Isolierung von interstitiellen Klappenzellen der Maus zur Untersuchung der Verkalkung der Aortenklappe in vitro

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Isolierung von Aortenklappenzellen der Maus durch ein zweistufiges Kollagenase-Verfahren. Isolierte Mausklappenzellen sind wichtig für die Durchführung verschiedener Assays, wie diesen In-vitro-Verkalkungsassay, und für die Untersuchung der molekularen Wege, die zur Aortenklappenmineralisierung führen.

Zusammenfassung

Die Verkalkung von Aortenklappenzellen ist das Kennzeichen der Aortenstenose und ist mit klappenhekrose Fibrose verbunden. Valve Interstitial Cells (VICs) spielen eine wichtige Rolle im Verkalkungsprozess bei Aortenstenosen durch die Aktivierung ihres Dedifferenzierungsprogramms gegenüber osteoblastenähnlichen Zellen. Maus-VICs sind ein gutes In-vitro-Werkzeug zur Aufklärung der Signalwege, die die Mineralisierung der Aortenklappenzelle vorantreiben. Die hier beschriebene Methode, die von diesen Autoren erfolgreich eingesetzt wird, erklärt, wie man frisch isolierte Zellen erhält. Ein zweistufiges Kollagenase-Verfahren wurde mit 1 mg/ml und 4,5 mg/ml durchgeführt. Der erste Schritt ist entscheidend, um die Endothelzellschicht zu entfernen und jegliche Kontamination zu vermeiden. Die zweite Kollagenase-Inkubation soll die Migration von VICs vom Gewebe zur Platte erleichtern. Darüber hinaus wird ein Immunfluoreszenz-Färbeverfahren zur Phänotypcharakterisierung der isolierten Mausklappenzellen diskutiert. Darüber hinaus wurde der Verkalkungsassay in vitro unter Verwendung des Calciumreagenz-Messverfahrens und der Alizarinrotfärbung durchgeführt. Die Verwendung von Mausklappenzellprimialkultur ist unerlässlich, um neue pharmakologische Ziele zur Hemmung der Zellmineralisierung in vitro zu testen.

Einleitung

Die verkalkte Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist die häufigste Herzklappenerkrankung in der westlichen Bevölkerung und betrifft fast 2,5% der älteren Menschen über 65 Jahre¹. CAVD betrifft über sechs Millionen Amerikaner und ist mit Veränderungen der mechanischen Eigenschaften der Blättchen verbunden, die den normalen Blutfluss beeinträchtigen^1,2. Derzeit gibt es keine pharmakologische Behandlung, um das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen oder die Mineralregression zu aktivieren. Die einzige wirksame Therapie zur Behandlung von CAVD ist der Aortenklappenersatz durch Operation oder der Transkatheter-Aortenklappenersatz³. Es ist daher unerlässlich, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die zur Klappenmineralisierung führen, um neue pharmakologische Ziele zu identifizieren. In der Tat hat eine nicht behandelte Aortenstenose mehrere nachteilige Folgen wie Funktionsstörungen des linken Ventrikels und Herzinsuffizienz⁴.

Die Aortenklappe besteht aus drei Schichten, die als Fibrosa, Spongiosa und Ventricularis bekannt sind und VICs als vorherrschenden Zelltyp⁵enthalten. Die Fibrosa und die Ventricularis sind von einer Schicht vaskulärer Endothelzellen (VECs) bedeckt⁵. Die VECs regulieren die Durchlässigkeit von Entzündungszellen sowie parakrine Signale. Erhöhte mechanische Belastung kann die Integrität der VECs beeinträchtigen und die Homöostase der Aortenklappe stören, was zu einer entzündlichen Zellinvasion führt⁶. Rasterelektronenmikroskopische Analysen zeigten gestörtes Endothel in einer menschlichen verkalkten Aortenklappe⁷.

Histologische Analysen von verkalktem Gewebe zeigen das Vorhandensein von Osteoblasten und Osteoklasten. Weiterhin wurde eine osteogene Differenzierung von VICs sowohl in vitro als auch im menschlichen Klappengewebe beobachtet⁸. Dieser Prozess wird hauptsächlich durch den Runt-verwandten Transkriptionsfaktor 2 (Runx2) und die knochenmorphogenetischen Proteine (BMPs)^8,9orchestriert.

Protokoll

HINWEIS: Alle hier beschriebenen Tierverfahren wurden von der Icahn School of Medicine am Mount Sinai Institutional Core and Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung vor der Ventilzellisolierung von erwachsenen Mäusen

1. Reinigen und sterilisieren Sie alle in Abbildung 1A gezeigten chirurgischen Instrumente, indem Sie 70% v/v Ethanol verwenden und anschließend 30 min. autoklavieren. Reinigen Sie den chirurgischen Arbeitsbereich mit 70% Ethanol.
2. 500 μL Penicillin-Streptomycin zu 50 ml 10 mm HEPES hinzufügen. Bereiten Sie ein Aliquot von 50 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. Halten Sie die Lösungen auf Eis.
3. Bereiten Sie 1 mg / ml und 4,5 mg / ml Kollagenaselösungen vor und verwenden Sie 5 ml jeder Lösung in 15 ml Röhrchen, um das gesamte Verfahren durchzuführen. Um 5 ml 1 mg/ml Kollagenase herzustellen, mischen Sie 5 mg Kollagenase mit 2,5 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM, fetales Rinderserum (FBS)-frei) und 2,5 ml 10 mM HEPES, ergänzt mit Antibiotika (1% Penicillin-Streptomycin aus Schritt 1.2). Filtern Sie die Lösungen durch einen 0,22 μm-Filter, um Verunreinigungen zu entfernen.
   HINWEIS: Halten Sie die Lösungen auf Eis, um die Enzyme zu schützen.
4. Erwärmen Sie die DMEM-Lösung vor dem Gebrauch in allen unten beschriebenen Schritten auf 37 °C. Bereiten Sie das vollständige Medium vor, indem Sie DMEM mit 1% Penicillin-Streptomycin, 1% Natriumpyruvat, 5 ml 200 mM L-Glutamin, 1 ml Mykoplasmenelimineliminierungsreagenz (siehe Materialtabelle)und 10% FBS ergänzen.

2. Isolierung von Klappenzellen

1. Um 10⁶ Zellen für das Experiment zu erhalten, verwenden Sie fünf 8 Wochen alte Mäuse (mindestens drei). Legen Sie die Maus zusammen mit einem kleinen Stück Seidenpapier, das mit 1 ml Isofluran getränkt ist, in eine Induktionskammer, lassen Sie jedoch keinen Kontakt mit dem Gewebe zu. Um zu bestätigen, dass das Tier vollständig betäubt ist; Überprüfen Sie auf Zehenquetschreflex und euthanasieren Sie dann die Maus durch zervikale Luxation. Verwenden Sie Isofluran, um Schmerzen vor der zervikalen Dislokation zu lindern, da das unten beschriebene Verfahren terminal ist.
2. Platzieren Sie die Maus auf einer Sezierplattform und fixieren Sie die Pfoten mit Kanülen, um sie an Ort und Stelle zu halten. Reinigen Sie die Brust und den Bauch mit Ethanol; Öffnen Sie den Bauch und die Brust mit einer Schere. Schneiden Sie mit einer kleinen chirurgischen Schere zwischen dem linken Vorhof und dem linken Ventrikel, um die Maus zu exsanguieren. Perfundieren Sie das Herz mit 10 ml kaltem 1x PBS, um Blut aus dem Herzen zu entfernen.
3. Schneiden Sie das Herz ab, und halten Sie 3 mm von der aufsteigenden Aorta entfernt, wie in Abbildung 1B dargestellt. Sezieren Sie die Aortenklappe unter einem Stereomikroskop. Schneiden Sie das Herz horizontal in der Mitte der Ventrikel ab (Abbildung 1C). Schneiden Sie den linken Ventrikel in Richtung Aorta und sezieren Sie vorsichtig die Aortenklappe (Abbildung 1D-F). Die Ventile werden in einer kleinen 35 mm Gewebekulturschale zusammengepoolt.
4. Waschen Sie die isolierten Ventile in einer 75-mm-Zellkulturschale mit 5 ml kaltem HEPES (10 mM), ergänzt mit Antibiotika (1% Penicillin-Streptomycin), um Blut zu entfernen (Abbildung 2). Zwei 15-ml-Röhrchen Kollagenase 1 mg/ml und 4,5 mg/ml werden wie oben in Schritt 1.3 beschrieben hergestellt.
   HINWEIS: Manipulieren Sie nach der Dissektion die isolierten Ventile in einer sterilen Biosicherheitshaube, um die Kontamination zu minimieren.
5. Inkubieren Sie die Ventile in Kollagenase Typ I (1 mg/ml) für 30 min bei 37 °C unter kontinuierlichem Schütteln (Abbildung 2). Zentrifugieren Sie das Röhrchen für 5 min bei 150 × g,waschen Sie das Pellet einmal mit 2 mL HEPES (10 mM) und Wirbel für 30 s bei hoher Geschwindigkeit. Gießen Sie den Inhalt dieses Röhrchens in eine 35-mm-Kulturschale und übertragen Sie die Gewebefragmente vorsichtig mit einer dünnen Pinzette in ein neues Röhrchen.
   HINWEIS: In diesem Stadium sind die VICs immer noch nicht vom Gewebe getrennt, und das Pellet enthält Gewebestücke. Um eine Kontamination mit Endothelzellen zu vermeiden, zentrifugieren Sie nach dem Wirbeln in Schritt 2.5 nicht.
6. Das Pellet wird in einem 15 ml Röhrchen mit 5 ml Kollagenase Typ I (4,5 mg/ml) bei 37 °C unter kontinuierlicher Bewegung für 35 min inkubiert. Suspendieren Sie die Zellen mit einer 1-ml-Pipette erneut, um die Zellen zu trennen, und zentrifugieren Sie sie bei 150 × g für 5 min bei 4 °C.
7. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 2 ml vollständigem DMEM. Zentrifuge bei 150 × g für 5 min bei 4 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um die Zellen zu reinigen.
   HINWEIS: Das Pellet hat immer noch einige Gewebefragmente.
8. Suspendieren Sie das Pellet erneut in 1 ml vollständigem Medium und tafeln Sie die Zellen in einer Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturschale in einer minimalen Menge Medium, um ihre Anheftung an die Kulturschale zu erleichtern. Lassen Sie die Zellen ungestört in einem 37 °C-Inkubator mit 5% Kohlendioxid.
9. Überprüfen Sie nach 3 Tagen die Zellen unter dem Mikroskop, um ein gutes Wachstum in der Nähe der Gewebeablagerungen zu überprüfen. Sobald 1.000 Zellen unter dem Mikroskop sichtbar sind, entfernen Sie vorsichtig die Gewebetrümmer mit einer autoklavierten Pinzette und wechseln Sie das Medium.
   HINWEIS: Die Platte sollte nicht gestört werden; Wenn die erforderliche Anzahl von Zellen nicht eingehalten wird, legen Sie die Zellkulturschale für weitere 2 Tage wieder in den Inkubator.
10. Wenn die Zellen zu 70% konfluent sind (2,5 × 10^5),trypsinisieren und dann in eine 75 mm Gewebekulturschale überführen.

3. Analyse der Zellidentität und Morphologie

HINWEIS: Die Immunfluoreszenzfärbung wurde verwendet, um die Zellmorphologie und die Endothelzellkontamination zu untersuchen.

1. Reinigen Sie die Haube mit 70% v/v/ Ethanol. Sterile Abdeckrlips (22 mm x 22 mm) in 6-Well-Platten legen.
   HINWEIS: Um die Abdecklippen zu sterilisieren, waschen Sie sie mit 70% Ethanol und bewahren Sie sie über Nacht unter ultraviolettem Licht in der Haube auf.
2. Säen Sie 100.000 Zellen pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte. Nach 24 h waschen Sie die Zellen zweimal in 1x PBS und fixieren sie in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS erneut.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt konnten die Zellen bis zum Beginn des Färbevorgangs bei PBS bei 4 °C gehalten werden.
3. Um die Reinheit der VICs zu überprüfen, verwenden Sie Alpha-glatte Muskelaktin (αSMA), Vimentin und Differenzierungscluster 31 (CD31), um eine Kontamination mit VECs nachzuweisen.
4. Bereiten Sie ein Aliquot des Blockierenpuffers vor, indem Sie 500 μL normales Serum (die gleiche Spezies wie der sekundäre Antikörper), 9,5 ml 1x PBS und 30 μL Triton X-100 mischen. Inkubieren Sie die Zellen in 2 ml des Blockierpuffers für 1 h.
5. Bereiten Sie den Antikörperverdünnungspuffer vor, der 30 μL Triton X-100, 10 ml 1x PBS und 0,1 g Rinderserumalbumin (BSA) enthält.
6. Nehmen Sie eine leere Trinkgeldbox, füllen Sie die Hälfte der Box mit Wasser, um eine feuchte Kammer zu schaffen. Bedecken Sie den Spitzenhalter mit einem nassen Taschentuch und dann mit einem Blatt Parafilm.
7. Nehmen Sie 1 μL des primären Antikörpers und mischen Sie ihn mit 100 μL des in Schritt 3.5 hergestellten Verdünnungspuffers. Legen Sie 50 μL des verdünnten Antikörpers auf den Parafilm. Nehmen Sie die Coverlips aus den Vertiefungen, drehen Sie sie um und legen Sie sie auf die Oberseite der Antikörpertropfen; inkubieren Sie die Zellen über Nacht mit dem Antikörper.
8. Fügen Sie 1 ml PBS in die 6-Well-Platte hinzu. Nehmen Sie vorsichtig den Coverlip aus dem Parafilm, drehen Sie ihn um und legen Sie ihn in den Brunnen. Waschen Sie die Zellen mit einer kontinuierlichen sanften Erregung für 5 min. Ersetzen Sie pbS durch frisches PBS. waschen Sie die Zellen 3 mal.
9. Inkubieren Sie die Zellen mit dem verdünnten sekundären Antikörper (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) für 1 h. 1 μL des sekundären Antikörpers wird zu 500 μL des Antikörperverdünnungspuffers (hergestellt in Schritt 3.5) addiert. Decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab. Waschen Sie die Zellen 3 mal mit 1 ml 1x PBS bei kontinuierlichem Rühren.
10. Montieren Sie die Coverlips mit 50 μL 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Montagemedium und beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Morphologie der Zellen und die VEC-Kontamination zu analysieren.

4. In-vitro-Verkalkungsassay

1. Reinigen Sie die Haube mit 70% Ethanol, erwärmen Sie das DMEM-Medium auf 37 °C.
2. 100.000 Zellen/Zustand in 6-Well-Platten in komplettem DMEM aussäen und 24 h bei 37 °C kulturieren.
3. Das kalzifizierende Medium wird durch Mischen von 2 mM_NaH2PO_4,10^-7 M Insulin und 50 μg/ml Ascorbinsäure in DMEM mit 5% FBS zubereitet. Für 93 ml DMEM 5 ml FBS, 1 ml Antibiotika (Endkonzentration 1%), 1 ml Natriumpyruvat (100 mM), 27,5 mg_NaH2PO4, 5,8 μL Insulin und 5 mg Ascorbinsäure hinzufügen.
   HINWEIS: Filtern Sie die Lösung vor Gebrauch mit einem 0,22 μm-Filter.
4. Ersetzen Sie nach 24 h das überstandliche Medium durch das kalzifizierende Medium. Inkubieren Sie die Zellen für 7 Tage bei 37 °C. Am^3. Tag durch frisches kalzifizierendes Medium ersetzen und die Platte wieder in den Inkubator legen, um die 7 Tage der Behandlung abzuschließen.
5. Nach 7 Tagen entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml 1x PBS. Inkubieren Sie die Zellen in 1 ml 0,6 N Salzsäure (HCl) für 24 h bei 37 °C. Sammeln Sie das HCl in einem 1,5-ml-Rohr und verdampfen Sie es in einem Rotationsverdampfer. Hängen Sie den Inhalt aller Röhrchen in 60 μL HCl wieder auf.
   HINWEIS: Der Trocknungsprozess ist wichtig, um die Lösung zu konzentrieren und für jede Bedingung das gleiche Volumen zu haben.
6. Verwenden Sie eine 96-Well-Platte, um die Kalziumkonzentration mithilfe des Arsenazo III-Reagenzes zu messen, das in einem gebrauchsfertigen Kit erhältlich ist (weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle).
7. Bereiten Sie eine Calciumstandardlösung mit einer Konzentration von 10 mg / dl vor. 10 mg Calciumhydroxid (Ca(OH)2)_wiegenund in 100 ml destilliertem Wasser auflösen.
8. Pipetieren Sie in einer klaren 96-Well-Platte 2 μL Leerlösung (HCl, 0,6 N), die Standardlösung, die Probe pro Vertiefung (10 mg/dl) und die Proben. Führen Sie das Experiment dreifach durch, um die Pipettierungsvariabilität zu überprüfen. Fügen Sie 200 μL des Reagenzes für jede Bedingung hinzu.
   HINWEIS: Proben über 15 mg/dl sollten 1:1 mit Kochsalzlösung verdünnt, erneut untersucht und das Ergebnis mit zwei multipliziert werden.
9. Inkubieren Sie die Reaktion für 15 min bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Die Reaktion ist 60 Minuten lang stabil.
10. Lesen und erfassen Sie die Absorption der Platte bei 650 nm. Verwenden Sie die folgende Formel, um die Menge an Kalzium in den Proben zu berechnen:
    Calcium (mg/ml) = (Absorption der Probe/Absorption des Standards) × Konzentration des Standards

Ergebnisse

Da murine Aortenklappen typischerweise einen Durchmesser von 1 mm haben, müssen mindestens drei Klappen gebündelt werden, um eine Million lebensfähige Zellen für verschiedene experimentelle Verfahren zu sammeln. Die verschiedenen Schritte des VIC-Isolationsprozesses sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Da es schwierig ist, das Klappengewebe manuell abzukratzen, ist es vorzuziehen, die durch Wirbel erzeugte Scherspannung zu verwenden, um die VECs ...

Diskussion

Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll der Isolierung von Mausklappenzellen für die Primärkultur vor. Drei Aortenklappen von 8 Wochen alten Mäusen wurden gepoolt, um eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll die Charakterisierung des VIC-Phänotyps und den In-vitro-Mineralisierungsassay. Die Methode wurde aus dem zuvor beschriebenen Protokoll von Mathieu et al.⁷adaptiert.

Bei der Isolieru...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm cutting edge scissors	F.S.T	15000-00
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody	abcam
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate	Cell Signaling	4412
Arsenazo-III reagent set	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	a Kit to measure the concentration of calcium
Bonn Scissors	F.S.T	14184-09
Calcium hydroxide	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Collagenase type I  (125 units/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
Extra fine graefe forceps	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
Fine forceps	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M solution	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Mycoplasma elimination reagent
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Sodium Pyruvate 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
Standard pattern forceps	F.S.T	11000-12
Surgical Scissors - Sharp-Blunt	F.S.T	14008-14
Trypsin 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam