分子解析のための小脳局所解剖

要約

異なる小脳領域は、異なる行動出力に役割を果たすのに関与してきましたが、根本的な分子メカニズムは不明のままです。本研究では、RNAを単離し、遺伝子発現の違いを検査することによって分子の違いを探るために、半球の小脳皮質、前部および後部の小脳部、および深い小脳核を再現的かつ迅速に解剖する方法を説明する。

要約

小脳は、動きの制御を含むいくつかの重要な機能で重要な役割を果たしています, バランス, 認知, 報酬, そして、影響.イメージング研究は、異なる小脳領域がこれらの異なる機能に寄与することを示している。局所的小脳の違いを調べる分子研究は、主に小脳エキス全体で行われるため、特定の小脳領域にわたる区別を隠すため、遅れている。ここでは、深い小脳核(DCN)、前および後の脊髄小脳皮質、半球の小脳皮質の4つの異なる小脳領域を再現し、迅速に解剖する技術について説明します。これらの異なる領域を解剖することは、バランス、動き、影響および認知への彼らのユニークな貢献の根源となり得る分子メカニズムの探求を可能にする。この技術はまた、様々なマウス疾患モデルにおけるこれらの特定領域の病理学的感受性の違いを探求するために使用され得る。

概要

小脳は脳内のニューロンの半分以上を含み、歴史的に脳内の運動制御とバランスセンターと呼ばれています¹.最近では、小脳が認知、報酬処理、および^{2、3、4、5}に影響を及ぼすなど、他のさまざまな機能において重要な役割^を果たしていることを実証した。

小脳は、よく記述された解剖学を有する:皮質領域は顆粒、プルキンジェ、および分子層で構成される。顆粒細胞は、顆粒細胞層を形成し、分子層のプルキンエ細胞デンドライトに平行繊維を介して入力を送信し、劣ったオリーブに由来する上昇繊維からの入力も受け取る。プルキンエ細胞は、小脳からの主な出力として機能する深小脳核(DCN)内の細胞に抑制性の投影を送る。この小脳回路の出力は、ゴルジ、ステレート、およびバスケット細胞⁴を含む小脳皮質における阻害性相互作用ニューロンの活性によってさらに変調される。この小脳機能ユニットは、小脳皮質のすべての小葉全体に分布しています。小脳を横切るこの比較的均一な回路にもかかわらず、ヒトの神経イメージング文献および患者研究からの証拠は、小脳^6,7の機能的不均一性を示す。

小脳皮質は、正中線定義のめまいと横半球の2つの主要な領域に分けることができます。ベルミはさらに前葉と後部小葉に分けることができます。小脳のこれらの異なる領域は、異なる行動に寄与することに関与している。タスク誘発またはタスクフリーの活動パターンは、脊椎の前領域が運動機能に多く寄与し、後方のバーミが認知に多くを寄与することを含む^6、7。バーミは影響や感情とも連動し、小脳半球はエグゼクティブ、視覚空間、言語、その他のニーモニック機能⁸に寄与する。さらに、解剖学的研究は、機能的に異なる小脳領域が異なる皮質領域と接続しているという証拠を提供した^9.病変症状のマッピングは、前葉に影響を与える脳卒中(小葉VIに及ぶ)を有する患者は細かい運動タスクでパフォーマンスが悪く、後葉領域および半球に損傷を与えた患者は小脳運動症候群¹⁰の不在時に認知障害を示すことを明らかにした。最後に、疾患における局所小脳病理は、機能的に異なる小脳領域も疾患^11,12に対して異なる感受性を示す。

あまり探求されているが、予備的な証拠は、小脳皮質領域全体で明確な遺伝子発現シグネチャを示している。ゼブリンIIのプルキンエ細胞発現は、後葉小葉にゼブリンII陽性細胞が多く、前葉¹³に少なくなるようなめまいにおける領域特異的なパターニングを示す。これはまた、ゼブリンII陰性プルキンイェ細胞がゼブリンII陽性¹⁴であるプルキンエ細胞よりも高いトニック焼成の頻度を示すように、局所的に異なる生理機能と相関する。

小脳は小脳の皮質に加えて、小脳の主要な出力として機能する深い小脳核(DCN)を含む。核は、内側(MN)、介在(IN)、および横核(LN)で構成されています。機能的イメージングおよび患者研究は、DCNが様々な行動¹⁵にも関与することを実証しているが、DCNの遺伝子発現変化を調べる研究はほとんどない。

分子技術の進歩により、脳内の領域遺伝子発現を評価することが可能となり、生理学的および疾患状態¹⁶の両方において異なる脳領域の異種性を発見した。このような研究は、小脳が他の脳領域とは異なっていることを意味します。例えば、神経細胞とグリア細胞の比率は、他の脳領域¹と比較して小脳で反転する。正常な生理学的条件においても、他の脳領域¹⁷と比較して小脳において炎症促進性遺伝子の発現がアップレギュレートされる。分子技術は、小脳病の病因に寄与する経路を同定する上でも非常に有用であった。例えば、小脳全体のRNAシーケンシングは、スピノセレラー失調症のプルキンエ細胞特異的トランスジェニックマウスモデルで改変された遺伝子を同定し、その野生型制御と比較した。このような証拠は、小脳プルキンエ細胞における病因の根底にある主要な分子経路を明らかにし、潜在的な治療標的¹⁸を同定するのに役立った。しかし、最近の研究では、小脳領域^11、12、19の疾患に対する脆弱性に違いがあることを示唆している。これは、異なる小脳領域で重要な変化が起きており、小脳抽出物全体でマスクまたは検出されないことを示している可能性があります。したがって、研究者が異なる小脳領域の分子プロファイルを調べることができるようにする技術を開発する必要があります。

ここで提案される技術は、それらの領域からRNAを分離し、遺伝子発現の地域差を探るためにマウス小脳の4つの異なる領域を解剖する再現可能な方法を記述する。 図1A のマウス小脳の模式図は、青で朱色を、半球を黄色で強調しています。具体的には、この技術は、深い小脳核(DCN)( 図1Aの赤点点のボックス)、前立体(CCaV)の小脳皮質( 図1Aの濃い青色)、後部バーミ(CCpV)の小脳皮質( 図1Aの水色)、および小脳皮質(図 1Aの淡色)の4つの領域を単離することを可能にする。これらの領域の遺伝子発現を個別に評価することにより、これらの異なる領域の離散機能の基礎となる分子メカニズムと、疾患における脆弱性の潜在的な違いを調査することが可能になります。

プロトコル

1. セットアップ

1. 切断ハサミ、鈍い鉗子、解剖はさみ、血管はさみ、マイクロスタッラ、矢状マウス脳マトリックス、カミソリの刃、200 μLピペット先端、ガラスシャー、ガラススライド、およびアイスバケツを含む必要な機器を収集します。吸収パッド上のすべての機器をレイアウトします。
2. シャーレ、ガラス板、脳マトリックスを氷の上に置きます。
3. カミソリの刃を垂直な角度で使用し、1つの200 μLピペットチップの先端から約5mmを切ります。これにより、先端の端部の開口部のサイズは約1mm幅になります。これは DCN をパンチアウトするのに十分なはずです。しかし、これはまた、解剖に応じて必要に応じて調整することができます。簡単に交換と調整のための準備ができて多くのヒントを持っています。
4. 動物の同一証明および小脳領域(動物ごとの4つの管)が付いているラベル1.5 mLマイクロフュージ管。
5. 抽出後に凍結組織をフラッシュするために液体窒素で凍結安全な容器を充填します。

2. 脳の抽出と解剖

すべての実験は、ミネソタ大学動物ケア委員会のガイドラインに従って行われました。

1. 5%の_CO2 露光を使用してマウスを安楽死させます。呼吸が止まったら、子宮頸部脱臼を行う。切断ハサミでマウスの首を切り落とし、適切なレセプタクルに死体を捨てます。
2. 鼻から始まり、戻って続ける頭の内側矢状ラインに沿ってカミソリの刃で切開を行います。皮膚を分離し、正中線の両側に別れる。カミソリの刃を使用して両側の筋肉を切り取り、外耳道を通り過ぎます。
3. 解剖ハサミを使用して、脳幹が小脳と出会う場所まで、脊髄領域をトリミングし、小脳に損傷を与えないように注意する。
4. 脳幹と椎骨柱の間のスペースに血管シザーブレードの1つを挿入し、外耳道に向かって切断し、はさみを持ち上げて骨をきれいにカットしますが、組織への損傷を制限します。
5. 頭蓋骨の端に沿って嗅球に向かって切断し続け、脳組織への損傷を制限するために切断しながら持ち上げ続ける。
6. 鈍い鉗子を使用して、脳と小脳の後部領域を明らかにする頭蓋骨の後ろを静かに剥がします。
7. ちょうど切断された頭蓋骨の端に沿って鈍い鉗子を使用して、頭蓋骨の残りの部分を脳の上と上に剥がします。このステップは、頭蓋骨のキャップの大部分を削除する必要があります, 脳を明らかに.
8. 頭蓋骨の残りの部分を血管はさみと鈍い鉗子でトリミングし、頭蓋骨のほとんどを脳の上から取り除きます。
9. マイクロスパチュラを使用して、脳をわずかに持ち上げ、下にすくい上げ、スライドして残りの頭蓋骨から嗅球を取り除き、光路繊維を切断します。脳は、この時点で簡単に自由に来る必要があります。
10. 氷の上に座っているシャーレに脳を置き、残りの頭蓋骨や他の破片を取り除きます。
11. マイクロスパチュラを使用して、脳を優しく脳のマトリックスに置き、後側を上にします。行列の中線が中心になるように、マトリックスのレベルが設定されていることを確認する時間をとってください。このマトリックスは、成人マウスの脳組織のために設計されています, 若いまたは病気の動物からの組織は、マトリックスの下に休む可能性がありますが、それでも、サンプル全体で再現可能な結果を達成することが可能である必要があります.
12. 矢状の正中線に沿って1つのカミソリの刃を置き、ブレードがマトリックスの底まで押し出されることを確認します(図1B)。
13. 1つ目の刃の側面に別のカミソリの刃を1mm置く(図1B)。さらに2枚の刃を1mm離して配置します。最終的な結果は、脳の片側に配置された3つのブレード、すべて1mm離れている必要があります。反対側にも同じことをしてください。合計で、7枚のブレードが1mm離れて配置されます(図1C)。
14. 慎重に、カミソリの刃の前部と後端をつかみ、マトリックスからまっすぐ持ち上げます。カミソリの刃の外側のティッシュは捨てることができる。
15. ゆっくりと、一度に1つのカミソリの刃を他の刃から分離し、組織の切片を損傷しないように注意する。
16. カミソリの刃から慎重に組織セクションをスライドさせ、マイクロスパチュラでガラススライドにスライドさせます。合計で6つの矢状脳セクションがあります(図1D)。
17. 4つの最も横のセクションはDCNを表示する(紫の箱、 図1D)。DCNを分離するには、トリミングされた200 μLピペットチップをDCNの上に垂直に保持し、組織をしっかりと押し下げ、すべての方向に揺れ動き、DCNを周囲の組織から完全に解剖します。まっすぐに持ち上げてDCNをきれいに取り除き、先端に組織の存在を視覚的に確認します。
18. 先端の上部に1本の指を置いて押し下げ、組織が膨らみます。チップを正しくラベル付けされたマイクロフュージチューブに入れ、ティッシュパンチがチューブの底に置かれていることを確認します。残りの 3 つのセクションに対して 2.17 を繰り返し、同じチューブに DCN パンチを配置します。チューブを液体窒素に入れ、フリーズします。 図1Eでの各パンチのサイズの表現。
19. DCNを抽出したセクションは、小脳半球として適格です。これらのセクションで小脳の周りの脳組織の残りの部分を押しのけます.鈍い鉗子を使用し、穏やかにこれらの半球小脳皮質セクションをピックアップし、それぞれのマイクロフュージチューブに配置します。フラッシュフリーズ。
20. 最後の2つのバーマルセクション(水色のボックス、 図1D)については、小脳だけを残して周囲の脳組織を押し出します。カミソリの刃を使用して、後部小葉から前葉を分離するカットを行います。カットは、小葉6の形成直後にあるべきであり、小葉10(図1F)を含んではなりません。
21. 鈍い鉗子を使用して、慎重に前小脳皮質セクションと後小脳皮質セクションをそれぞれのマイクロフュージチューブに入れ、チューブを液体窒素に5分間放置してフラッシュフリーズします。ここからRNA抽出に進み、チューブを−80°Cで保存してもよい。

3. RNA抽出

注:このプロトコルは、TRIzol²⁰を使用したRNA抽出のためのコールドスプリングハーバープロトコルから変更されています。TRIzolは生体物質を可溶化し、RNAを抽出することを可能にします。

1. ミクロフュージチューブを氷の中に入れ、組織が解凍しすぎないようにし、マイクロフュージチューブに150 μLのコールドTRIzolを塗布します。殺菌された害虫で均質化する。組織が均質化されたら、溶液を上下にパイプして、残りの組織がそのままにならないようにします。さらに、インスリン注射器に数回引き上げて小さな組織片を分解します。
2. TRIzolを350μL追加し、上下にパイプを入れて完全に混合します。部屋の温度に5分間座りましょう。
3. 150 μLのクロロホルムをチューブに加え、激しく振ってから2~3分ほど休ませます。クロロホルムは、均質化された組織溶液を相(RNA、DNA、タンパク質)に分離します。
4. 12,000 x gで遠心分離機, 15°Cで, 10分間.すべてのチューブが同じ向きであることを確認します。
5. 慎重にチューブを取り外し、遠心分離機の温度を4°Cに設定します。透明な水相のみを新しいチューブ(これはRNA)に取り出し、不透明なインターフェーズ(DNA)を破壊しないように注意してください。 最も低い相は赤で、タンパク質が含まれています。チューブ内の残りの溶液は保存または廃棄することができます。
6. 1:2比で100%イソプロピルアルコールを加えます(水相の200ulを除去した場合は、100μLのイソプロピルアルコールを加えます)。上下にピペットを入れ、十分に混ぜます。室温で10分間休ませてください。イソプロピルアルコールは溶液からRNAを沈殿させる。
7. 遠心分離機は12,000 x gで、4°Cで、10分間。ペレットを見やすくするために、すべてのチューブを同じ向きに配置してください。得られたペレットは、抽出されたRNAになります。
8. 慎重にチューブを取り外し、ペレットを破壊しないように注意してパイプで上清を除去します。ペレットはゲル状で、見えにくくなりますが、遠心分離機のチューブの向きに基づいてどこにあるかを推定できるはずです。
9. 上清をすべて取り除いた後、500 μLの75%エタノール、渦、7500 x gの遠心分離機を4°Cで5分間加えます。エタノールはさらにペレットを打ち上げる。
10. ペレットを破壊することなく、上清を慎重に取り除きます。キャップを開けてサンプルを乾燥させます。これは通常5〜10分かかりますが、ペレットに残されたエタノールの量によって異なる場合があります。乾燥し過ぎないでください。
11. 乾燥したら、DNaseフリーウォーターのペレットを再び懸濁します。DCNのサンプルには20 μL、他のサンプルには30 μLを加えます。
12. 再懸濁後、サンプルは-80°Cで保存するか、さらなる試験に進むことができます。

4. リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RTqPCR)

1. このステップの前に、DNaseはRNAを治療してゲノムDNAを除去し、BioRadからiScriptを利用してcDNAを生成する必要があります。必ず、cDNAを作る前にRNAの濃度を正常化してください。さらに、qPCR用のプライマーを最適化することが重要です。ここで説明する方法に従って、この手順²¹を完了します。以下の qPCR について簡単に説明します。
2. プライマーはすべてIDTから購入されます。順方向および逆配列は、両方とも同じサンプルチューブ内にあり、20倍の濃度で保存されます。
   Rps18(コントロール遺伝子):
   フォワード - 5'-CCTGAGAGTTCCAGCACAT-3'
   リバース - 5'-アカカカガガカタットクッチ-3'
   パルアルブミン(カルシウム結合タンパク質、阻害細胞):
   フォワード - '5-ATGAGGTGAAGGTTCC-3'
   逆 – '5-AGCGTTTGtTTTTタグカグ-3'
   Kcng4 (カリウムチャネルサブユニット):
   フォワード - 5'-CTCTTTCCTGGTCAGTGA-3'
   逆 – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
   アルドラーゼC(ゼブリンII、小脳皮質全体で差し合って発現):
   フォワード - 5'-アガガカアガガガタガトGCTG-3'
   リバース - 5'-TCAGTAGGCATGGTGGC-3'
3. qPCR条件は以下の通りであった。プレインキュベーション期間、5分、95°Cで。増幅期間、50サイクル:95°Cで10分、62°Cで10分、72°Cで10分。融解曲線周期、95°Cで5秒、65°Cで1分、ランプレートを97°Cの目標温度まで0.07°C/秒に設定します。その後、10分から40°Cの冷却期間。 全てのqPCR反応を三重で行い、遺伝子発現を正常化するための負荷制御として^2-ΔΔCtをRps18で解析した。 バルク小脳抽出物を基準として使用した。

結果

これらの実験では、生後11週齢の雌野生型C57/Black6マウス4匹を使用した。1つのマウスは、「バルク小脳」と呼ばれる完全な小脳解離を行うために使用され、解剖された領域のRNAレベルを完全解剖と比較することを可能にした。他の3匹のマウスを用い、このプロトコルに記載された小脳解剖を行った。3匹のマウスを使用することで、RNAのレベルで検出された傾向がマウ...

ディスカッション

ここで説明する方法は、4つの異なる小脳領域内の基礎となる遺伝子発現および分子メカニズムを評価することを可能にする - 深い小脳核(DCN)、脊椎の前小脳皮質(CCaV)、ベルミの後小脳皮質(CCpV)、および半球の小脳皮質(CCH)。これらの領域を別々に評価する能力は、特定の小脳領域の不均一性に関する我々の知識を拡大し、おそらく様々な行動への貢献に光を当てる。

完全...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 Microcentrifuge tubes	ThermoScietific	3456
100% Isopropyl Alcohol	VWR Life sciences	1106C361
200 ul Pipet tips	GeneMate	P-1237-200
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal	Kent Scientific Corporation	RBMA-200S
Blunt forceps
Chloroform	Macron	220905
Decapitation Scissors
Dissecting Scissors
Ethyl Alcohol	Pharmco	111000200
Glass Slide (for electrophoresis)	BIORAD
Homogenizer	Kimble	6HAZ6
Ice Bucket
Insulin Syringe (.5ml)	BD	329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR	BIORAD	1725037
Micro Spatula
Needle Nose forceps
Petri Dish	Pyrex
Primetime Primer for Aldolase C	IDT	Mm.PT.58>43415246
Primetime Primer for Kcng4	IDT	Mm.PT.56a.9448518
Primetime Primer for Parvalbumin	IDT	Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18	IDT	Mm.PT.58.12109666
Single Edge Rzor Blades	Personna GEM
Sterile, sigle-use pestles	FisherScientific	12141364
TRIzol Reagent	Ambion by Life technologies	15596018
Vascular Scissors