Dissezione regionale cerebellare per l'analisi molecolare

Riepilogo

Diverse regioni cerebellari sono state implicate per svolgere un ruolo in distinti output comportamentali, ma i meccanismi molecolari sottostanti rimangono sconosciuti. Questo lavoro descrive un metodo per sezionare in modo riproducibile e rapido la corteccia cerebellare degli emisferi, delle regioni anteriori e posteriori del verme e dei nuclei cerebellari profondi al fine di sondare le differenze molecolari isolando l'RNA e testando le differenze nell'espressione genica.

Abstract

Il cervelletto svolge un ruolo importante in diverse funzioni chiave tra cui il controllo del movimento, l'equilibrio, la cognizione, la ricompensa e l'affetto. Studi di imaging indicano che regioni cerebellari distinte contribuiscono a queste diverse funzioni. Gli studi molecolari che esaminano le differenze cerebellari regionali sono in ritardo in quanto sono per lo più eseguiti su estratti cerebellari interi, mascherando così qualsiasi distinzione tra specifiche regioni cerebellari. Qui descriviamo una tecnica per sezionare in modo riproducibile e rapido quattro diverse regioni cerebellari: i nuclei cerebellari profondi (DCN), la corteccia cerebellare vermale anteriore e posteriore e la corteccia cerebellare degli emisferi. Sezionare queste regioni distinte consente l'esplorazione di meccanismi molecolari che possono essere alla base dei loro contributi unici all'equilibrio, al movimento, all'affetto e alla cognizione. Questa tecnica può anche essere utilizzata per esplorare le differenze nella suscettibilità patologica di queste regioni specifiche in vari modelli di malattia murina.

Introduzione

Il cervelletto contiene oltre la metà dei neuroni nel cervello ed è stato storicamente indicato come un centro di controllo motorio e di equilibrio nel cervello¹. Più recentemente, gli studi hanno dimostrato che il cervelletto svolge un ruolo chiave in varie altre funzioni tra cui la cognizione, l'elaborazione della ricompensa e l'influenza^2,3,4,5.

Il cervelletto ha un'anatomia ben descritta: la regione della corteccia è composta da granuli, Purkinje e strati molecolari. Le cellule del gran....

Protocollo

1. Configurazione

1. Raccogli l'attrezzatura necessaria tra cui forbici di decapitazione, pinza smussata, forbici di dissezione, forbici vascolari, microspatula, matrice cerebrale di topo sagittale, lame di rasoio, punte di pipet da 200 μL, piastra di Petri di vetro, vetrino di vetro e secchiello del ghiaccio. Disadere tutte le attrezzature su un pad assorbente.
2. Metti la capsula di Petri, la lastra di vetro e la matrice cerebrale sul ghiaccio.
3. Utilizzando una lama di rasoio con un angolo perpendicolare, tagliare circa 5 mm dalla punta di una punta di pipetta da 200 μL. Ciò rende la dimensione dell'apertura all'estremità dell....

Risultati

Per questi esperimenti sono stati utilizzati quattro topi femmina di tipo C57/Black6 di undici settimane. Un topo è stato utilizzato per condurre una dissezione cerebellare completa che viene definita "cervelletto di massa" e ha permesso il confronto dei livelli di RNA nelle regioni sezionate con una dissezione completa. Gli altri tre topi sono stati utilizzati per condurre la dissezione cerebellare descritta in questo protocollo. L'utilizzo di tre topi consente di garantire che le tende.......

Discussione

Il metodo qui descritto consente di valutare l'espressione genica sottostante e i meccanismi molecolari all'interno di quattro distinte regioni cerebellari: i nuclei cerebellari profondi (DCN), la corteccia cerebellare anteriore del verme (CCaV), la corteccia cerebellare posteriore del verme (CCpV) e la corteccia cerebellare degli emisferi (CCH). La capacità di valutare queste regioni separatamente amplierà la nostra conoscenza dell'eterogeneità di specifiche regioni cerebellari e possibilmente farà luce sul loro con.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 Microcentrifuge tubes	ThermoScietific	3456
100% Isopropyl Alcohol	VWR Life sciences	1106C361
200 ul Pipet tips	GeneMate	P-1237-200
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal	Kent Scientific Corporation	RBMA-200S
Blunt forceps
Chloroform	Macron	220905
Decapitation Scissors
Dissecting Scissors
Ethyl Alcohol	Pharmco	111000200
Glass Slide (for electrophoresis)	BIORAD
Homogenizer	Kimble	6HAZ6
Ice Bucket
Insulin Syringe (.5ml)	BD	329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR	BIORAD	1725037
Micro Spatula
Needle Nose forceps
Petri Dish	Pyrex
Primetime Primer for Aldolase C	IDT	Mm.PT.58>43415246
Primetime Primer for Kcng4	IDT	Mm.PT.56a.9448518
Primetime Primer for Parvalbumin	IDT	Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18	IDT	Mm.PT.58.12109666
Single Edge Rzor Blades	Personna GEM
Sterile, sigle-use pestles	FisherScientific	12141364
TRIzol Reagent	Ambion by Life technologies	15596018
Vascular Scissors