Выделение клеток интерстициального клапана мыши для изучения кальцификации аортального клапана in vitro

Резюме

В этой статье описывается изоляция клеток аортального клапана мыши с помощью двухэтапной коллагеназы. Изолированные клетки мышиного клапана важны для выполнения различных анализов, таких как этот анализ кальцификации in vitro, и для исследования молекулярных путей, ведущих к минерализации аортального клапана.

Аннотация

Кальцификация клеток аортального клапана является отличительной чертой аортального стеноза и связана с фиброзом клапанного куспида. Клапанные интерстициальные клетки (ВИК) играют важную роль в процессе кальцификации при стенозе аорты путем активации их программы дедифференциации к остеобластоподобным клеткам. Мышиные ВИК являются хорошим инструментом in vitro для выяснения сигнальных путей, приводящих к минерализации клетки аортального клапана. Способ, описанный в настоящем описании, успешно используемый этими авторами, объясняет, как получить свежеизолированные клетки. Двухэтапная процедура коллагеназы проводилась с 1 мг/мл и 4,5 мг/мл. Первый шаг имеет решающее значение для удаления слоя эндотелиальных клеток и предотвращения любого загрязнения. Вторая инкубация коллагеназы предназначена для облегчения миграции ВИК из ткани в пластину. Кроме того, обсуждается процедура иммунофлуоресцентного окрашивания для фенотипной характеристики изолированных клеток мышиного клапана. Кроме того, анализ кальцификации проводили in vitro с использованием процедуры измерения кальциевого реагента и окрашивания ализарином красным цветом. Использование первичной культуры клеток мышиного клапана имеет важное значение для тестирования новых фармакологических мишеней для ингибирования минерализации клеток in vitro.

Введение

Кальцинированная болезнь аортального клапана (CAVD) является наиболее распространенным заболеванием клапанного сердца в западных популяциях, затрагивающим почти 2,5% пожилых людей старше 65 лет¹года. CAVD поражает более шести миллионов американцев и связан с изменениями механических свойств листочков, которые ухудшают нормальный кровоток -^1,2. В настоящее время не существует фармакологического лечения, чтобы остановить прогрессирование заболевания или активировать минеральную регрессию. Единственной эффективной терапией для лечения CAVD является замена аортального клапана хирургическим путем или транскатетерная замена аортального клапана^3. Поэтому крайне важно исследовать молекулярные механизмы, ведущие к минерализации клапанов, для выявления новых фармакологических мишеней. Действительно, нелеченный стеноз аорты имеет несколько неблагоприятных последствий, таких как дисфункция левого желудочка и сердечная недостаточность^4.

Аортального клапана состоит из трех слоев, известных как фиброза, губчатая и желудочковая, которые содержат ВИК как преобладающий тип клеток^5. Фиброза и желудочковые покрыты слоем эндотелиальных клеток сосудов (VEC)^5. VEC регулируют проницаемость воспалительных клеток, а также паракринные сигналы. Повышенное механическое напряжение может повлиять на целостность VEC и нарушить гомеостаз аортального клапана, что приводит к воспалительной инвазии клеток^6. Анализ сканирующей электронной микроскопии показал нарушение эндотелия в кальцинированном аортального клапане человека^7.

Гистологические анализы кальцинированной ткани выявляют наличие остеобластов и остеокластов. Кроме того, остеогенная дифференцировка ВИК наблюдалась как in vitro, так и в ткани клапана человека^8. Этот процесс в основном управляется связанным с Runt фактором транскрипции 2 (Runx2) и костными морфогенетическими белками (BMP)^8,9.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры для животных, описанные здесь, были одобрены Медицинской школой Икана в Институциональном ядре и комитете по использованию горы Синай.

1. Подготовка перед изоляцией клеток клапана у взрослых мышей

1. Очистите и стерилизуйте все хирургические инструменты, показанные на рисунке 1А, используя 70% v/v этанола и впоследствии автоклавируя их в течение 30 мин. очистите хирургическое рабочее пространство 70% этанолом.
2. Добавьте 500 мкл пенициллина-стрептомицина к 50 мл 10 мм HEPES. Приготовьте аликвоту в 50 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Держите растворы на льду.
3. Приготовьте 1 мг/мл и 4,5 мг/мл растворов коллагеназы и используйте 5 мл каждого раствора в пробирках по 15 мл для выполнения всей процедуры. Чтобы приготовить 5 мл коллагеназы 1 мг/мл, смешайте 5 мг коллагеназы с 2,5 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM, фетальная бытовая сыворотка (FBS)-free) и 2,5 мл 10 мМ HEPES, дополненной антибиотиками (1% пенициллин-стрептомицин со ступени 1.2). Фильтруйте растворы через фильтр 0,22 мкм, чтобы удалить любые загрязнения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите растворы на льду для защиты ферментов.
4. Нагрейте раствор DMEM до 37 °C перед использованием на всех этапах, описанных ниже. Готовят полную среду, дополняя ДМЭМ 1% пенициллин-стрептомицин, 1% пируват натрия, 5 мл 200 мМ L-глутамина, 1 мл реагента для элиминации микоплазмы (см. Таблицу материалов)и 10% FBS.

2. Изоляция клапанных ячеек

1. Чтобы получить 10⁶ клеток для эксперимента, используйте пять 8-недельных мышей (минимум три). Поместите мышь в индукционную камеру вместе с небольшим кусочком папиросной бумаги, пропитанным 1 мл изофлурана, но не допускайте контакта с тканью. Подтвердить, что животное полностью обезболено; проверьте рефлекс щипа на ноготь, а затем усыплите мышь при вывихе шейки матки. Используйте изофлуран для облегчения любой боли до шейного вывиха, так как процедура, описанная ниже, является терминальной.
2. Поместите мышь на рассекающую платформу и зафиксируйте лапы канюлями, чтобы удерживать ее на месте. Очистить грудь и живот этанолом; открыть живот и грудь ножницами. С помощью небольших хирургических ножниц разрезают между левым предсердием и левым желудочком, чтобы отшлифовать мышь. Перфузировать сердце 10 мл холодного 1x PBS для удаления крови из сердца.
3. Отрежьте сердце и держитесь на 3 мм от восходящей аорты, как показано на рисунке 1B. Рассектать аортального клапана под стереомикроскопом. Разрезать сердце горизонтально в середине желудочков(рисунок 1С). Разрезайте левый желудочек по направлению к аорте и аккуратно рассекте аортального клапана(рисунок 1D-F). Объедините клапаны вместе в небольшую 35-миллиметровую чашку для культивирование тканей.
4. Промыть изолированные клапаны в чашке для культивации клеток 75 мм с 5 мл холодного HEPES (10 мМ), дополненного антибиотиками (1% пенициллин-стрептомицин) для удаления крови(рисунок 2). Подготовьте две пробирки по 15 мл коллагеназы 1 мг/мл и 4,5 мг/мл, как описано выше на этапе 1.3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После рассечения манипулируйте изолированными клапанами в стерильной вытяжке биобезопасности, чтобы свести к минимуму загрязнение.
5. Инкубировать клапаны в коллагеназе типа I (1 мг/мл) в течение 30 мин при 37 °C с непрерывным встряхиванием(рисунок 2). Центрифугируют трубку в течение 5 мин при 150 × г,промывают гранулу один раз 2 мл HEPES (10 мМ) и вихрь в течение 30 с на высокой скорости. Вылейте содержимое этой трубки в 35-миллиметровую культурную посуду, и аккуратно переложите фрагменты ткани тонким пинцетем в новую трубку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе ВИК все еще не диссоциированы от ткани, и гранула содержит кусочки ткани. Чтобы избежать загрязнения эндотелиальными клетками, не следует центрифугировать после вихря на этапе 2.5.
6. Инкубировать гранулы в пробирке 15 мл с 5 мл коллагеназы типа I (4,5 мг/мл) при 37 °C при непрерывном перемешивании в течение 35 мин. Повторно приостанавливают клетки с помощью пипетки 1 мл для разделения клеток и центрифуги при 150 × г в течение 5 мин при 4 °C.
7. Выбросьте супернатант и повторно суспендьте гранулу в 2 мл полного DMEM. Центрифуга при 150 × г в течение 5 мин при 4 °C. Повторите этот шаг дважды, чтобы очистить ячейки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула все еще будет иметь некоторые фрагменты ткани.
8. Повторно суспендрить гранулу в 1 мл полной среды и нанести ячейки на одну скважину чашки для культивирования клеток с 6 скважинами в минимальном количестве среды, чтобы облегчить их прикрепление к чашке для культивирования. Оставьте клетки нетронутыми в инкубаторе с 37 °C с 5% углекислого газа.
9. Через 3 дня проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться в хорошем росте вблизи тканевого мусора. Как только под микроскопом будет видно 1000 клеток, аккуратно удалите остатки тканей автоклавным пинцетем и измените среду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Табличку не следует беспокоить; если необходимое количество клеток не наблюдается, поместите чашку для культивации клеток обратно в инкубатор еще на 2 дня.
10. Когда клетки будут на 70% сливаться (2,5 × 10^5),попробуйте и затем перенесите их в 75 мм чашку для культивирование тканей.

3. Анализ идентичности и морфологии клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресцентное окрашивание использовалось для изучения морфологии клеток и загрязнения эндотелиальных клеток.

1. Очистите вытяжку с 70% v/v/ этанолом. Поместите стерильные крышки (22 мм х 22 мм) в 6-скважинные пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы стерилизовать крышки, промыть их 70% этанолом и держать в капюшоне на ночь под ультрафиолетовым светом.
2. Посеять 100 000 клеток на скважину в 6-скважинную пластину. Через 24 ч промыть клетки дважды в 1x PBS и зафиксировать их в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 20 мин. Дважды промыть ячейки с помощью 1x PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки могут храниться в PBS при 4 °C до начала процедуры окрашивания.
3. Чтобы проверить чистоту ВИК, используйте альфа-гладкомышечные актины (αSMA), виментин и кластер дифференцировки 31 (CD31) для обнаружения загрязнения VEC.
4. Приготовьте аликвоту блокирующего буфера, перемешав 500 мкл нормальной сыворотки (того же вида, что и вторичное антитело), 9,5 мл 1x PBS и 30 мкл Triton X-100. Инкубируют клетки в 2 мл блокирующего буфера в течение 1 ч.
5. Готовят буфер разведения антител, содержащий 30 мкл тритона X-100, 10 мл 1x PBS и 0,1 г бычих сывороточных альбуминов (BSA).
6. Возьмите пустую коробку с наконечниками, заполните половину коробки водой, чтобы создать влажную камеру. Накройте держатель наконечника влажной тканью, а затем листом парапленки.
7. Возьмите 1 мкл первичного антитела и смешайте его со 100 мкл буфера разведения, приготовленного на этапе 3,5. Поместите 50 мкл разбавленного антитела на парапленку. Возьмите крышки из колодцев, переверните их и поместите сверху капли антител; инкубируют клетки в течение ночи с антителом.
8. Добавьте 1 мл PBS в 6-скважинную пластину. Осторожно выньте крышку из парапленки, переверните ее и поместите в колодец. Промыть клетки непрерывным мягким перемешиванием в течение 5 мин. Замените PBS на свежий PBS; промыть клетки 3 раза.
9. Инкубируют клетки с разбавленным вторичным антителом (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) в течение 1 ч. Добавьте 1 мкл вторичного антитела к 500 мкл буфера разбавления антител (полученный на этапе 3.5). Накройте пластину алюминиевой фольгой. Промыть клетки 3 раза 1 мл 1x PBS с непрерывным перемешиванием.
10. Установите крышки с 50 мкл 4',6-диамидино-2-фенилиндол(DAPI)-монтажной средой и наблюдайте за клетками под микроскопом для анализа морфологии клеток и загрязнения VEC.

4. Анализ кальцификации in vitro

1. Очистите вытяжку 70% этанолом, прогрейте среду DMEM до 37 °C.
2. Посейте 100 000 клеток/кондицион в 6-скважинные пластины в полном DMEM и культивируете в течение 24 ч при 37 °C.
3. Готовят кальцифицирующую среду, смешивая 2 мМ₂PO_4,10^{-7 М} инсулина и 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты в ДМЭМ с 5% FBS. К 93 мл ДМЭМ добавляют 5 мл ФБС, 1 мл антибиотиков (конечная концентрация 1%), 1 мл пирувата натрия (100 мМ), 27,5 мг₂РО_4, 5,8 мкл инсулина и 5 мг аскорбиновой кислоты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтруйте раствор с помощью фильтра 0,22 мкм перед использованием.
4. Через 24 ч замените надмную среду на кальцифицивную среду. Инкубировать клетки в течение 7 дней при 37 °C. На^3-й день замените свежей кальцифицирующим средством и поместите пластину обратно в инкубатор, чтобы завершить 7 дней лечения.
5. Через 7 дней удалите среду и дважды промыть клетки 2 мл 1x PBS. Инкубируют клетки в 1 мл 0,6 Н соляной кислоты (HCl) в течение 24 ч при 37 °C. Соберите HCl в трубку 1,5 мл и испарите его во вращательном испарителе. Повторно приостановить содержание всех пробирок в 60 мкл HCl.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура сушки важна для концентрации раствора и одинакового объема для каждого состояния.
6. Используйте 96-скважинную пластину для измерения концентрации кальция с помощью реагента Arsenazo III, доступного в готовом к использованию наборе (см. Таблицу материалов для получения более подробной информации).
7. Готовят стандартный раствор кальция концентрацией 10 мг/дл. Взвесить 10 мг гидроксида кальция (Ca(OH)₂) и растворить в 100 мл дистиллированной воды.
8. В прозрачной 96-скважинной пластине пипеткуют 2 мкл заготовочного раствора (HCl, 0,6 Н), стандартный раствор, образец на скважину (10 мг/дл) и образцы. Выполните эксперимент в трех вариациях, чтобы проверить изменчивость дозирования. Добавьте 200 мкл реагента для каждого состояния.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы с содержанием выше 15 мг/дл следует разбавлять физиологическим раствором 1:1, повторно провести анализ, а результат умножить на два.
9. Инкубируют реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция стабильна в течение 60 мин.
10. Считывание и запись поглощения пластины при 650 нм. Используйте следующую формулу для расчета количества кальция в образцах:
    Кальций (мг/мл) = (Поглощение образца/поглощение стандартного) × Концентрация стандартного

Результаты

Поскольку мышиные аортальные клапаны обычно имеют диаметр 1 мм, по крайней мере три клапана должны быть объединены, чтобы собрать миллион жизнеспособных клеток для различных экспериментальных процедур. Различные этапы процесса изоляции ВМЦ показаны на рисунках 1 и

Обсуждение

В этой статье представлен подробный протокол изоляции клеток мышиного клапана для первичной культуры. Три аортального клапана у 8-недельных мышей были объединены для получения достаточного количества клеток. Кроме того, этот протокол описывает характеристику фенотипа ВИЦ и анализ ми?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm cutting edge scissors	F.S.T	15000-00
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody	abcam
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate	Cell Signaling	4412
Arsenazo-III reagent set	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	a Kit to measure the concentration of calcium
Bonn Scissors	F.S.T	14184-09
Calcium hydroxide	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Collagenase type I  (125 units/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
Extra fine graefe forceps	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
Fine forceps	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M solution	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Mycoplasma elimination reagent
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Sodium Pyruvate 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
Standard pattern forceps	F.S.T	11000-12
Surgical Scissors - Sharp-Blunt	F.S.T	14008-14
Trypsin 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam