Isolamento de células válvulas intersticiais do rato para estudar a calcificação da válvula aórtica in vitro

Resumo

Este artigo descreve o isolamento das células da válvula aórtica do rato por um procedimento de colagem de duas etapas. Células de válvulas isoladas do rato são importantes para a realização de diferentes ensaios, como este ensaio de calcificação in vitro, e para investigar as vias moleculares que levam à mineralização da válvula aórtica.

Resumo

A calcificação das células válvulas aórticas é a marca registrada da estenose aórtica e está associada à fibrose da cúmlica da válvula. As células intersticiais da válvula (VICs) desempenham um papel importante no processo de calcificação na estenose aórtica através da ativação de seu programa de desdiferente para células semelhantes a osteoblastos. Os VICs do mouse são uma boa ferramenta in vitro para a elucidação das vias de sinalização que conduzem a mineralização da célula da válvula aórtica. O método aqui descrito, utilizado com sucesso por esses autores, explica como obter células recém-isoladas. Foi realizado um procedimento de colagem em duas etapas com 1 mg/mL e 4,5 mg/mL. O primeiro passo é crucial para remover a camada celular endotelial e evitar qualquer contaminação. A segunda incubação de colagem é facilitar a migração de VICs do tecido para a placa. Além disso, discute-se um procedimento de coloração de imunofluorescência para a caracterização do fenótipo das células da válvula isolada do rato. Além disso, o ensaio de calcificação foi realizado in vitro utilizando-se o procedimento de medição do reagente de cálcio e a coloração vermelha de alizarina. O uso da cultura primária da célula de válvula de camundongos é essencial para testar novos alvos farmacológicos para inibir a mineralização celular in vitro.

Introdução

A doença da válvula aórtica calcificada (CAVD) é a doença cardíaca valvular mais prevalente nas populações ocidentais, afetando quase 2,5% dos idosos com mais de 65 anos de idade¹. Cavd afeta mais de seis milhões de americanos e está associado a mudanças nas propriedades mecânicas dos folhetos que prejudicam o fluxo sanguíneo normal^1,2. Atualmente, não há tratamento farmacológico para impedir a progressão da doença ou ativar a regressão mineral. A única terapia eficaz para tratar cavd é a substituição da válvula aórtica por cirurgia ou substituição da válvula aórtica transcateter³. Por isso, é imprescindível investigar os mecanismos moleculares que levam à mineralização da válvula para identificar novos alvos farmacológicos. De fato, a estenose aórtica não tratada tem várias consequências adversas, como disfunção ventrículo esquerda e insuficiência cardíaca⁴.

A válvula aórtica consiste em três camadas conhecidas como fibrosa, esponiosa e ventricular, que contêm VICs como a célula predominante tipo⁵. A fibrosa e a ventricular são cobertas por uma camada de células endoteliais vasculares (VECs)⁵. Os VECs regulam a permeabilidade das células inflamatórias, bem como os sinais paracrinos. O aumento do estresse mecânico pode afetar a integridade dos VECs e perturbar a homeostase da válvula aórtica, levando à invasão celular inflamatória⁶. As análises de microscopia eletrônica de varredura mostraram endotélio interrompido em uma válvula aórtica calcificada humana⁷.

Análises histológicas do tecido calcificado revelam a presença de osteoblastos e osteoclartos. Além disso, observou-se diferenciação osteogênica dos VICs tanto in vitro quanto no tecido da válvula humana⁸. Este processo é orquestrado principalmente pelo fator de transcrição relacionado ao Runt 2 (Runx2) e pelas proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs)^8,9.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos animais aqui descritos foram aprovados pela Escola de Medicina Icahn no comitê institucional de núcleo e uso do Monte Sinai.

