Isolement des cellules valvulaires interstitielles de souris pour étudier la calcification de la valve aortique in vitro

Résumé

Cet article décrit l’isolement des cellules de valve aortique de souris par un procédé en deux étapes de collagénase. Les cellules valvulaires isolées de la souris sont importantes pour effectuer différents essais, tels que ce test de calcification in vitro, et pour étudier les voies moléculaires menant à la minéralisation de la valve aortique.

Résumé

La calcification des cellules de valve aortique est le cachet de la sténose aortique et est associée à la fibrose de cuspide de valve. Les cellules interstitielles valvulaires (VICs) jouent un rôle important dans le processus de calcification dans la sténose aortique par l’activation de leur programme de dédifférenciation aux cellules osteoblast-comme. Les circuits vit de souris sont un bon outil in vitro pour l’élucidation des voies de signalisation conduisant à la minéralisation de la cellule valvulaire aortique. La méthode décrite ici, utilisée avec succès par ces auteurs, explique comment obtenir des cellules fraîchement isolées. Un procédé en deux étapes de collagénase a été exécuté avec 1 mg/mL et 4.5 mg/mL. La première étape est cruciale pour enlever la couche cellulaire endothéliale et éviter toute contamination. La deuxième incubation de la collagénase consiste à faciliter la migration des CCI du tissu vers la plaque. En outre, un procédé de souillure d’immunofluorescence pour la caractérisation de phénotype des cellules d’isolement de valve de souris est discuté. En outre, l’analyse de calcification a été exécutée in vitro en utilisant le procédé de mesure de réactif de calcium et la souillure rouge d’alizarin. L’utilisation de la culture primaire de cellules de valve de souris est essentielle pour tester de nouvelles cibles pharmacologiques afin d’inhiber la minéralisation cellulaire in vitro.

Introduction

La valvulopathie aortique calcifiée (CAVD) est la maladie cardiaque valvulaire la plus répandue dans les populations occidentales, affectant près de 2,5 % des personnes âgées de plus de 65 ans^1. Le CAVD affecte plus de six millions d’Américains et est associé à des changements dans les propriétés mécaniques des folioles qui altèrent le flux sanguin normal^1,2. Actuellement, il n’existe aucun traitement pharmacologique pour arrêter la progression de la maladie ou pour activer la régression minérale. La seule thérapie efficace pour traiter le CAVD est le remplacement de la valve aortique p....

Protocole

REMARQUE: Toutes les procédures animales décrites ici ont été approuvées par l’École de médecine Icahn du noyau institutionnel et du comité d’utilisation du Mont Sinaï.

1. Préparation avant l’isolement des cellules valvulaires de souris adultes

1. Nettoyer et stériliser tous les instruments chirurgicaux illustrés à la figure 1A en utilisant 70% d’éthanol v/v et ensuite les autoclaver pendant 30 min. nettoyer l’espace de travail chirurgical avec 70% d’éthanol.
2. Ajouter 500 μL de pénicilline-streptomycine à 50 mL de HEPES de 10 mm. Préparer une partie aliquote de 50 mL de 1x solution saline tampon....

Résultats

Comme les valves aortiques murines mesurent généralement 1 mm de diamètre, au moins trois valves doivent être regroupées pour recueillir un million de cellules viables pour différentes procédures expérimentales. Les différentes étapes du processus d’isolation VIC sont illustrées à la figure 1 et à la figure 2. Comme il est difficile de gratter manuellement le tissu valvulaire, il est préférable d’utiliser le stress de cisaillement créé par l.......

Discussion

Cet article présente un protocole détaillé d’isolement de cellules de valve de souris pour la culture primaire. Trois valves aortiques de souris de 8 semaines ont été mises en commun pour obtenir un nombre proportionné de cellules. De plus, ce protocole décrit la caractérisation du phénotype VIC et l’analyse de minéralisation in vitro. La méthode a été adaptée du protocole précédemment décrit de Mathieu et al.^7.

Lors de l’isolem.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm cutting edge scissors	F.S.T	15000-00
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody	abcam
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate	Cell Signaling	4412
Arsenazo-III reagent set	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	a Kit to measure the concentration of calcium
Bonn Scissors	F.S.T	14184-09
Calcium hydroxide	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Collagenase type I  (125 units/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
Extra fine graefe forceps	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
Fine forceps	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M solution	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x	Thermofisher Scientific	25030081
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Mycoplasma elimination reagent
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Sodium Pyruvate 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
Standard pattern forceps	F.S.T	11000-12
Surgical Scissors - Sharp-Blunt	F.S.T	14008-14
Trypsin 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam