Isolamento delle celle della valvola interstiziale del topo per studiare la calcificazione della valvola aortica in vitro

Riepilogo

Questo articolo descrive l'isolamento delle cellule della valvola aortica del topo con una procedura in due fase di collagenasi. Le cellule isolate della valvola del topo sono importanti per eseguire diversi saggi, come questo saggio di calcificazione in vitro, e per studiare le vie molecolari che portano alla mineralizzazione della valvola aortica.

Abstract

La calcificazione delle cellule della valvola aortica è il segno distintivo della stenosi aortica ed è associata alla fibrosi della cuspide valvolare. Le cellule interstiziali valvolari (CCI) svolgono un ruolo importante nel processo di calcificazione nella stenosi aortica attraverso l'attivazione del loro programma di dedifferenziazione alle cellule simili agli osteoblasti. I VIC del topo sono un buon strumento in vitro per la spiegazione delle vie di segnalazione che guidano la mineralizzazione della cella della valvola aortica. Il metodo descritto nel presente documento, utilizzato con successo da questi autori, spiega come ottenere cellule appena isolate. È stata eseguita una procedura in due fase di collagenasi con 1 mg/mL e 4,5 mg/mL. Il primo passo è fondamentale per rimuovere lo strato cellulare endoteliale ed evitare qualsiasi contaminazione. La seconda incubazione di collagenasi è facilitare la migrazione dei CCI dal tessuto alla piastra. Inoltre, viene discussa una procedura di colorazione dell'immunofluorescenza per la caratterizzazione del fenotipo delle cellule isolate della valvola del topo. Inoltre, il saggio di calcificazione è stato eseguito in vitro utilizzando la procedura di misurazione del reagente del calcio e la colorazione rossa di alizarina. L'uso della coltura primaria delle celle della valvola del topo è essenziale per testare nuovi obiettivi farmacologici per inibire la mineralizzazione cellulare in vitro.

Introduzione

La malattia della valvola aortica calcificata (CAVD) è la malattia cardiaca valvulare più diffusa nelle popolazioni occidentali, che colpisce quasi il 2,5% degli individui anziani di età superiore ai 65^{anni 1}. CAVD colpisce oltre sei milioni di americani ed è associato a cambiamenti nelle proprietà meccaniche dei volantini che compromettono il normale flusso sanguigno^1,2. Attualmente, non esiste un trattamento farmacologico per fermare la progressione della malattia o attivare la regressione minerale. L'unica terapia efficace per trattare cavd è la sostituzione della valvola aortica con chirurgia o sostituzione della valvola aortica transcatetere³. È quindi indispensabile studiare i meccanismi molecolari che portano alla mineralizzazione delle valvole per identificare nuovi obiettivi farmacologici. In effetti, la stenosi aortica non trattata ha diverse conseguenze avverse come la disfunzione ventricolare sinistra e l'insufficienza^{cardiaca 4}.

La valvola aortica è costituita da tre strati noti come fibrosa, spongiosa e ventricolare, che contengono VIC come cellula predominante di^{tipo 5}. La fibrosa e il ventricolare sono coperti da uno strato di cellule endoteliali vascolari (CCI)⁵. I HC regolano la permeabilità delle cellule infiammatorie e dei segnali paracrini. L'aumento dello stress meccanico può influire sull'integrità dei CCI e disturbare l'omeostasi della valvola aortica, portando all'invasione infiammatoria delle^{cellule 6}. Le analisi della microscopia elettronica a scansione hanno mostrato endotelio interrotto in una valvola aortica calcificata umana⁷.

Le analisi istologiche del tessuto calcificato rivelano la presenza di osteoblasti e osteoclasti. Inoltre, è stata osservata la differenziazione osteogenica dei CCI sia in vitro che nel tessuto valvolare^{umano 8}. Questo processo è orchestrato principalmente dal fattore di trascrizione correlato a Runt 2 (Runx2) e dalle proteine morfogenetiche ossee (BMP)^8,9.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure animali qui descritte sono state approvate dalla Icahn School of Medicine presso il nucleo istituzionale del Monte Sinai e il comitato per l'uso.

1. Preparazione prima dell'isolamento delle cellule valvolare dai topi adulti

1. Pulire e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici mostrati nella figura 1A utilizzando il 70% v/v di etanolo e successivamente autoclavandoli per 30 minuti pulire lo spazio di lavoro chirurgico con il 70% di etanolo.
2. Aggiungere 500 μL di penicillina-streptomicina a 50 mL di HEPES da 10 mm. Preparare un'aliquota di 50 mL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Tieni le soluzioni sul ghiaccio.
3. Preparare soluzioni di collagenasi da 1 mg/ml e 4,5 mg/ml e utilizzare 5 ml di ciascuna soluzione in tubi da 15 ml per eseguire l'intera procedura. Per preparare 5 mL di 1 mg/mL di collagenasi, mescolare 5 mg di collagenasi con 2,5 mL del Medium aquila modificato di Dulbecco (DMEM, siero bovino fetale (FBS) e 2,5 mL di HEPES da 10 mM integrati con antibiotici (1% di penicillina-streptomicina dal passo 1.2). Filtrare le soluzioni attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere eventuali contaminazioni.
   NOTA: Conservare le soluzioni sul ghiaccio per proteggere gli enzimi.
4. Riscaldare la soluzione DMEM a 37 °C prima dell'uso in tutti i passaggi descritti di seguito. Preparare il mezzo completo integrando DMEM con 1% di penicillina-streptomicina, 1% piruvato di sodio, 5 mL di 200 mM L-glutammina, 1 mL di reagente di eliminazione del micoplasma (vedi tabella dei materiali)e 10% FBS.

2. Isolamento delle celle valvolare

1. Per ottenere 10⁶ cellule per l'esperimento, utilizzare cinque topi di 8 settimane (minimo tre). Posizionare il mouse in una camera di induzione insieme a un piccolo pezzo di carta velina imbevuto di 1 mL di isoflurana, ma non consentire il contatto con il tessuto. Per confermare che l'animale è completamente anestetizzato; controllare il riflesso del dito del dito del mouse, quindi eutanasiare il topo per lussazione cervicale. Utilizzare isoflurane per alleviare qualsiasi dolore prima della lussazione cervicale in quanto la procedura descritta di seguito è terminale.
2. Posizionare il mouse su una piattaforma di sezionazione e fissare le zampe con le cannule per tenerlo in posizione. Pulire il torace e l'addome con etanolo; aprire l'addome e il petto con le forbici. Con piccole forbici chirurgiche, tagliare tra l'atrio sinistro e il ventricolo sinistro per esanguinare il topo. Perfondere il cuore con 10 mL di PBS freddo 1x per rimuovere il sangue dal cuore.
3. Tagliare il cuore e tenere 3 mm dall'aorta ascendente, come mostrato nella figura 1B. Sezionare la valvola aortica sotto uno stereomicroscopio. Tagliare il cuore orizzontalmente al centro dei ventricoli(Figura 1C). Tagliare il ventricolo sinistro verso l'aorta e sezionare attentamente la valvola aortica (Figura 1D-F). Mettere insieme le valvole in un piccolo piatto di coltura tissutale da 35 mm.
4. Lavare le valvole isolate in un piatto di coltura cellulare da 75 mm con 5 mL di HEPES freddo (10 mM) integrato con antibiotici (1% penicillina-streptomicina) per rimuovere il sangue(figura 2). Preparare due tubi da 15 ml di collagenasi 1 mg/ml e 4,5 mg/ml, come descritto sopra nella fase 1.3.
   NOTA: Dopo la dissezione, manipolare le valvole isolate in una cappa sterile per ridurre al minimo la contaminazione.
5. Incubare le valvole in collagenasi di tipo I (1 mg/mL) per 30 min a 37 °C con scuotimento continuo(Figura 2). Centrifugare il tubo per 5 minuti a 150 × g,lavare il pellet una volta con 2 ml di HEPES (10 mM) e vortice per 30 s ad alta velocità. Versare il contenuto di questo tubo in un piatto di coltura da 35 mm e trasferire con cura i frammenti di tessuto utilizzando una pinzetta sottile in un nuovo tubo.
   NOTA: In questa fase, i CCI non sono ancora dissociati dal tessuto e il pellet contiene pezzi di tessuto. Per evitare la contaminazione con cellule endoteliali, non centrifugare dopo il vortice nel passaggio 2.5.
6. Incubare il pellet in un tubo da 15 ml con 5 ml di collagenasi di tipo I (4,5 mg/ml) a 37 °C sotto agitazione continua per 35 min. Sospendere di nuovo le celle con una pipetta da 1 mL per separare le cellule e centrifugare a 150 × g per 5 minuti a 4 °C.
7. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 2 mL di DMEM completo. Centrifuga a 150 × g per 5 min a 4 °C. Ripetere questo passaggio due volte per pulire le celle.
   NOTA: Il pellet avrà ancora alcuni frammenti di tessuto.
8. Sospendere di nuovo il pellet in 1 mL di mezzo completo e placcare le cellule in un pozzo di un piatto di coltura cellulare a 6 po 'in una quantità minima di mezzo per facilitarne l'attaccamento al piatto di coltura. Lasciare le cellule, indisturbate, in un incubatore a 37 °C con il 5% di anidride carbonica.
9. Dopo 3 giorni, controllare le cellule al microscopio per verificare una buona crescita vicino ai detriti tissutali. Una volta che 1.000 cellule sono visibili al microscopio, rimuovere con cura i detriti del tessuto con una pinzetta autoclavata e cambiare il mezzo.
   NOTA: La piastra non deve essere disturbata; se non si osserva il numero richiesto di cellule, riposizionare il piatto di coltura cellulare nell'incubatrice per altri 2 giorni.
10. Quando le cellule sono confluenti al 70% (2,5 × 10⁵), tripinare e quindi trasferirle in un piatto di coltura tissutale da 75 mm.

3. Analisi dell'identità e della morfologia cellulare

NOTA: La colorazione ad immunofluorescenza è stata utilizzata per studiare la morfologia cellulare e la contaminazione delle cellule endoteliali.

1. Pulire il cappuccio con il 70% di v/v/ etanolo. Posizionare le coperture sterili (22 mm x 22 mm) in piastre da 6 pozzi.
   NOTA: Per sterilizzare i copricapo, lavarli con il 70% di etanolo e tenerli nel cappuccio durante la notte sotto la luce ultravioletta.
2. Semina 100.000 cellule per pozzo in una piastra da 6 po'. Dopo 24 ore, lavare le cellule due volte in 1x PBS e fissarle in paraformaldeide al 4% (PFA) per 20 minuti. Lavare di nuovo le cellule due volte con 1x PBS.
   NOTA: A questo punto, le cellule potrebbero essere conservate in PBS a 4 °C fino all'inizio della procedura di colorazione.
3. Per verificare la purezza dei CCI, utilizzare l'actina muscolare alfa-liscia (αSMA), la vimentina e il cluster di differenziazione 31 (CD31) per rilevare la contaminazione da CCI.
4. Preparare un'aliquota di tampone di blocco mescolando 500 μL di siero normale (la stessa specie dell'anticorpo secondario), 9,5 mL di 1x PBS e 30 μL di Tritone X-100. Incubare le cellule in 2 mL del tampone di blocco per 1 h.
5. Preparare il tampone di diluizione anticorpale contenente 30 μL di Tritone X-100, 10 mL di 1x PBS e 0,1 g di albumina sierice bovina (BSA).
6. Prendi una scatola di punte vuota, riempi metà della scatola con acqua per creare una camera umida. Coprire il portasepenne con un tessuto bagnato e quindi con un foglio di parafilm.
7. Prendere 1 μL dell'anticorpo primario e mescolarlo con 100 μL del tampone di diluizione preparato nella fase 3.5. Posizionare 50 μL dell'anticorpo diluito sul parafilm. Prendi le copertine dai pozzi, capovolgerle e posizionale sulla parte superiore delle gocce di anticorpi; incubare le cellule durante la notte con l'anticorpo.
8. Aggiungere 1 mL di PBS nella piastra a 6 po' . Eserti con cura il coverslip dal parafilm, capovolgerlo e posizionarlo nel pozzo. Lavare le cellule con un'agitazione delicata continua per 5 minuti. Sostituire il PBS con PBS fresco; lavare le cellule 3 volte.
9. Incubare le cellule con l'anticorpo secondario diluito (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) per 1 h. Aggiungere 1 μL dell'anticorpo secondario a 500 μL del tampone di diluizione anticorpale (preparato nella fase 3.5). Coprire la piastra con un foglio di alluminio. Lavare le cellule 3 volte con 1 mL di 1x PBS con agitazione continua.
10. Montare i copripivimenti con 50 μL di mezzo di montaggio da 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e osservare le cellule al microscopio per analizzare la morfologia delle cellule e la contaminazione da VEC.

4. Saggio di calcificazione in vitro

1. Pulire il cappuccio con il 70% di etanolo, riscaldare il dmem medio a 37 °C.
2. Seme 100.000 cellule/condizione in piastre a 6 pozzi in DMEM completo e coltura per 24 ore a 37 °C.
3. Preparare il mezzo calcificatore mescolando 2 mM di NaH₂PO_4,10^-7 M di insulina e 50 μg/mL di acido ascorbico in DMEM con FBS al 5%. Per 93 mL di DMEM, aggiungere 5 mL di FBS, 1 mL di antibiotici (concentrazione finale 1%), 1 mL di piruvato di sodio (100 mM), 27,5 mg di NaH₂PO_{4, 5,8} μL di insulina e 5 mg di acido ascorbico.
   NOTA: Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 μm prima dell'uso.
4. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo supernatante con il mezzo calcificatore. Incubare le cellule per 7 giorni a 37 °C. Il 3^{° giorno,} sostituire con un mezzo calcificatore fresco e riposizionare la piastra nell'incubatrice per completare i 7 giorni di trattamento.
5. Dopo 7 giorni, rimuovere il mezzo e lavare le cellule due volte con 2 mL di 1x PBS. Incubare le cellule in 1 mL di acido cloridrico 0,6 N (HCl) per 24 ore a 37 °C. Raccogliere l'HCl in un tubo da 1,5 ml ed evaporarlo in un evaporatore rotante. Sospendere di nuovo il contenuto di tutti i tubi in 60 μL di HCl.
   NOTA: La procedura di essiccazione è importante per concentrare la soluzione e avere lo stesso volume per ogni condizione.
6. Utilizzare una piastra da 96 porcili per misurare la concentrazione di calcio utilizzando il reagente Arsenazo III, disponibile in un kit pronto all'uso (per maggiori dettagli consultare la tabella dei materiali).
7. Preparare una soluzione standard di calcio di concentrazione di 10 mg/dL. Pesare 10 mg di idrossido di calcio (Ca(OH)₂) e sciogliere in 100 mL di acqua distillata.
8. In una piastra chiara da 96 pozzi, pipetta 2 μL di soluzione in bianco (HCl, 0,6 N), la soluzione standard, il campione per pozzo (10 mg/dL) e i campioni. Eseguire l'esperimento in triplice copia per verificare la variabilità della pipettazione. Aggiungere 200 μL del reagente per ogni condizione.
   NOTA: I campioni superiori a 15 mg/dL devono essere diluiti 1:1 con soluzione salina, ri-saggiati e il risultato moltiplicato per due.
9. Incubare la reazione per 15 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: La reazione è stabile per 60 min.
10. Leggere e registrare l'assorbanza della piastra a 650 nm. Utilizzare la formula seguente per calcolare la quantità di calcio nei campioni:
    Calcio (mg/mL) = (Assorbanza del campione/assorbanza della norma) × concentrazione di

Risultati

Poiché le valvole aortiche murine hanno in genere un diametro di 1 mm, almeno tre valvole devono essere raggruppate per raccogliere un milione di celle vitali per diverse procedure sperimentali. I diversi passaggi del processo di isolamento VIC sono riportati nella figura 1 e nella figura 2. Poiché è difficile raschiare manualmente il tessuto della valvola, è preferibile utilizzare la sollecitazione di taglio creata dal vortice per rimuovere i CCI. In effett...

Discussione

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato di isolamento delle celle della valvola del mouse per le impostazioni cultura primarie. Tre valvole aortiche di topi di 8 settimane sono state raggruppate per ottenere un numero adeguato di cellule. Inoltre, questo protocollo descrive la caratterizzazione del fenotipo VIC e il saggio di mineralizzazione in vitro . Il metodo è stato adattato dal protocollo precedentemente descritto da Mathieu et^al.

Dur...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm cutting edge scissors	F.S.T	15000-00
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody	abcam
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate	Cell Signaling	4412
Arsenazo-III reagent set	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	a Kit to measure the concentration of calcium
Bonn Scissors	F.S.T	14184-09
Calcium hydroxide	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Collagenase type I  (125 units/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
Extra fine graefe forceps	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
Fine forceps	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M solution	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Mycoplasma elimination reagent
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Sodium Pyruvate 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
Standard pattern forceps	F.S.T	11000-12
Surgical Scissors - Sharp-Blunt	F.S.T	14008-14
Trypsin 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam