Zerebelläre regionale Dissektion für die molekulare Analyse

Zusammenfassung

Verschiedene Kleinhirnregionen spielen eine Rolle bei unterschiedlichen Verhaltensergebnissen, aber die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bleiben unbekannt. Diese Arbeit beschreibt eine Methode, um die Kleinhirnrinde der Hemisphären, der vorderen und hinteren Regionen der Vermis und der tiefen Kleinhirnkerne reproduzierbar und schnell zu sezieren, um durch Isolierung von RNA und Tests auf Unterschiede in der Genexpression auf molekulare Unterschiede zu untersuchen.

Zusammenfassung

Kleinhirn spielt eine wichtige Rolle in mehreren Schlüsselfunktionen, einschließlich der Kontrolle von Bewegung, Gleichgewicht, Kognition, Belohnung und Affekt. Bildgebende Untersuchungen deuten darauf hin, dass unterschiedliche Kleinhirnregionen zu diesen verschiedenen Funktionen beitragen. Molekulare Studien, die regionale Kleinhirnunterschiede untersuchen, hinken hinterher, da sie meist an ganzen Kleinhirnextrakten durchgeführt werden, wodurch alle Unterscheidungen zwischen bestimmten Kleinhirnregionen maskiert werden. Hier beschreiben wir eine Technik, um vier verschiedene Kleinhirnregionen reproduzierbar und schnell zu sezieren: die tiefen Kleinhirnkerne (DCN), die vordere und hintere vermale Kleinhirnrinde und die Kleinhirnrinde der Hemisphären. Die Sezierung dieser unterschiedlichen Regionen ermöglicht die Erforschung molekularer Mechanismen, die ihren einzigartigen Beiträgen zu Gleichgewicht, Bewegung, Affekt und Kognition zugrunde liegen können. Diese Technik kann auch verwendet werden, um Unterschiede in der pathologischen Anfälligkeit dieser spezifischen Regionen in verschiedenen Mauskrankheitsmodellen zu untersuchen.

Einleitung

Das Kleinhirn enthält mehr als die Hälfte der Neuronen im Gehirn und wurde historisch als motorisches Kontroll- und Gleichgewichtszentrum im Gehirn bezeichnet¹. In jüngerer Zeit haben Studien gezeigt, dass das Kleinhirn eine Schlüsselrolle bei verschiedenen anderen Funktionen spielt, einschließlich Kognition, Belohnungsverarbeitung und^{Affekt 2,3,4,5}.

Das Kleinhirn hat eine gut beschriebene Anatomie: Die Kortexregion besteht aus Granula, Purkinje und molekularen Schichten. Körnerzellen bilden die Granulatzellschicht und senden den Input über parallele Fasern an die Purkinje-Zelldendriten der Molekülschicht, die auch Input von Kletterfasern erhalten, die aus der unteren Olive stammen. Purkinje-Zellen senden hemmende Projektionen an Zellen in den tiefen Kleinhirnkernen (DCN), die als Hauptausgang des Kleinhirns dienen. Die Ausgabe dieses Kleinhirnkreislaufs wird durch die Aktivität der inhibitorischen Interneuronen in der Kleinhirnrinde, einschließlich Golgi-, Stern- und Korbzellen, weiter moduliert⁴. Diese kleinhirnförmige Funktionseinheit ist über alle Läppchen der Kleinhirnrinde verteilt. Trotz dieser relativ einheitlichen Schaltkreise über das Kleinhirn deuten Beweise aus der Human-Neuroimaging-Literatur und Patientenstudien auf eine funktionelle Heterogenität des Kleinhirns^{hin 6,7}.

Die Kleinhirnrinde kann in zwei Hauptregionen unterteilt werden: die mittelliniendefinierte Vermis und die laterale Hemisphäre. Die Vermis kann weiter in vordere und hintere Läppchen unterteilt werden. Diese unterschiedlichen Regionen des Kleinhirns wurden in die Lage verwickelt, zu unterschiedlichen Verhaltensweisen beizutragen. Aufgaben-evozierte oder aufgabenfreie Aktivitätsmuster implizieren, dass vordere Regionen der Vermis mehr zur motorischen Funktion beitragen, während hintere Vermis mehr zur Kognition beitragen^6,7. Die Vermis ist auch mit Affekt und Emotionen verbunden, während Kleinhirnhemisphären zu exekutiven, visuell-räumlichen, sprachlichen und anderen mnemonischen Funktionen beitragen⁸. Darüber hinaus lieferten anatomische Studien Hinweise darauf, dass funktionell unterschiedliche Kleinhirnregionen mit verschiedenen kortikalen Regionen verbunden sind⁹. Die Kartierung der Läsionssymptome ergab, dass Patienten mit Schlaganfällen, die die vorderen Läppchen betrafen (bis in das Läppchen VI hinein), eine schlechtere Leistung bei feinmotorischen Aufgaben zeigten, während Patienten mit Schäden an den hinteren Lappenregionen und Hemisphären kognitive Defizite in Abwesenheit des kleinhirnmotorischen Syndroms^{aufwiesen 10}. Schließlich zeigt die regionale Kleinhirnpathologie bei Krankheiten, dass funktionell unterschiedliche Kleinhirnregionen auch unterschiedlich anfällig für Krankheiten sind^11,12.

Obwohl viel weniger erforscht, zeigen vorläufige Beweise unterschiedliche Genexpressionssignaturen über zerebelläre kortikale Regionen hinweg. Die Purkinje-Zellexpression von Zebrin II zeigt eine regionsspezifische Musterung in der Vermis, so dass es mehr Zebrin II-positive Zellen in den hinteren Läppchen und weniger in den vorderen Läppchen gibt¹³. Dies korreliert auch mit einer regional unterschiedlichen physiologischen Funktion, da Zebrin II-negative Purkinje-Zellen eine höhere Frequenz des tonischen Feuerns aufweisen als Purkinje-Zellen, die Zebrin II-positiv sind¹⁴.

Neben der Kleinhirnrinde umfasst das Kleinhirn die tiefen Kleinhirnkerne (DCN), die als Primärausgang für das Kleinhirn dienen. Die Kerne bestehen aus den medialen (MN), interposierten (IN) und lateralen Kernen (LN). Funktionelle Bildgebung und Patientenstudien haben gezeigt, dass das DCN auch an verschiedenen Verhaltensweisen beteiligt ist¹⁵, aber nur sehr wenige Studien untersuchen die Veränderung der Genexpression in DCN.

Fortschritte in molekularen Techniken haben es ermöglicht, die regionale Genexpression im Gehirn zu beurteilen und haben Heterogenität zwischen und innerhalb verschiedener Gehirnregionen sowohl in physiologischen als auch in Krankheitszuständen aufgedeckt¹⁶. Solche Studien implizieren, dass sich das Kleinhirn von anderen Gehirnregionen unterscheidet. Zum Beispiel ist das Verhältnis von Neuronen zu Gliazellen im Kleinhirn im Vergleich zu anderen Hirnregionen invertiert¹. Selbst unter normalen physiologischen Bedingungen ist die Expression von proinflammatorischen Genen im Kleinhirn im Vergleich zu den anderen Hirnregionen hochreguliert¹⁷. Molekulare Techniken waren auch sehr nützlich bei der Identifizierung der Wege, die zur Pathogenese von Kleinhirnerkrankungen beitragen. Zum Beispiel identifizierte die RNA-Sequenzierung der gesamten Kleinhirnextrakte Gene, die in einem Purkinje-zellspezifischen transgenen Mausmodell der spinozerebellären Ataxie Typ 1 (SCA1) im Vergleich zu ihren Wildtypkontrollen verändert wurden. Solche Beweise haben wichtige molekulare Wege aufgedeckt, die der Pathogenese in kleinhirnen Purkinje-Zellen zugrunde liegen, und haben dazu beigetragen, potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren¹⁸. Neuere Studien deuten jedoch darauf hin, dass es Unterschiede in der Anfälligkeit für Krankheiten in den Kleinhirnregionen gibt^11,12,19. Dies könnte darauf hindeuten, dass es in verschiedenen Kleinhirnregionen zu wichtigen Veränderungen kommt, die mit ganzen Kleinhirnextrakten maskiert oder unentdeckt sein können. Daher müssen Techniken entwickelt werden, die es Forschern ermöglichen, molekulare Profile in verschiedenen Kleinhirnregionen zu untersuchen.

Die hier vorgeschlagene Technik beschreibt eine reproduzierbare Methode, um vier verschiedene Regionen des Kleinhirns der Maus zu sezieren, um RNA aus diesen Regionen zu isolieren und regionale Unterschiede in der Genexpression zu untersuchen. Das Schema des Kleinhirns der Maus in Abbildung 1A hebt die Vermis in Blau und die Hemisphären in Gelb hervor. Insbesondere ermöglicht diese Technik die Isolierung von vier Regionen: tiefe Kleinhirnkerne (DCN) (rot gepunktete Kästchen in Abbildung 1A),die Kleinhirnrinde der vorderen Vermis (CCaV) (dunkelblau in Abbildung 1A),die Kleinhirnrinde der hinteren Vermis (CCpV) (hellblau in Abbildung 1A)und die Kleinhirnrinde der Hemisphären (CCH) (gelb in Abbildung 1A). Durch die getrennte Beurteilung der Genexpression dieser Regionen wird es möglich sein, molekulare Mechanismen zu untersuchen, die den diskreten Funktionen dieser verschiedenen Regionen zugrunde liegen, sowie mögliche Unterschiede in ihrer Anfälligkeit für Krankheiten.

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Protokoll

1. Einrichtung

1. Sammeln Sie die notwendige Ausrüstung, einschließlich Enthauptungsschere, stumpfe Pinzette, Sezierschere, Gefäßschere, Mikrospatula, sagittale Maushirnmatrix, Rasierklingen, 200 μL Pipettenspitzen, Glassteinschale, Glasobjektträger und Eiskübel. Legen Sie die gesamte Ausrüstung auf einem saugfähigen Pad aus.
2. Petrischale, Glasplatte und Gehirnmatrix auf Eis legen.
3. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge in einem senkrechten Winkel etwa 5 mm von der Spitze einer 200 μL-Pipettspitze ab. Dadurch ist die Größe der Öffnung am Ende der Spitze etwa 1 mm breit. Dies sollte ausreichen, um das DCN auszustanzen. Diese kann aber auch je nach Dissektion bedarfsgemäss angepasst werden. Halten Sie viele Tipps für den einfachen Austausch und die Anpassung bereit.
4. Etikett 1,5 ml Mikrofugenröhrchen mit Tieridentifikation und Kleinhirnregion (vier Röhrchen pro Tier).
5. Füllen Sie den kryosicheren Behälter mit flüssigem Stickstoff, um das Gewebe nach der Extraktion zu flashen.

2. Gehirnextraktion und Dissektion

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Animal Care Committees der University of Minnesota durchgeführt.

1. Euthanasiern Sie die Maus mit 5% CO_{2-Exposition.} Sobald die Atmung aufgehört hat, führen Sie eine zervikale Luxation durch. Enthaupten Sie die Maus mit der Enthauptungsschere und entsorgen Sie den Kadaver im entsprechenden Behälter.
2. Machen Sie einen Schnitt mit einer Rasierklinge entlang der medialen sagittalen Linie des Kopfes, beginnend an der Nase und den ganzen Weg zurück. Trennen Sie die Haut und trennen Sie sich zu beiden Seiten der Mittellinie. Verwenden Sie die Rasierklinge, um den Muskel auf jeder Seite wegzuschneiden und an den Gehörgängen vorbei zu schneiden.
3. Schneiden Sie mit einer Schere alle Rückenmarksregionen bis zu dem Punkt, an dem der Hirnstamm auf das Kleinhirn trifft, und achten Sie darauf, das Kleinhirn nicht zu beschädigen.
4. Führen Sie eine der vaskulären Scherenklingen in den Raum zwischen Hirnstamm und Wirbelsäule ein und schneiden Sie in Richtung Gehörgang, heben Sie die Schere an, um den Knochen sauber zu schneiden, aber die Schädigung des Gewebes zu begrenzen.
5. Schneiden Sie weiter entlang des Schädelrandes in Richtung der Riechkolben und heben Sie sich beim Schneiden weiter an, um die Schädigung des Gehirngewebes zu begrenzen.
6. Mit der stumpfen Pinzette die Rückseite des Schädels vorsichtig abziehen und die hintere Region des Gehirns und des Kleinhirns freizulegen.
7. Mit der stumpfen Pinzette am Rand des Schädels, der gerade geschnitten wurde, schälen Sie den Rest des Schädels nach oben und über das Gehirn. Dieser Schritt sollte den Großteil der Schädelkappe entfernen und das Gehirn enthüllen.
8. Schneiden Sie den Rest des Schädels mit der Gefäßschere und der stumpfen Pinzette ab und entfernen Sie den größten Teil des Schädels von der Oberseite des Gehirns.
9. Heben Sie mit der Mikrospatula das Gehirn leicht an und schaufeln Sie darunter und gleiten Sie nach oben, um die Riechkolben vom verbleibenden Schädel zu entfernen und die Fasern des Sehtrakts zu trennen. Das Gehirn sollte an dieser Stelle leicht frei kommen.
10. Legen Sie das Gehirn in die Petrischale, die auf Eis sitzt, und entfernen Sie alle verbleibenden Schädel oder andere Trümmer.
11. Legen Sie das Gehirn mit der Mikrospatula vorsichtig mit der rückenden Seite nach oben in die Gehirnmatrix. Nehmen Sie sich Zeit, um sicherzustellen, dass es in der Matrix auf Höhe eingestellt ist, insbesondere dass die Mittellinie in der Matrix in der Mitte liegt. Diese Matrix ist für adultes Mausgehirngewebe konzipiert, Gewebe von jüngeren oder erkrankten Tieren kann tiefer in der Matrix ruhen, aber es sollte immer noch möglich sein, reproduzierbare Ergebnisse über Proben hinweg zu erzielen.
12. Legen Sie eine Rasierklinge entlang der sagittalen Mittellinie, und stellen Sie sicher, dass die Klinge bis zum Boden der Matrix gedrückt wird (Abbildung 1B).
13. Legen Sie eine weitere Rasierklinge 1 mm an die Seite der ersten Klinge (Abbildung 1B). Platzieren Sie zwei weitere Klingen 1 mm voneinander entfernt. Das Endergebnis sollten drei Klingen sein, die auf einer Seite des Gehirns platziert sind, die alle 1 mm voneinander entfernt sind. Tun Sie dasselbe mit der anderen Seite. Insgesamt werden 7 Klingen 1 mm voneinander entfernt platziert (Abbildung 1C).
14. Greifen Sie vorsichtig die vorderen und hinteren Enden der Rasierklingen und heben Sie sie gerade aus der Matrix heraus. Das Gewebe an der Außenseite der Rasierklingen kann entsorgt werden.
15. Trennen Sie langsam eine Rasierklinge nach der anderen von den anderen und achten Sie darauf, die Gewebeabschnitte nicht zu beschädigen.
16. Schieben Sie den Gewebeteil vorsichtig von der Rasierklinge auf den Glasträger mit der Mikrospatula. Insgesamt wird es sechs sagittale Hirnschnitte geben (Abbildung 1D).
17. Bei den 4 seitlichsten Abschnitten ist DCN sichtbar (Violettes Feld, Abbildung 1D). Um das DCN zu isolieren, halten Sie die getrimmte 200 μL-Pipettspitze senkrecht über das DCN und drücken Sie fest durch das Gewebe, wobei Sie in alle Richtungen schaukeln, um das DCN vollständig aus dem umgebenden Gewebe zu sezieren. Heben Sie gerade wieder nach oben, um das DCN sauber zu entfernen, und bestätigen Sie visuell das Vorhandensein des Gewebes in der Spitze.
18. Legen Sie einen Finger an die Oberseite der Spitze und drücken Sie nach unten, wodurch sich das Gewebe auswölbt. Legen Sie die Spitze in das korrekt markierte Mikrofugenröhrchen und stellen Sie sicher, dass der Gewebestempel in den Boden des Röhrchens gelegt wird. Wiederholen Sie 2.17 für die verbleibenden drei Abschnitte und legen Sie die DCN-Stempel in dasselbe Rohr. Legen Sie das Rohr in flüssigen Stickstoff, um es zu gefrieren. Darstellung der Größe jedes Stempels in Abbildung 1E.
19. Abschnitte, bei denen DCN extrahiert wurde, gelten als Kleinhirnhemisphäre. Schieben Sie den Rest des Gehirngewebes um das Kleinhirn in diesen Abschnitten weg. Verwenden Sie eine stumpfe Zette und nehmen Sie diese Hemisphären-Kleinhirnrindenabschnitte vorsichtig auf und legen Sie sie in die entsprechende Mikrofugenröhre. Blitzfrost.
20. Für die letzten beiden vermalen Abschnitte (hellblauer Kasten, Abbildung 1D)schieben Sie das umgebende Hirngewebe weg und lassen nur das Kleinhirn zurück. Machen Sie mit einer Rasierklinge einen Schnitt, der die vorderen Läppchen von den hinteren Läppchen trennt. Der Schnitt sollte kurz nach der Bildung von Läppchen 6 erfolgen und sollte Läppchen 10 nicht enthalten(Abbildung 1F).
21. Legen Sie mit einer stumpfen Handzette die vorderen Kleinhirnkordenabschnitte und die hinteren Kleinhirnrindenabschnitte vorsichtig in ihre jeweiligen Mikrofugenröhrchen und gefrieren Sie blitzgefrieren, indem Sie die Röhrchen 5 Minuten lang in flüssigem Stickstoff belassen. Von hier aus gehen Sie zur RNA-Extraktion über oder können die Röhrchen bei -80 ° C speichern.

3. RNA-Extraktion

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde vom Cold Spring Harbor Protocol für die RNA-Extraktion mit TRIzol^{20 modifiziert.} TRIzol löst biologisches Material und ermöglicht die Extraktion von RNA.

1. Legen Sie die Mikrofugenröhrchen in Eis, um zu verhindern, dass das Gewebe zu schnell auftaut, tragen Sie 150 μL kaltes TRIzol in das Mikrofugenröhrchen auf. Mit einem sterilisierten Stößel homogenisieren. Sobald das Gewebe homogenisiert ist, pipetieren Sie die Lösung nach oben und unten, um sicherzustellen, dass kein verbleibendes Gewebe intakt ist. Brechen Sie kleine Gewebestücke weiter auf, indem Sie sie einige Male in eine Insulinspritze ziehen.
2. Fügen Sie weitere 350 μL TRIzol hinzu und pipetieren Sie sie auf und ab, um sie gründlich zu mischen. Lassen Sie die Raumtemperatur für 5 Minuten sitzen.
3. 150 μL Chloroform in die Tube geben und kräftig schütteln und dann 2-3 Minuten ruhen lassen. Das Chloroform trennt die homogenisierte Gewebelösung in Phasen (RNA, DNA und Protein).
4. Zentrifuge bei 12.000 x g, bei 15°C, für 10 Minuten. Stellen Sie sicher, dass sich alle Rohre in der gleichen Ausrichtung befinden.
5. Entfernen Sie vorsichtig die Röhrchen und stellen Sie die Temperatur der Zentrifuge auf 4°C ein. Entfernen Sie nur die klare bässrige Phase in eine neue Röhre (dies ist die RNA), achten Sie darauf, die undurchsichtige Interphase (die DNA) nicht zu stören.  Die niedrigste Phase ist rot und enthält Protein. Restlösung in den Röhrchen kann gespeichert oder entsorgt werden.
6. Fügen Sie 100% Isopropylalkohol im Verhältnis 1:2 hinzu (wenn 200 μL der bässrigen Phase entfernt werden, fügen Sie 100 μL Isopropylalkohol hinzu). Gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren. 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen. Der Isopropylalkohol fällt die RNA aus der Lösung aus.
7. Zentrifuge bei 12.000 x g, bei 4°C, für 10 Minuten. Stellen Sie sicher, dass Sie alle Rohre in der gleichen Ausrichtung platzieren, um die Visualisierung des Pellets zu erleichtern. Das resultierende Pellet ist die extrahierte RNA.
8. Entfernen Sie vorsichtig die Rohre, entfernen Sie den Überstand mit einer Pipett, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören. Das Pellet ist etwas gelartig und wird schwer zu sehen sein, sollte aber in der Lage sein, abzuschätzen, wo es sich auf der Orientierung der Röhrchen in der Zentrifuge befindet.
9. Nachdem Sie den gesamten Überstand entfernt haben, fügen Sie 500 μL 75% Ethanol, Wirbel kurz und Zentrifuge bei 7500 x g, bei 4 ° C, für 5 Minuten hinzu. Das Ethanol wäscht das Pellet weiter.
10. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. Lassen Sie die Kappen offen, um die Probe zu trocknen. Dies dauert normalerweise 5-10 Minuten, kann aber variieren, je nachdem, wie viel Ethanol auf dem Pellet übrig geblieben ist. Nicht zu trocken machen.
11. Nach dem Trocknen das Pellet in DNase-freiem Wasser wieder auffüllen. Fügen Sie 20 μL zu Proben für DCN und 30 μL für alle anderen hinzu.
12. Nach der Wiederaufbeendigung können die Proben bei -80 °C gelagert oder mit weiteren Tests fortgefahren werden.

4. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit (RTqPCR)

1. Vor diesem Schritt wird es notwendig sein, die RNA zu behandeln, um genomische DNA zu entfernen und cDNA mit iScript von BioRad zu generieren. Stellen Sie sicher, dass Sie die Konzentration der RNA normalisieren, bevor Sie die cDNA erstellen. Darüber hinaus ist es wichtig, Primer für qPCR zu optimieren. Befolgen Sie die hier beschriebenen Methoden, um diesen Schritt²¹abzuschließen. Kurze Beschreibung der qPCR unten.
2. Primer werden alle von IDT gekauft. Vorwärts- und Rückwärtssequenzen befinden sich beide im selben Probenröhrchen und werden in 20-facher Konzentration gelagert.
   Rps18 (Kontrollgen):
   Vorwärts – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
   Rückwärts – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
   Parvalbumin (Calciumbindendes Protein, hemmende Zellen):
   Vorwärts – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
   Rückwärts – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3'
   Kcng4 (Untereinheit Kaliumkanal):
   Vorwärts – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
   Rückwärts – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
   Aldolase C (Zebrin II, differentiell über die Kleinhirnrinde exprimiert):
   Vorwärts – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3'
   Rückwärts – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3'
3. Die qPCR-Bedingungen waren wie folgt. Vorinkubationszeit, 5 Minuten, bei 95°C. Verstärkungszeit, 50 Zyklen: 10 Minuten bei 95 °C, 10 Minuten bei 62 °C und 10 Minuten bei 72 °C. Schmelzkurvendauer, 5 Sekunden bei 95 °C, eine Minute bei 65 °C und Einstellgeschwindigkeit auf 0,07 °C/Sekunde bis zur Zieltemperatur von 97 °C. Dann Kühlzeit für 10 Minuten auf 40°C.  Alle qPCR-Reaktionen wurden dreifach durchgeführt und die Genexpression wurde mit 2^{- ΔΔCt} mit Rps18 als Belastungskontrolle analysiert, um die Genexpression zu normalisieren. Bulk-Kleinhirnextrakt wurde als Referenz verwendet.

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Ergebnisse

Für diese Experimente wurden vier elf Wochen alte weibliche Wildtyp-C57/Black6-Mäuse verwendet. Eine Maus wurde verwendet, um eine vollständige Kleinhirndissektion durchzuführen, die als "Bulk-Kleinhirn" bezeichnet wird und den Vergleich der RNA-Spiegel in sezierten Regionen mit einer vollständigen Dissektion ermöglichte. Die anderen drei Mäuse wurden verwendet, um die in diesem Protokoll beschriebene Kleinhirndissektion durchzuführen. Durch den Einsatz von drei Mäusen kann siche...

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Diskussion

Die hier beschriebene Methode ermöglicht es, die zugrunde liegende Genexpression und molekularen Mechanismen innerhalb von vier verschiedenen Kleinhirnregionen zu beurteilen – den tiefen Kleinhirnkernen (DCN), der vorderen Kleinhirnrinde der Vermis (CCaV), der hinteren Kleinhirnrinde der Vermis (CCpV) und der Kleinhirnrinde der Hemisphären (CCH). Die Fähigkeit, diese Regionen separat zu bewerten, wird unser Wissen über die Heterogenität bestimmter Kleinhirnregionen erweitern und möglicherweise ihren Beitrag zu ve...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 Microcentrifuge tubes	ThermoScietific	3456
100% Isopropyl Alcohol	VWR Life sciences	1106C361
200 ul Pipet tips	GeneMate	P-1237-200
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal	Kent Scientific Corporation	RBMA-200S
Blunt forceps
Chloroform	Macron	220905
Decapitation Scissors
Dissecting Scissors
Ethyl Alcohol	Pharmco	111000200
Glass Slide (for electrophoresis)	BIORAD
Homogenizer	Kimble	6HAZ6
Ice Bucket
Insulin Syringe (.5ml)	BD	329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR	BIORAD	1725037
Micro Spatula
Needle Nose forceps
Petri Dish	Pyrex
Primetime Primer for Aldolase C	IDT	Mm.PT.58>43415246
Primetime Primer for Kcng4	IDT	Mm.PT.56a.9448518
Primetime Primer for Parvalbumin	IDT	Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18	IDT	Mm.PT.58.12109666
Single Edge Rzor Blades	Personna GEM
Sterile, sigle-use pestles	FisherScientific	12141364
TRIzol Reagent	Ambion by Life technologies	15596018
Vascular Scissors