Aislamiento De Células De La Válvula Intersticial De Ratón Para Estudiar La Calcificación De La Válvula Aórtica In Vitro

Resumen

Este artículo describe el aislamiento de las células de la válvula aórtica del ratón por un procedimiento de dos pasos de la colagenasa. Las células aisladas de la válvula de ratón son importantes para realizar diferentes ensayos, como este ensayo de calcificación in vitro, y para investigar las vías moleculares que conducen a la mineralización de la válvula aórtica.

Resumen

La calcificación de las células de la válvula aórtica es el sello de la estenosis aórtica y se asocia a fibrosis de la cúspide de la válvula. Las células intersticiales valvulares (VIC) juegan un papel importante en el proceso de calcificación en la estenosis aórtica a través de la activación de su programa de desdiferenciación a células osteoblasto-similares. Los VICs de ratón son una buena herramienta in vitro para la elucidación de las vías de señalización que impulsan la mineralización de la célula de la válvula aórtica. El método descrito aquí, utilizado con éxito por estos autores, explica cómo obtener células recién aisladas. Un procedimiento de dos pasos de la colagenasa fue realizado con 1 mg/mL y 4.5 mg/mL. El primer paso es crucial para eliminar la capa de células endoteliales y evitar cualquier contaminación. La segunda incubación de colagenasa es para facilitar la migración de los VIC del tejido a la placa. Además, un procedimiento de coloración de la inmunofluorescencia para la caracterización del fenotipo de las células aisladas de la válvula del ratón se discute. Además, el análisis de la calcificación fue realizado in vitro usando el procedimiento de la medida del reactivo del calcio y la coloración roja del alizarin. El uso del cultivo primario de células de válvulas de ratón es esencial para probar nuevas dianas farmacológicas para inhibir la mineralización celular in vitro.

Introducción

La valvulidad aórtica calcificada (CAVD) es la cardiopatía valvular más prevalente en poblaciones occidentales, afectando a casi el 2,5% de los ancianos mayores de 65 años^1. CAVD afecta a sobre seis millones de americanos y se asocia a los cambios en las propiedades mecánicas de los prospectos que empeoran la sangre normal fluir-a través^1,2. Actualmente, no existe ningún tratamiento farmacológico para detener la progresión de la enfermedad o para activar la regresión mineral. La única terapia eficaz para tratar la CAVD es el reemplazo de la válvula aórtica por cirugía o el reemplazo de la válvula aórtica transcatéter^3. Por lo tanto, es imperativo investigar los mecanismos moleculares que conducen a la mineralización valvular para identificar nuevas dianas farmacológicas. De hecho, la estenosis aórtica no tratada tiene varias consecuencias adversas como la disfunción del ventrículo izquierdo y la insuficiencia cardíaca^4.

La válvula aórtica consta de tres capas conocidas como fibrosa, espongiosa y ventricularis, que contienen VICs como la célula predominante tipo^5. La fibrosa y la ventricularis están cubiertas por una capa de células endoteliales vasculares (BIC)⁵. Los VÉS regulan la permeabilidad de las células inflamatorias, así como las señales paracrinas. El aumento del estrés mecánico puede afectar la integridad de los VE Y perturbar la homeostasis de la válvula aórtica, llevando a la invasión inflamatoria^{celular 6.} Los análisis de microscopía electrónica de barrido mostraron endotelio interrumpido en una válvula aórtica calcificada humana⁷.

Los análisis histológicos del tejido calcificado revelan la presencia de osteoblastos y de osteoclasts. Además, se observó diferenciación osteogénica de los VICs tanto in vitro como en el tejido valvular humano^8. Este proceso está orquestado principalmente por el factor de transcripción 2 relacionado con Runt (Runx2) y las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs)^8,9.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos animales descritos aquí han sido aprobados por la Escuela de Medicina Icahn en el núcleo institucional y el comité de uso de Mount Sinai.

1. Preparación antes del aislamiento de células valvulares de ratones adultos

1. Limpiar y esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos mostrados en la Figura 1A utilizando etanol al 70% v/v y posteriormente autoclavándolos durante 30 min.
2. Añadir 500 μL de penicilina-estreptomicina a 50 mL de HEPES de 10 mm. Preparar una alícuota de 50 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mantenga las soluciones en el hielo.
3. Prepare soluciones de colagenasa de 1 mg/mL y 4,5 mg/mL, y use 5 mL de cada solución en tubos de 15 mL para realizar todo el procedimiento. Para preparar 5 mL de 1 mg/mL de colagenasa, mezcle 5 mg de colagenasa con 2,5 mL de Medio Águila Modificado de Dulbecco (DMEM, suero fetal bovino (FBS)-libre) y 2,5 mL de 10 mM HEPES suplementado con antibióticos (1% penicilina-estreptomicina de la etapa 1.2). Filtre las soluciones a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar cualquier contaminación.
   NOTA: Mantenga las soluciones en hielo para proteger las enzimas.
4. Caliente la solución DMEM a 37 °C antes de su uso en todos los pasos descritos a continuación. Prepare el medio completo complementando DMEM con 1% penicilina-estreptomicina, 1% piruvato de sodio, 5 mL de L-glutamina de 200 mM, 1 mL de reactivo de eliminación de micoplasma (ver la Tabla de Materiales),y 10% FBS.

2. Aislamiento de las células valvulares

1. Para obtener 10⁶ células para el experimento, utilice cinco ratones de 8 semanas de edad (mínimo de tres). Coloque el ratón en una cámara de inducción junto con un pequeño trozo de papel tisú empapado con 1 mL de isoflurano, pero no permita el contacto con el tejido. Confirmar que el animal está completamente anestesiado; compruebe si hay reflejo de pellizco en el dedo deldo deldo del ratón, y luego eutanasiar el ratón por dislocación cervical. Utilice isoflurano para aliviar cualquier dolor antes de la dislocación cervical, ya que el procedimiento descrito a continuación es terminal.
2. Coloque el ratón en una plataforma de disección y fije las patas con cánulas para mantenerlo en su lugar. Limpie el pecho y el abdomen con etanol; abra el abdomen y el pecho con unas tijeras. Con pequeñas tijeras quirúrgicas, corte entre la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo para exsanguinar el ratón. Perfunda el corazón con 10 mL de PBS frío 1x para eliminar la sangre del corazón.
3. Cortar el corazón, y mantener 3 mm de la aorta ascendente como se muestra en la Figura 1B. Diseccione la válvula aórtica bajo un estereomicroscopio. Cortar el corazón horizontalmente en el centro de los ventrículos (Figura 1C). Cortar el ventrículo izquierdo hacia la aorta, y diseccionar cuidadosamente la válvula aórtica (Figura 1D-F). Acomente las válvulas en un pequeño plato de cultivo de tejidos de 35 mm.
4. Lavar las válvulas aisladas en un plato de cultivo celular de 75 mm con 5 mL de HEPES frío (10 mM) suplementado con antibióticos (1% penicilina-estreptomicina) para eliminar la sangre(Figura 2). Prepare dos tubos de 15 mL de colagenasa 1 mg/mL y 4,5 mg/mL como se describió anteriormente en el paso 1.3.
   NOTA: Después de la disección, manipule las válvulas aisladas en una campana de bioseguridad estéril para minimizar la contaminación.
5. Incubar las válvulas en colagenasa tipo I (1 mg/mL) durante 30 min a 37 °C con agitación continua (Figura 2). Centrifugar el tubo durante 5 min a 150 × g,lavar el pellet una vez con 2 mL de HEPES (10 mM), y vórtice durante 30 s a alta velocidad. Vierta el contenido de este tubo en un plato de cultivo de 35 mm y transfiera cuidadosamente los fragmentos de tejido utilizando pinzas delgadas a un nuevo tubo.
   NOTA: En esta etapa, los VICs todavía no están disociados del tejido, y el pellet contiene pedazos de tejido. Para evitar la contaminación con células endoteliales, no centrífuga después del vórtice en el paso 2.5.
6. Incubar el pellet en un tubo de 15 mL con 5 mL de colagenasa tipo I (4,5 mg/mL) a 37 °C bajo agitación continua durante 35 min. Vuelva a suspender las células con una pipeta de 1 mL para separar las células y centrífuga a 150 × g durante 5 min a 4 °C.
7. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 2 mL de DMEM completo. Centrífuga a 150 × g durante 5 min a 4 °C. Repita este paso dos veces para limpiar las celdas.
   NOTA: El pellet todavía tendrá algunos fragmentos de tejido.
8. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio completo, y platee las células en un pozo de un plato de cultivo celular de 6 pozos en una cantidad mínima de medio para facilitar su fijación al plato de cultivo. Deje las células, sin ser molestadas, en una incubadora de 37 °C con un 5% de dióxido de carbono.
9. Después de 3 días, revise las células bajo el microscopio para verificar un buen crecimiento cerca de los restos de tejido. Una vez que 1,000 células sean visibles bajo el microscopio, retire cuidadosamente los desechos de tejido con pinzas en autoclave y cambie el medio.
   NOTA: La placa no debe ser perturbada; si no se observa el número requerido de células, coloque el plato de cultivo celular de nuevo en la incubadora durante otros 2 días.
10. Cuando las células son 70% confluentes (2,5 × 10⁵), tripsinizar y luego transferirlos a un plato de cultivo de tejidos de 75 mm.

3. Análisis de la identidad celular y morfología

NOTA: La coloración de la inmunofluorescencia fue utilizada para estudiar morfología de la célula y la contaminación endotelial de la célula.

1. Limpie la campana con etanol al 70% v/v/. Coloque las tapas estériles (22 mm x 22 mm) en placas de 6 pozos.
   NOTA: Para esterilizar las cubiertas, lávelas con etanol al 70% y manténgalas en el capó durante la noche bajo luz ultravioleta.
2. Semilla de 100.000 células por pozo en una placa de 6 pozos. Después de 24 h, lave las células dos veces en 1x PBS, y fijarlas en paraformadehído al 4% (PFA) durante 20 min. Lave las células de nuevo dos veces con 1x PBS.
   NOTA: En este punto, las células podrían mantenerse en PBS a 4 °C hasta el inicio del procedimiento de tinción.
3. Para verificar la pureza de los VICs, utilice actina alfa-músculo liso (αSMA), vimentina y racimo de diferenciación 31 (CD31) para detectar la contaminación con VÉS.
4. Preparar una alícuota de tampón de bloqueo mezclando 500 μL de suero normal (la misma especie que el anticuerpo secundario), 9,5 mL de 1x PBS y 30 μL de Triton X-100. Incubar las células en 2 mL del tampón bloqueador durante 1 h.
5. Preparar el tampón de dilución de anticuerpos que contenga 30 μL de Tritón X-100, 10 mL de 1x PBS y 0,1 g de albúmina sérica bovina (BSA).
6. Tome una caja de puntas vacía, llene la mitad de la caja con agua para crear una cámara húmeda. Cubra el soporte de la punta con un pañuelo húmedo y luego con una hoja de parafilm.
7. Tomar 1 μL del anticuerpo primario y mezclarlo con 100 μL del tampón de dilución preparado en el paso 3.5. Coloque 50 μL del anticuerpo diluido en la parapelícula. Tome las cubiertas de los pozos, voltéelos y colótelos en la parte superior de las gotas de anticuerpos; incubar las células durante la noche con el anticuerpo.
8. Agregue 1 mL de PBS en la placa de 6 pozos. Saque cuidadosamente el cubrebocas del parafilm, voltéalo y colóquelo en el pozo. Lave las células con una agitación suave continua durante 5 min. Sustitúyase el SBP por un SBP fresco; lave las células 3 veces.
9. Incubar las células con el anticuerpo secundario diluido (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) durante 1 h. Añadir 1 μL del anticuerpo secundario a 500 μL del tampón de dilución del anticuerpo (preparado en el paso 3.5). Cubra la placa con papel de aluminio. Lavar las células 3 veces con 1 mL de 1x PBS con agitación continua.
10. Monte las cubiertas con 50 μL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)-medio de montaje, y observe las células bajo el microscopio para analizar la morfología de las células y la contaminación por VEC.

4. Ensayo de calcificación in vitro

1. Limpie la campana con etanol al 70%, caliente el medio DMEM a 37 °C.
2. Semilla 100.000 células/condición en placas de 6 pozos en DMEM completo, y cultivo durante 24 h a 37 °C.
3. Preparar el medio calcificante mezclando 2 mM de NaH₂PO_4,10^-7 M de insulina y 50 μg/mL de ácido ascórbico en DMEM con FBS al 5%. Para 93 mL de DMEM, añadir 5 mL de FBS, 1 mL de antibióticos (concentración final 1%), 1 mL de piruvato de sodio (100 mM), 27,5 mg de NaH₂PO_4, 5,8 μL de insulina y 5 mg de ácido ascórbico.
   NOTA: Filtre la solución con un filtro de 0,22 μm antes de su uso.
4. Después de 24 h, substituya el medio sobrenadante por el medio calcificante. Incubar las células durante 7 días a 37 °C. En el^3er día, reemplazar con medio calcificante fresco, y colocar la placa de nuevo en la incubadora para completar los 7 días de tratamiento.
5. Después de 7 días, retire el medio y lave las células dos veces con 2 mL de 1x PBS. Incubar las células en 1 mL de ácido clorhídrico (HCl) de 0,6 N durante 24 h a 37 °C. Recoger el HCl en un tubo de 1,5 mL, y evaporarlo en un evaporador rotatorio. Vuelva a suspender el contenido de todos los tubos en 60 μL de HCl.
   NOTA: El procedimiento de secado es importante para concentrar la solución y tener el mismo volumen para cada condición.
6. Use una placa de 96 pozos para medir la concentración de calcio mediante el uso del reactivo Arsenazo III, disponible en un kit listo para usar (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
7. Prepare una solución estándar de calcio de 10 mg/dL de concentración. Pesar 10 mg de hidróxido de calcio (Ca(OH)₂₎y disolver en 100 mL de agua destilada.
8. En una placa transparente de 96 pozos, pipeta 2 μL de solución en blanco (HCl, 0,6 N), la solución estándar, la muestra por pozo (10 mg/dL) y las muestras. Realice el experimento por triplicado para verificar la variabilidad del pipeteo. Agregue 200 μL del reactivo para cada afección.
   NOTA: Las muestras por encima de 15 mg/dL deben diluirse 1:1 con solución salina, volver a ensayarse y el resultado debe multiplicarse por dos.
9. Incubar la reacción durante 15 min a temperatura ambiente.
   NOTA: La reacción es estable durante 60 min.
10. Lea y registre la absorbancia de la placa a 650 nm. Utilice la siguiente fórmula para calcular la cantidad de calcio en las muestras:
    Calcio (mg/mL) = (Absorbancia de la muestra/absorbancia de la norma) × Concentración de la norma

Resultados

Como las válvulas aórticas murinas tienen típicamente 1 mm de diámetro, se deben agrupar al menos tres válvulas para recolectar un millón de células viables para diferentes procedimientos experimentales. Los diferentes pasos del proceso de aislamiento de VIC se muestran en la Figura 1 y la Figura 2. Como es difícil raspar manualmente el tejido de la válvula, es preferible utilizar la tensión de cizallamiento creada por el vórtice para eliminar los VÉ...

Discusión

Este artículo presenta un protocolo detallado del aislamiento de la célula de la válvula del ratón para la cultura primaria. Tres válvulas aórticas de ratones de 8 semanas de edad se agruparon para obtener un número adecuado de células. Además, este protocolo describe la caracterización del fenotipo VIC y el ensayo de mineralización in vitro. El método fue adaptado del protocolo previamente descrito de Mathieu et al.^7.

Durante el aislamien...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm cutting edge scissors	F.S.T	15000-00
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody	abcam
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate	Cell Signaling	4412
Arsenazo-III reagent set	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	a Kit to measure the concentration of calcium
Bonn Scissors	F.S.T	14184-09
Calcium hydroxide	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Collagenase type I  (125 units/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
Extra fine graefe forceps	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
Fine forceps	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M solution	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Mycoplasma elimination reagent
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Sodium Pyruvate 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
Standard pattern forceps	F.S.T	11000-12
Surgical Scissors - Sharp-Blunt	F.S.T	14008-14
Trypsin 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam