分子解析のための小脳局所解剖

要約

異なる小脳領域は、異なる行動出力に役割を果たすのに関与してきましたが、根本的な分子メカニズムは不明のままです。本研究では、RNAを単離し、遺伝子発現の違いを検査することによって分子の違いを探るために、半球の小脳皮質、前部および後部の小脳部、および深い小脳核を再現的かつ迅速に解剖する方法を説明する。

要約

小脳は、動きの制御を含むいくつかの重要な機能で重要な役割を果たしています, バランス, 認知, 報酬, そして、影響.イメージング研究は、異なる小脳領域がこれらの異なる機能に寄与することを示している。局所的小脳の違いを調べる分子研究は、主に小脳エキス全体で行われるため、特定の小脳領域にわたる区別を隠すため、遅れている。ここでは、深い小脳核(DCN)、前および後の脊髄小脳皮質、半球の小脳皮質の4つの異なる小脳領域を再現し、迅速に解剖する技術について説明します。これらの異なる領域を解剖することは、バランス、動き、影響および認知への彼らのユニークな貢献の根源となり得る分子メカニズムの探求を可能にする。この技術はまた、様々なマウス疾患モデルにおけるこれらの特定領域の病理学的感受性の違いを探求するために使用され得る。

概要

小脳は脳内のニューロンの半分以上を含み、歴史的に脳内の運動制御とバランスセンターと呼ばれています¹.最近では、小脳が認知、報酬処理、および^{2、3、4、5}に影響を及ぼすなど、他のさまざまな機能において重要な役割^を果たしていることを実証した。

小脳は、よく記述された解剖学を有する:皮質領域は顆粒、プルキンジェ、および分子層で構成される。顆粒細胞は、顆粒細胞層を形成し、分子層のプルキンエ細胞デンドライトに平行繊維を介して入力を送信し、劣ったオリーブに由来する上昇繊維からの入力も受け取る。プルキンエ細胞は、小脳からの主な出力として機能する深小脳核(DCN)内の細胞に抑制性の投影を送る。この小脳回路の出力は、ゴルジ、ステレート、およびバスケット細胞⁴を含む小脳皮質における阻害性相互作用ニューロンの活性によってさらに変調される。この小脳機能ユニットは、小脳皮質のすべての小葉全体に分布しています。小脳を横切るこの比較的均一な回路にもかかわらず、ヒトの神経イメージング文献および患者研究からの証拠は、小脳

プロトコル

1. セットアップ

1. 切断ハサミ、鈍い鉗子、解剖はさみ、血管はさみ、マイクロスタッラ、矢状マウス脳マトリックス、カミソリの刃、200 μLピペット先端、ガラスシャー、ガラススライド、およびアイスバケツを含む必要な機器を収集します。吸収パッド上のすべての機器をレイアウトします。
2. シャーレ、ガラス板、脳マトリックスを氷の上に置きます。
3. カミソリの刃を垂直な角度で使用し、1つの200 μLピペットチップの先端から約5mmを切ります。これにより、先端の端部の開口部のサイズは約1mm幅になります。これは DCN をパンチアウトするのに十分なはずです。しかし、これはまた、解剖に応じて必要に応じて調整することができます。簡単に交換と調整のための準備ができて多くのヒントを持っています。
4. 動物の同一証明および小脳領域(動物ごとの4つの管)が付いているラベル1.5 mLマイクロフュージ管。
5. 抽出後に凍結組織をフラッシュするために液体窒素で凍結安全な容器を充填します。

2. 脳の抽出と解剖

すべての実験は、ミネソタ大学動物ケア委員会のガイドラインに従って行われました。

1. 5%の_CO2 露光を使用してマウスを安楽死させます。呼吸が....

結果

これらの実験では、生後11週齢の雌野生型C57/Black6マウス4匹を使用した。1つのマウスは、「バルク小脳」と呼ばれる完全な小脳解離を行うために使用され、解剖された領域のRNAレベルを完全解剖と比較することを可能にした。他の3匹のマウスを用い、このプロトコルに記載された小脳解剖を行った。3匹のマウスを使用することで、RNAのレベルで検出された傾向がマウ.......

ディスカッション

ここで説明する方法は、4つの異なる小脳領域内の基礎となる遺伝子発現および分子メカニズムを評価することを可能にする - 深い小脳核(DCN)、脊椎の前小脳皮質(CCaV)、ベルミの後小脳皮質(CCpV)、および半球の小脳皮質(CCH)。これらの領域を別々に評価する能力は、特定の小脳領域の不均一性に関する我々の知識を拡大し、おそらく様々な行動への貢献に光を当てる。

完全.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 Microcentrifuge tubes	ThermoScietific	3456
100% Isopropyl Alcohol	VWR Life sciences	1106C361
200 ul Pipet tips	GeneMate	P-1237-200
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal	Kent Scientific Corporation	RBMA-200S
Blunt forceps
Chloroform	Macron	220905
Decapitation Scissors
Dissecting Scissors
Ethyl Alcohol	Pharmco	111000200
Glass Slide (for electrophoresis)	BIORAD
Homogenizer	Kimble	6HAZ6
Ice Bucket
Insulin Syringe (.5ml)	BD	329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR	BIORAD	1725037
Micro Spatula
Needle Nose forceps
Petri Dish	Pyrex
Primetime Primer for Aldolase C	IDT	Mm.PT.58>43415246
Primetime Primer for Kcng4	IDT	Mm.PT.56a.9448518
Primetime Primer for Parvalbumin	IDT	Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18	IDT	Mm.PT.58.12109666
Single Edge Rzor Blades	Personna GEM
Sterile, sigle-use pestles	FisherScientific	12141364
TRIzol Reagent	Ambion by Life technologies	15596018
Vascular Scissors