирках можно сохранить или выбросить.
6. Добавить 100% изопропиловый спирт в соотношении 1:2 (если удалить 200 ul водной фазы, добавить 100 мкл изопропилового спирта). Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Дать отдохнуть при комнатной температуре в течение 10 минут. Изопропиловый спирт высвечивает РНК из раствора.
7. Центрифуга при 12 000 х г, при 4°C, в течение 10 минут. Обязательно поместите все трубки в одну и ту же ориентацию, чтобы было легче визуализировать гранулу. Полученная гранула будет представлять извлеченную РНК.
8. Осторожно удалите трубки, удалите супернатант пипеткой, стараясь не нарушить гранулу. Гранула несколько гелеобразна и ее будет трудно увидеть, но она должна быть в состоянии оценить, где она основана на ориентации трубок в центрифуге.
9. После удаления всего супернатанта добавьте 500 мкл 75% этанола, кратковременно вихрь и центрифугу при 7500 х г, при 4°C, в течение 5 минут. Этанол дополнительно промывает гранулу.
10. Удалите супернатант осторожно, не нарушая гранулу. Оставьте крышки открытыми, чтобы высушить образец. Обычно это занимает 5-10 минут, но может варьироваться в зависимости от того, сколько этанола осталось на грануле. Не пересушивайте.
11. После высыхания повторно суспендировать гранулы в воде, свободной от ДНКазы. Добавьте 20 мкл к образцам для DCN и 30 мкл для всех остальных.
12. После повторного суспендировании образцы могут храниться при -80 °C или приступать к дальнейшим испытаниям.

4. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (RTqPCR)

1. Перед этим шагом необходимо будет обработать ДНКазу РНК для удаления любой геномной ДНК и сгенерировать кДНК с использованием iScript из BioRad. Обязательно нормализуйте концентрацию РНК перед внесения кДНК. Кроме того, важно оптимизировать грунтовки для qPCR. Следуйте описанным здесь методам для выполнения этого шага²¹. Краткое описание qPCR ниже.
2. Все грунтовки приобретаются у IDT. Прямой и обратный последовательности находятся в одной и той же пробирке и хранятся в 20-кратной концентрации.
   Rps18 (контрольный ген):
   Форвард – 5'-CCTGAAGTTCCAGCACAT-3'
   Реверс – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
   Парвальбумин (кальций-связывающий белок, ингибирующие клетки):
   Форвард – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
   Реверс – '5-AGCGTCTTTTTTTCTTTAGCAG-3'
   Kcng4 (субъединь калиевого канала):
   Вперед – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
   Реверс – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
   Альдолаза С (Зебрин II, дифференциально экспрессируемый через кору мозжечка):
   Форвард – 5'-АГАГГАКАААГГГАТААТГЦ-3'
   Реверс – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3'
3. Условия qPCR были следующими. Прединктубационный период, 5 минут, при 95°C. Период усиления, 50 циклов: 10 минут при 95°C, 10 минут при 62°C и 10 минут при 72°C. Период кривой плавления, 5 секунд при 95°C, одна минута при 65°C и установка скорости рампы на уровне 0,07°C/с до целевой температуры 97°C. Затем период охлаждения в течение 10 минут до 40°C.  Все реакции qPCR проводили в трех размерах, а экспрессию генов анализировали с использованием 2^{- ΔΔCt} с Rps18 в качестве контроля нагрузки для нормализации экспрессии генов. Объемный экстракт мозжечка использовался в качестве эталона.

Результаты

Для этих экспериментов использовались четыре одиннадцатинедельные самки диких мышей типа C57/Black6. Одна мышь использовалась для проведения полного рассечения мозжечка, которое называется «объемным мозжечком» и позволяло сравнивать уровни РНК в рассеченных областях с...

Обсуждение

Метод, описанный здесь, позволяет оценить экспрессию основных генов и молекулярные механизмы в четырех различных мозжечковых областях - глубоких ядрах мозжечка (DCN), передней мозжечковой коре вермиса (CCaV), задней мозжечковой коре вермиса (CCpV) и коре мозжечка полушарий (CCH). Возможность оц?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 Microcentrifuge tubes	ThermoScietific	3456
100% Isopropyl Alcohol	VWR Life sciences	1106C361
200 ul Pipet tips	GeneMate	P-1237-200
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal	Kent Scientific Corporation	RBMA-200S
Blunt forceps
Chloroform	Macron	220905
Decapitation Scissors
Dissecting Scissors
Ethyl Alcohol	Pharmco	111000200
Glass Slide (for electrophoresis)	BIORAD
Homogenizer	Kimble	6HAZ6
Ice Bucket
Insulin Syringe (.5ml)	BD	329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR	BIORAD	1725037
Micro Spatula
Needle Nose forceps
Petri Dish	Pyrex
Primetime Primer for Aldolase C	IDT	Mm.PT.58>43415246
Primetime Primer for Kcng4	IDT	Mm.PT.56a.9448518
Primetime Primer for Parvalbumin	IDT	Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18	IDT	Mm.PT.58.12109666
Single Edge Rzor Blades	Personna GEM
Sterile, sigle-use pestles	FisherScientific	12141364
TRIzol Reagent	Ambion by Life technologies	15596018
Vascular Scissors