Moleküler Analiz için Serebellar Bölgesel Diseksiyon

Özet

Farklı serebellar bölgelerin farklı davranışsal çıktılarda rol oynadığı belirtilmiştir, ancak alttaki moleküler mekanizmalar bilinmemektedir. Bu çalışma, RNA'yı izole ederek ve gen ifadesindeki farklılıkları test ederek moleküler farklılıkları araştırmak için yarımkürelerin serebellar korteksini, vermisin ön ve arka bölgelerini ve derin serebellar çekirdekleri tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama yöntemini açıklar.

Özet

Serebellum, hareket kontrolü, denge, biliş, ödül ve etki dahil olmak üzere çeşitli temel işlevlerde önemli bir rol oynar. Görüntüleme çalışmaları farklı serebellar bölgelerin bu farklı fonksiyonlara katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bölgesel serebellar farklılıkları inceleyen moleküler çalışmalar, çoğunlukla serebellar özlerin tamamında yapıldığı için geride kalmaktadır ve böylece belirli serebellar bölgelerdeki ayrımları maskelemektedir. Burada dört farklı serebellar bölgeyi tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama tekniğini açıklıyoruz: derin serebellar çekirdek (DCN), ön ve arka vermal serebellar korteks ve yarımkürelerin serebellar korteksi. Bu farklı bölgelerin diseksiyonunun, denge, hareket, etki ve bilişe benzersiz katkılarının altında yatan moleküler mekanizmaların araştırılmasına izin verir. Bu teknik, çeşitli fare hastalığı modellerinde bu belirli bölgelerin patolojik duyarlılığındaki farklılıkları araştırmak için de kullanılabilir.

Giriş

Beyincik beyindeki nöronların yarısından fazlasını içerir ve tarihsel olarak beyinde motor kontrol ve denge merkezi olarak adlandırılır¹. Daha yakın zamanlarda, çalışmalar serebellumun biliş, ödül işleme dahil olmak üzere diğer çeşitli işlevlerde kilit bir rol oynadığını ve 2 , 3^,4,5'i etkilediğini^{göstermiştir.}

Beyincik iyi tanımlanmış anatomiye sahiptir: korteks bölgesi granül, Purkinje ve moleküler katmanlardan oluşur. Granül hücreler granül hücre tabakasını oluşturur ve paralel lifler aracılığıyla moleküler tabakanın Purkinje hücre dendritlerine giriş gönderir ve bu da alt zeytinden kaynaklanan tırmanma liflerinden giriş alır. Purkinje hücreleri, beyincikten ana çıktı görevi gören derin serebellar çekirdekteki (DCN) hücrelere inhibitör projeksiyonlar gönderir. Bu serebellar devrenin çıkışı, Golgi, stellat ve sepet hücreleri de dahil olmak üzere serebellar korteksteki inhibitör internöronların aktivitesi ile daha da modüle edilir⁴. Bu serebellar fonksiyonel ünite serebellar korteksin tüm lobüllerine dağılmıştır. Beyincik boyunca bu nispeten düzgün devreye rağmen, insan nörogörüntüleme literatüründen ve hasta çalışmalarından elde edilen kanıtlar beyincik^6,7'ninfonksiyonel heterojenliğini göstermektedir.

Serebellar korteks iki ana bölgeye ayrılabilir: orta çizgi tanımlı vermis ve lateral yarımküreler. Vermis daha da ön ve arka lobüllere ayrılabilir. Beyinciklerin bu farklı bölgeleri farklı davranışlara katkıda bulunmakla suçlanmıştır. Görev çağrışan veya görevsiz aktivite kalıpları, vermis'in ön bölgelerinin motor fonksiyona daha fazla katkıda bulunduğunu, posterior vermis'in ise biliş^6,7'yedaha fazla katkıda bulunduğunu ortaya çıkardı. Vermis ayrıca etki ve duygularla bağlantılıdır, serebellar yarımküreler yürütme, görsel-mekansal, dil ve diğer anımsatıcı işlevlere katkıda bulunur⁸. Ek olarak, anatomik çalışmalar fonksiyonel olarak farklı serebellar bölgelerin farklı kortikal bölgelerle bağlantılı olduğuna dair kanıtlar sağlamıştır⁹. Lezyon semptom haritalaması, ön lobları etkileyen inmeleri olan hastaların (lob VI'ya kadar uzanan) ince motor görevlerde daha düşük performansa sahip olduğunu, arka lob bölgelerinde ve yarımkürelerde hasarı olan hastaların serebellar motor sendromunun yokluğunda bilişsel eksiklikler sergilediğini ortaya koydu¹⁰. Son olarak, hastalıkta bölgesel serebellar patoloji, fonksiyonel olarak farklı serebellar bölgelerin de hastalığa farklı şekilde duyarlı olduğunu gösterir^11,12.

Çok daha az araştırılsa da, ön kanıtlar serebellar kortikal bölgelerde belirgin gen ekspresyon imzaları göstermektedir. Zebrin II'nin Purkinje hücre ifadesi, vermiste bölgeye özgü desenleme gösterir, böylece arka lobüllerde daha fazla Zebrin II pozitif hücre ve ön lobüllerde daha^{azdır 13}. Bu aynı zamanda Zebrin II negatif Purkinje hücreleri Zebrin II pozitif¹⁴olan Purkinje hücrelerinden daha yüksek tonik ateşleme sıklığı gösterdiğinden bölgesel olarak farklı fizyolojik işlevle de ilişkilidir.

Serebellar kortekse ek olarak, serebellum, beyincik için birincil çıktı görevi gören derin serebellar çekirdeği (DCN) içerir. Çekirdekler medial (MN), interposed (IN) ve lateral çekirdeklerden (LN) oluşur. Fonksiyonel görüntüleme ve hasta çalışmaları, DCN'nin çeşitli davranışlara da katıldığını göstermiştir¹⁵, ancak çok az çalışma DCN'deki gen ekspresyon değişimini inceler.

Moleküler tekniklerdeki gelişmeler beyindeki bölgesel gen ekspresyonun değerlendirilmesini mümkün kıldı ve hem fizyolojik hem de hastalık durumlarında farklı beyin bölgelerinde ve içinde heterojenliği ortaya çıkardı¹⁶. Bu tür çalışmalar, beyinciğerinin diğer beyin bölgelerinden farklı olduğunu ima eder. Örneğin, nöronların glial hücrelere oranı beyincikte diğer beyin bölgelerine göre ters çevrilmiş¹. Normal fizyolojik koşullarda bile, proinflamatuar genlerin ekspresyonu beyincikte diğer beyin bölgelerine göre artmaktadır¹⁷. Moleküler teknikler, serebellar hastalıkların patogenezine katkıda bulunan yolların tanımlanmasında da çok yararlı olmuştur. Örneğin, tüm serebellar özlerin RNA dizilimi, vahşi tip kontrollerine kıyasla spinocerebellar ataksi tip 1'in (SCA1) Purkinje hücresine özgü transgenik fare modelinde değiştirilen genleri tanımladı. Bu tür kanıtlar, serebellar Purkinje hücrelerinde patogenezin altında kalan temel moleküler yolları ortaya çıkarmıştır ve potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olmuştur¹⁸. Bununla birlikte, son çalışmalar serebellar bölgelerde hastalıklara karşı savunmasızlıkta farklılıklar olduğunu göstermektedir^11,12,19. Bu, tüm serebellar özlerle maskelenmiş veya tespit edilmemiş olabilecek farklı serebellar bölgelerde meydana gelen önemli değişiklikler olduğunu gösterebilir. Bu nedenle, araştırmacıların farklı serebellar bölgelerdeki moleküler profilleri incelemelerini sağlayan teknikler geliştirmeye ihtiyaç vardır.

Burada önerilen teknik, RNA'yı bu bölgelerden izole etmek ve gen ifadesindeki bölgesel farklılıkları araştırmak için fare beyinciğinin dört farklı bölgesini parçalamak için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklar. Şekil 1A'daki fare beyinciliğinin şeması, vermis'i mavi ve yarımküreleri sarı renkle vurgular. Özellikle, Bu teknik dört bölgenin izole olmasını mümkün kılar: derin serebellar çekirdek (DCN) (Şekil 1A'dakikırmızı noktalı kutular), ön vermis (CCaV) serebellar korteksi (koyu mavi inç) Şekil 1A), arka vermis (CCpV) serebellar korteksi (Şekil 1A'daaçık mavi) ve yarımkürelerin serebeller korteksi (CCH) (Şekil 1A'dasarı). Bu bölgelerin gen ekspresyonunun ayrı ayrı değerlendirilmesi ile bu farklı bölgelerin ayrık fonksiyonlarının altında kalan moleküler mekanizmaların yanı sıra hastalıktaki kırılganlıklarındaki potansiyel farklılıkların araştırılması mümkün olacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Kurulum

1. Kafa kesme makası, künt forseps, diseksiyon makası, vasküler makas, mikrospatula, sagittal fare beyin matrisi, jilet, 200 μL pipet ucu, cam petri kabı, cam kaydırak ve buz kovası dahil olmak üzere gerekli ekipmanları toplayın. Tüm ekipmanları emici bir ped üzerine yer edin.
2. Petri kabı, cam tabak ve beyin matrisini buza yerleştirin.
3. Dik bir açıda jilet kullanarak, bir 200 μL pipet ucunun ucundan yaklaşık 5 mm kesin. Bu, ucun ucundaki açıklığın boyutunu yaklaşık 1 mm genişliğinde yapar. Bu DCN'i delmek için yeterli olmalı. Ancak bu, diseksiyona bağlı olarak gerektiği gibi de ayarlanabilir. Kolay değiştirme ve ayarlama için birçok ipucunu hazırlayın.
4. Etiket 1.5 mL mikrofuge tüpleri hayvan tanımlama ve serebellar bölge (hayvan başına dört tüp).
5. Ekstraksiyondan sonra dokuyu flaş dondurmak için cryosafe kabını sıvı nitrojenle doldurun.

2. Beyin çıkarma ve diseksiyon

Tüm deneyler Minnesota Üniversitesi Hayvan Bakım Komitelerinin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi.

1. %5 CO₂ pozlaması kullanarak fareyi ötenazi edin. Solunum durduktan sonra servikal çıkık gerçekleştirin. Kafa kesme makası ile farenin kafasını koparın ve karkası uygun kapta atın.
2. Burundan başlayıp geriye doğru devam eden başın medial sagittal çizgisi boyunca jiletle bir kesi yapın. Orta çizginin her iki tarafına ayrılarak cildi ayırın. Her iki taraftaki kası kesmek için jilet kullanın, kulak kanallarını kesin.
3. Kesme makası kullanarak, beyin sapının beyincikle buluştuğu yere kadar herhangi bir omurilik bölgesini kırpın, beyinciğin zarar görmemesine dikkat edin.
4. Damar makası bıçaklarından birini beyin sapı ve omur sütunu arasındaki boşluğa yerleştirin ve kulak kanalına doğru kesin, kemiği temiz bir şekilde kesmek için makası kaldırın, ancak dokudaki hasarı sınırlayın.
5. Kafatasının kenarı boyunca koku ampullerine doğru kesmeye devam edin, beyin dokusundaki hasarı sınırlamak için keserken kaldırmaya devam edin.
6. Künt tokaları kullanarak, kafatasının arkasını yavaşça soyun ve beynin ve beyincik bölgesini ortaya çıkarın.
7. Kafatasının kenarındaki künt künt zımsaları kullanarak kafatasının geri kalanını beynin üzerinden soyun. Bu adım kafatası kapağının çoğunu çıkarmalı ve beyni ortaya çıkarmalıdır.
8. Kafatasının geri kalanını damar makası ve künt tokalarla kırparak kafatasının çoğunu beynin tepesinden temizleyin.
9. Mikrospatula kullanarak, beyni hafifçe kaldırın ve kalan kafatasından koku ampullerini çıkarmak ve optik sistem liflerini kesmek için altına kepçe ve yukarı kaydırın. Beyin bu noktada kolayca serbest gelmelidir.
10. Beyni buz üzerinde oturan petri kabına yerleştirin ve kalan kafatasını veya diğer kalıntıları çıkarın.
11. Mikrospatulayı kullanarak, beyni dorsal tarafı yukarı olacak şekilde beyin matrisine hafifçe yerleştirin. Matriste seviye ayarlı olduğundan emin olmak için zaman ayırın, özellikle orta çizgi matriste merkezi düşer. Bu matris yetişkin fare beyin dokusu için tasarlanmıştır, genç veya hastalıklı hayvanlardan gelen doku matriste daha düşük dayanabilir, ancak numuneler arasında tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek hala mümkün olmalıdır.
12. Yaylı orta çizgi boyunca bir jilet yerleştirin, bıçağın matrisin altına kadar itmesini sağlamak (Şekil 1B).
13. İlk bıçağın yanına 1 mm daha jilet yerleştirin (Şekil 1B). Birbirinden 1 mm uzakta iki bıçak daha yerleştirin. Sonuç, beynin bir tarafına yerleştirilmiş üç bıçak olmalıdır, hepsi birbirinden 1 mm uzakta. Aynısını diğer tarafa da yap. Toplamda, 7 bıçak 1mm aralıklarla yerleştirilecektir (Şekil 1C).
14. Dikkatlice, jiletlerin ön ve arka uçlarını alın ve matristen yukarı kaldırın. Jiletlerin dışındaki doku atılabilir.
15. Yavaşça, doku bölümlerine zarar vermemeye dikkat derek bir seferde bir jilet ayırın.
16. Doku bölümünü jiletten dikkatlice kaydırın ve mikrospatula ile cam kaydırağa kaydırın. Toplamda altı sagittal beyin bölümü olacaktır (Şekil 1D).
17. En yanal 4 bölüm DCN görünür olacaktır (Mor kutu, Şekil 1D). DCN'yi izole etmek için, kesilmiş 200 μL pipet ucunu DCN üzerinde dik olarak tutun ve dcn'yi çevre dokudan tamamen kesmek için her yöne sallanarak dokudan sıkıca aşağı itin. DCN'yi temiz bir şekilde çıkarmak için doğrudan yukarı kaldırın ve ucundaki dokunun varlığını görsel olarak onaylayın.
18. Bir parmağınızı ucun üstüne yerleştirin ve aşağı itin, bu da dokunun şişkinlik yapmasına neden oldu. Ucu doğru etiketlenmiş mikroyakıt tüpüne yerleştirin ve doku delme tüpünün altına yerleştirildiğından emin olun. Kalan üç bölüm için 2.17'yi tekrarlayın ve DCN zımbalarını aynı tüpe yerleştirin. Flaş dondurmak için tüpü sıvı nitrojene yerleştirin. Şekil 1E'deher bir zımbanın boyutunun gösterimi.
19. DCN çıkarılan bölümler serebellar yarımküre olarak nitelendirilir. Beyin dokusunun geri kalanını bu bölümlerdeki beyinciklerin etrafına itin. Künt tokalar kullanın ve bu yarımküre serebellar korteks bölümlerini hafifçe alın ve ilgili mikrofuge tüpüne yerleştirin. Flaş dondurun.
20. Son iki vermal bölüm için (açık mavi kutu, Şekil1D),sadece beyincik bırakarak çevreleyen beyin dokusunu uzaklaştırın. Jilet kullanarak, ön lobülleri arka lobüllerden ayıran bir kesim yapın. Kesim lobule 6 oluşumundan hemen sonra olmalı ve lobule 10(Şekil 1F)içermemelidir.
21. Künt forseps kullanarak, ön serebellar korteks bölümlerini ve posterior serebellar korteks bölümlerini dikkatlice ilgili mikrofuge tüplerine yerleştirin ve tüpleri 5 dakika boyunca sıvı nitrojende bırakarak flaş dondurun. Buradan RNA ekstraksiyonuna ilerleyin veya tüpleri -80 °C'de saklayabilir.

3. RNA ekstraksiyonu

NOT: Bu protokol, TRIzol²⁰ile RNA Ekstraksiyonu için Soğuk Bahar Limanı Protokolü'nden değiştirilmiştir. TRIzol biyolojik malzemeyi çözünür ve RNA çıkarılmasını mümkün hale getirir.

1. Dokunun çok hızlı çözülmesini önlemek için mikrobuj tüplerini buza yerleştirin, mikroyapı tüpüne 150 μL soğuk TRIzol uygulayın. Sterilize edilmiş bir pestle ile homojenize edin. Doku homojenize olduktan sonra, kalan dokunun bozulmadığından emin olmak için çözeltiyi yukarı ve aşağı borulayın. Ayrıca küçük doku parçalarını birkaç kez insülin şırındına çekerek parçalayın.
2. 350 μL daha TRIzol ekleyin ve iyice karıştırmak için yukarı ve aşağı borulayın. Oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
3. Tüpe 150 μL kloroform ekleyin ve kuvvetlice çalkalayın ve ardından 2-3 dakika dinlendirin. Kloroform homojenize doku çözeltisini fazlara (RNA, DNA ve protein) ayırır.
4. 12.000 x g'da, 15°C'de 10 dakika santrifüj. Tüm tüplerin aynı yönde olduğundan emin olun.
5. Tüpleri dikkatlice çıkarın ve santrifüjün sıcaklığını 4 °C'ye ayarlayın. Sadece berrak sulu fazı yeni bir tüpe çıkarın (bu RNA'dır), opak ara fazı (DNA) bozmamaya dikkat edin.  En düşük faz kırmızı olacaktır ve protein içerir. Tüplerde kalan çözelti kaydedilebilir veya atılabilir.
6. 1:2 oranında% 100 izopropil alkol ekleyin (200 ul sulu faz çıkarılırsa, 100 μL izopropil alkol ekleyin). Yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika dinlendirin. İzopropil alkol RNA'yı çözeltiden çıkarır.
7. 12.000 x g'da, 4°C'de 10 dakika santrifüj. Peletin görselleştirilmesini kolaylaştırmak için tüm tüpleri aynı yönde yerleştirebildiğinden emin olun. Elde edilen pelet çıkarılan RNA olacaktır.
8. Tüpleri dikkatlice çıkarın, peletin bozulmamasına dikkat eden bir pipet ile üsttantı çıkarın. Pelet biraz jel benzeridir ve görülmesi zor olacaktır, ancak santrifüjdeki tüplerin yönüne göre nerede olduğunu tahmin edebilmelidir.
9. Tüm süpernatantı çıkardıktan sonra, 5 dakika boyunca 5 dakika boyunca 7500 x g'da 500 μL% 75 etanol, girdap ve santrifüj ekleyin. Etanol peletin daha da yıkanır.
10. Peletin bozulmasına neden olmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın. Numuneyi kurutmak için kapakları açık bırakın. Bu genellikle 5-10 dakika sürer, ancak pelet üzerinde ne kadar etanol kaldığına bağlı olarak değişebilir. Fazla kurutma.
11. Kurutuktan sonra peletin DNase serbest suyuna yeniden koyun. DCN için örneklere 20 μL ve diğerleri için 30 μL ekleyin.
12. Yeniden depolandıktan sonra, numuneler -80 °C'de saklanabilir veya daha fazla teste devam edebilir.

4. Gerçek Zamanlı Nicel Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RTqPCR)

1. Bu adımdan önce, herhangi bir genomik DNA'yı çıkarmak için RNA'yı tedavi etmek ve BioRad'dan iScript kullanarak cDNA oluşturmak gerekecektir. CDNA yapmadan önce RNA konsantrasyonunun normale döndürdürülmesini unutmayın. Ek olarak, qPCR için astarları optimize etmek önemlidir. Bu adım^21'itamamlamak için burada açıklanan yöntemleri izleyin. Aşağıdaki qPCR'nin kısa açıklaması.
2. Primer'ların tümü IDT'den satın alınmaktadır. İleri ve ters diziler aynı numune tüpündedir ve 20x konsantrasyonda depolanır.
   Rps18 (kontrol geni):
   İleri – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
   Ters – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
   Parvalbumin (Kalsiyum bağlayıcı protein, inhibitör hücreler):
   İleri – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
   Ters – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3'
   Kcng4 (Potasyum kanalı alt birliği):
   İleri – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
   Ters – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
   Aldolaz C (Zebrin II, serebellar korteks boyunca farklı olarak ifade edilir):
   İleri – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3'
   Ters – 5'-TCAGTAGGCATGGGGGGC-3'
3. qPCR koşulları aşağıdaki gibidir. Ön kuluçka süresi, 5 dakika, 95°C'de. Amplifikasyon süresi, 50 döngü: 95°C'de 10 dakika, 62°C'de 10 dakika ve 72°C'de 10 dakika. Erime eğrisi süresi, 95°C'de 5 saniye, 65°C'de bir dakika ve rampa hızını 97°C hedef sıcaklığına kadar .07°C/saniye olarak ayarlayın. Daha sonra 10 dakika ila 40 °C arasında soğutma süresi.  Tüm qPCR reaksiyonları üç taraflı olarak gerçekleştirildi ve gen ekspresyonunun normalleştirilmesi için yükleme kontrolü olarak Rps18 ile 2^{- ΔΔCt} kullanılarak gen ekspresyörü analiz edildi. Referans olarak dökme serebellar ekstre kullanılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu deneyler için dört on bir haftalık dişi vahşi tip C57/Black6 fare kullanıldı. Bir fare, 'dökme beyincik' olarak adlandırılan ve kesilen bölgelerdeki RNA seviyelerinin tam bir diseksiyonla karşılaştırılmasına izin verilen tam bir serebellar diseksiyon yapmak için kullanıldı. Diğer üç fare, bu protokolde açıklanan serebellar diseksiyonu yapmak için kullanılmıştır. Üç fare kullanmak, RNA seviyelerinde tespit edilen eğilimlerin fareler arasında tekrarlanab...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada açıklanan yöntem, dört ayrı serebellar bölgede altta kalan gen ekspresyonunu ve moleküler mekanizmaların değerlendirilmesini mümkün kılar - derin serebellar çekirdek (DCN), vermisin ön serebellar korteksi (CCaV), vermisin arka serebellar korteksi (CCpV) ve yarımkürelerin serebellar korteksi (CCH). Bu bölgeleri ayrı ayrı değerlendirme yeteneği, belirli serebellar bölgelerin heterojenliği hakkındaki bilgimizi genişletecek ve muhtemelen çeşitli davranışlara katkılarına ışık tutacakt?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 Microcentrifuge tubes	ThermoScietific	3456
100% Isopropyl Alcohol	VWR Life sciences	1106C361
200 ul Pipet tips	GeneMate	P-1237-200
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal	Kent Scientific Corporation	RBMA-200S
Blunt forceps
Chloroform	Macron	220905
Decapitation Scissors
Dissecting Scissors
Ethyl Alcohol	Pharmco	111000200
Glass Slide (for electrophoresis)	BIORAD
Homogenizer	Kimble	6HAZ6
Ice Bucket
Insulin Syringe (.5ml)	BD	329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR	BIORAD	1725037
Micro Spatula
Needle Nose forceps
Petri Dish	Pyrex
Primetime Primer for Aldolase C	IDT	Mm.PT.58>43415246
Primetime Primer for Kcng4	IDT	Mm.PT.56a.9448518
Primetime Primer for Parvalbumin	IDT	Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18	IDT	Mm.PT.58.12109666
Single Edge Rzor Blades	Personna GEM
Sterile, sigle-use pestles	FisherScientific	12141364
TRIzol Reagent	Ambion by Life technologies	15596018
Vascular Scissors