1. Preparação antes do isolamento da célula da válvula de camundongos adultos

1. Limpe e esterilize todos os instrumentos cirúrgicos mostrados na Figura 1A utilizando 70% de v/v de etanol e, posteriormente, autoclavando-os por 30 minutos. limpe o espaço cirúrgico com 70% de etanol.
2. Adicione 500 μL de penicilina-estreptomicina a 50 mL de HEPES de 10 mm. Prepare uma alíquota de 50 mL de salina tamponada com fosfato de 1x (PBS). Mantenha as soluções no gelo.
3. Prepare soluções de colagenase de 1 mg/mL e 4,5 mg/mL e utilize 5 mL de cada solução em tubos de 15 mL para realizar todo o procedimento. Para preparar 5 mL de colagenase de 1 mg/mL, misturar 5 mg de colagenase com 2,5 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, fetal bovino -free) e 2,5 mL de 10 mM HEPES complementado com antibióticos (1% penicilina-estreptomicina a partir da etapa 1.2). Filtre as soluções através de um filtro de 0,22 μm para remover qualquer contaminação.
   NOTA: Mantenha as soluções no gelo para proteger as enzimas.
4. Aqueça a solução DMEM a 37 °C antes de usar em todas as etapas descritas abaixo. Prepare o meio completo suplementando OMEM com 1% de penicilina-estreptomicina, 1% piruvato de sódio, 5 mL de L-glutamina de 200 mM, 1 mL de reagente eliminatório de micoplasma (ver a Tabela de Materiais),e 10% FBS.

2. Isolamento das células válvulas

1. Para obter 10⁶ células para o experimento, use cinco camundongos de 8 semanas de idade (mínimo de três). Coloque o mouse em uma câmara de indução junto com um pequeno pedaço de papel de tecido encharcado com 1 mL de isoflurane, mas não permita contato com o tecido. Para confirmar que o animal está totalmente anestesiado; verificar o reflexo de beliscar o dedo do dedo do dedo, e, em seguida, eutanásia o rato por luxação cervical. Use isoflurane para aliviar qualquer dor antes da luxação cervical, pois o procedimento descrito abaixo é terminal.
2. Coloque o mouse em uma plataforma de dissecação e conserte as patas com cânulas para mantê-lo no lugar. Limpe o peito e o abdômen com etanol; abra o abdômen e o peito com uma tesoura. Com uma pequena tesoura cirúrgica, corte entre o átrio esquerdo e o ventrículo esquerdo para exsanguinar o rato. Perfunda o coração com 10 mL de 1x pbs frio para remover sangue do coração.
3. Corte o coração e mantenha 3 mm da aorta ascendente como mostrado na Figura 1B. Disseca a válvula aórtica sob um estereótipo. Corte o coração horizontalmente no meio dos ventrículos(Figura 1C). Corte o ventrículo esquerdo em direção à aorta e disseca cuidadosamente a válvula aórtica(Figura 1D-F). Misture as válvulas em um pequeno prato de cultura de tecido de 35 mm.
4. Lave as válvulas isoladas em um prato de cultura celular de 75 mm com 5 mL de HEPES frio (10 mM) complementados com antibióticos (1% penicilina-estreptomicina) para remover sangue(Figura 2). Prepare dois tubos de 15 mL de colagenase 1 mg/mL e 4,5 mg/mL conforme descrito acima na etapa 1.3.
   NOTA: Após a dissecção, manipule as válvulas isoladas em uma capa biossegurança estéril para minimizar a contaminação.
5. Incubar as válvulas em colagenase tipo I (1 mg/mL) por 30 min a 37 °C com agitação contínua(Figura 2). Centrifugar o tubo por 5 min a 150 × g,lavar a pelota uma vez com 2 mL de HEPES (10 mM) e vórtice para 30 s em alta velocidade. Despeje o conteúdo deste tubo em um prato de cultura de 35 mm, e transfira cuidadosamente os fragmentos de tecido usando pinças finas em um novo tubo.
   NOTA: Nesta fase, os VICs ainda não estão dissociados do tecido, e a pelota contém pedaços de tecido. Para evitar contaminação com células endoteliais, não centrífugue após o vórtice na etapa 2.5.
6. Incubar a pelota em um tubo de 15 mL com 5 mL de colagenase tipo I (4,5 mg/mL) a 37 °C sob agitação contínua por 35 min. Suspenda as células com uma pipeta de 1 mL para separar as células e centrífugas a 150 × g por 5 min a 4 °C.
7. Descarte o supernatante e suspenda a pelota em 2 mL de DMEM completo. Centrifugar a 150 × g por 5 min a 4 °C. Repita este passo duas vezes para limpar as células.
   NOTA: A pelota ainda terá alguns fragmentos de tecido.
8. Suspenda a pelota em 1 mL de meio completo, e emplaque as células em um poço de um prato de cultura celular de 6 poços em uma quantidade mínima de meio para facilitar seu apego ao prato de cultura. Deixe as células, sem perturbação, em uma incubadora de 37 °C com 5% de dióxido de carbono.
9. Após 3 dias, verifique as células sob o microscópio para verificar um bom crescimento próximo aos detritos teciduais. Uma vez que 1.000 células são visíveis sob o microscópio, remova cuidadosamente os detritos teciduais com pinças autoclavadas, e mude o meio.
   NOTA: A placa não deve ser perturbada; se o número necessário de células não for observado, coloque o prato de cultura celular de volta na incubadora por mais 2 dias.
10. Quando as células são 70% confluentes (2,5 × 10 5 ), experimento e^depoistransferem-nas para um prato de cultura tecidual de 75 mm.

3. Análise da identidade celular e morfologia

NOTA: A coloração da imunofluorescência foi utilizada para estudar morfologia celular e contaminação de células endoteliais.

1. Limpe o capô com 70% v/v/ etanol. Coloque tampas estéreis (22 mm x 22 mm) em placas de 6 poços.
   NOTA: Para esterilizar as tampas, lave-as com 70% de etanol e mantenha-as no capô durante a noite sob luz ultravioleta.
2. Sementes 100.000 células por poço em uma placa de 6 poços. Depois de 24 horas, lave as células duas vezes em 1x PBS, e fixe-as em 4% de paraformaldeído (PFA) por 20 minutos. Lave as células novamente duas vezes com 1x PBS.
   NOTA: Neste ponto, as células poderiam ser mantidas em PBS a 4 °C até o início do procedimento de coloração.
3. Para verificar a pureza dos VICs, utilize actina muscular alfa-lisa (αSMA), vimentina e cluster de diferenciação 31 (CD31) para detectar contaminação com VECs.
4. Prepare uma alíquota de tampão de bloqueio misturando 500 μL de soro normal (a mesma espécie do anticorpo secundário), 9,5 mL de 1x PBS e 30 μL de Triton X-100. Incubar as células em 2 mL do tampão de bloqueio por 1 h.
5. Prepare o tampão de diluição de anticorpos contendo 30 μL de Triton X-100, 10 mL de 1x PBS e 0,1 g de albumina de soro bovino (BSA).
6. Pegue uma caixa de pontas vazia, encha metade da caixa com água para criar uma câmara úmida. Cubra o suporte da ponta com um tecido molhado e, em seguida, com uma folha de parafilm.
7. Pegue 1 μL do anticorpo primário e misture-o com 100 μL do tampão de diluição preparado na etapa 3.5. Coloque 50 μL do anticorpo diluído no parafilme. Pegue as tampas dos poços, vire-as e coloque-as no topo das gotas de anticorpo; incubar as células durante a noite com o anticorpo.
8. Adicione 1 mL de PBS na placa de 6 poços. Retire cuidadosamente o deslizamento do parafilme, vire-o e coloque-o no poço. Lave as células com uma agitação suave contínua por 5 minutos. Substitua o PBS por PBS fresco; lavar as células 3 vezes.
9. Incubar as células com o anticorpo secundário diluído (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) por 1h. Adicione 1 μL do anticorpo secundário a 500 μL do tampão de diluição de anticorpos (preparado na etapa 3.5). Cubra a placa com papel alumínio. Lave as células 3 vezes com 1 mL de 1x PBS com agitação contínua.
10. Monte as tampas com 50 μL de 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI)-montagem média, e observe as células sob o microscópio para analisar a morfologia das células e contaminação do VEC.

4. Ensaio de calcificação in vitro

1. Limpe o capô com 70% de etanol, aqueça o médio DMEM a 37 °C.
2. Semente 100.000 células/condição em placas de 6 poços em DMEM completo, e cultura por 24 h a 37 °C.
3. Prepare o meio calcificante misturando 2 mM de NaH₂PO₄, insulina de 10^-7 M e 50 μg/mL ácido ascórbico em DMEM com 5% de FBS. Para 93 mL de DMEM, adicione 5 mL de FBS, 1 mL de antibióticos (concentração final 1%), 1 mL de piruvato de sódio (100 mM), 27,5 mgs de NaH₂PO_4, 5,8 μL de insulina e 5 mg de ácido ascórbico.
   NOTA: Filtre a solução usando um filtro de 0,22 μm antes de usar.
4. Após 24 horas, substitua o meio supernante pelo meio calcificador. Incubar as células por 7 dias a 37 °C. No^3º dia, substitua por meio calcificador fresco, e coloque a placa de volta na incubadora para completar os 7 dias de tratamento.
5. Após 7 dias, remova o meio e lave as células duas vezes com 2 mL de 1x PBS. Incubar as células em 1 mL de ácido clorídrico de 0,6 N (HCl) por 24 h a 37 °C. Colete o HCl em um tubo de 1,5 mL e evapore-o em um evaporador rotativo. Suspenda o conteúdo de todos os tubos em 60 μL de HCL.
   NOTA: O procedimento de secagem é importante para concentrar a solução e ter o mesmo volume para cada condição.
6. Use uma placa de 96 poços para medir a concentração de cálcio usando reagente Arsenazo III, disponível em um kit pronto para uso (consulte a Tabela de Materiais para obter mais detalhes).
7. Prepare uma solução padrão de cálcio de concentração de 10 mg/dL. Pesar 10 mg de hidróxido de cálcio (Ca(OH)₂) e dissolver em 100 mL de água destilada.
8. Em uma placa clara de 96 poços, pipet 2 μL de solução em branco (HCl, 0,6 N), a solução padrão, a amostra por poço (10 mg/dL) e as amostras. Realize o experimento em triplicado para verificar a variabilidade da pipetação. Adicione 200 μL do reagente para cada condição.
   NOTA: As amostras acima de 15 mg/dL devem ser diluídas 1:1 com soro fisiológico, re-ensaio, e o resultado multiplicado por dois.
9. Incubar a reação por 15 minutos em temperatura ambiente.
   NOTA: A reação é estável por 60 min.
10. Leia e grave a absorvância da placa a 650 nm. Use a seguinte fórmula para calcular a quantidade de cálcio nas amostras:
    Cálcio (mg/mL) = (Absorvância de amostra/absorvância de padrão) × Concentração de padrão

Resultados

Como as válvulas aórticas murinas têm tipicamente 1 mm de diâmetro, pelo menos três válvulas devem ser agrupadas para coletar um milhão de células viáveis para diferentes procedimentos experimentais. As diferentes etapas do processo de isolamento VIC são mostradas na Figura 1 e Figura 2. Como é difícil raspar manualmente o tecido da válvula, é preferível usar o estresse de tesoura criado por vórtice para remover os VECs. De fato, os resultados da...

Discussão

Este artigo apresenta um protocolo detalhado do isolamento celular da válvula do rato para a cultura primária. Três válvulas aórticas de camundongos de 8 semanas foram agrupadas para obter um número adequado de células. Além disso, este protocolo descreve a caracterização do fenótipo VIC e o ensaio de mineralização in vitro. O método foi adaptado do protocolo descrito anteriormente por Mathieu et al.⁷.

Durante o isolamento das válvulas ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm cutting edge scissors	F.S.T	15000-00
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody	abcam
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate	Cell Signaling	4412
Arsenazo-III reagent set	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	a Kit to measure the concentration of calcium
Bonn Scissors	F.S.T	14184-09
Calcium hydroxide	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Collagenase type I  (125 units/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
Extra fine graefe forceps	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
Fine forceps	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M solution	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Mycoplasma elimination reagent
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Sodium Pyruvate 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
Standard pattern forceps	F.S.T	11000-12
Surgical Scissors - Sharp-Blunt	F.S.T	14008-14
Trypsin 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam