시험관 내 대동맥 판막의 석회화를 연구하기 위해 마우스 간막판 세포의 격리

요약

이 문서에서는 2단계 콜라게나아제 절차에 의한 마우스 대동맥 판막 세포의 분리에 대해 설명합니다. 격리된 마우스 밸브 세포는 체외 석회화 분석과 같은 상이한 분석체를 수행하고 대동맥 판막 광물화로 이어지는 분자 경로를 조사하는 데 중요합니다.

초록

대동맥 판막 세포의 석회화는 대동맥 협착증의 특징이며 판막 cusp 섬유증과 관련이 있습니다. 판막 간질 세포(VIC)는 골다브라스트와 같은 세포에 대한 그들의 비차별 프로그램의 활성화를 통해 대동맥 협착증의 석회화 과정에서 중요한 역할을 한다. 마우스 VICs는 대동맥 밸브 셀의 광물화를 구동하는 신호 경로의 용해를 위한 좋은 시험관내 도구입니다. 본 명세서에 기술된 방법은, 이 저자에 의해 성공적으로 이용되고, 새로 고립된 세포를 얻는 방법을 설명합니다. 2 단계 콜라게나아제 절차는 1 mg/mL 및 4.5 mg/mL로 수행되었습니다. 첫 번째 단계는 내피 세포 층을 제거하고 오염을 피하는 것이 중요합니다. 두 번째 콜라게나아제 인큐베이션은 조직에서 플레이트로 의 VICs의 이동을 용이하게 하는 것이다. 또한, 분리된 마우스 밸브 세포의 표현형 특성화를 위한 면역형 염색 절차가 논의된다. 더욱이, 석회화 분석법은 칼슘 시약 측정 절차 및 알리자린 붉은 염색을 사용하여 체외에서 수행되었다. 마우스 밸브 세포 1 차 배양의 사용은 체외에서 세포 광물화를 억제하기 위해 새로운 약리학적 표적을 테스트하는 데 필수적입니다.

서문

석회화 대동맥 판막 질환 (CAVD)은 1 세 이상 노인 개인의 거의 2.5 %에 영향을 미치는 서양 인구에서 가장 널리 퍼진 valvular 심장^{질환입니다.} CAVD는 6백만 명 이상의 미국인에게 영향을 미치며 정상적인 혈류를 통해^1,2를 손상시키는 전단지의 기계적 특성의 변화와 관련이^{있습니다.} 현재 질병의 진행을 중단하거나 미네랄 회귀를 활성화하는 약리학적 치료법은 없습니다. CAVD를 치료하는 유일한 효과적인 치료법은 수술 또는 경피 대동맥 판막 교체^3에의한 대동맥 판막 교체입니다. 따라서 새로운 약리학적 인 표적을 식별하기 위해 밸브 광물화로 이어지는 분자 메커니즘을 조사하는 것이 필수적입니다. 실제로, 비처리 대동맥 협착증은 좌심실 기능 장애 및 심부전 4와 같은 몇몇 불리한 결과를 가지고^{있습니다.}

대동맥 판막은 주성 세포 유형^5로VICs를 포함하는 섬유증, 스폰지 오사 및 심실증으로 알려진 3 개의 층으로 구성됩니다. 섬유증 및 심실증은 혈관 내피 세포(VEC)^5층으로덮여 있다. VEC는 염증 성 세포의 투과성뿐만 아니라 파라크린 신호를 조절합니다. 증가된 기계적 응력은 VEC의 무결성에 영향을 미치고 대동맥 판막의 항상성을 방해하여 염증성 세포 침입^6으로이어질 수 있다. 스캐닝 전자 현미경 분석은 인간 석회화 대동맥 판막^7에서중단된 내피엄을 보였다.

석회화 된 조직의 조직학적 분석은 골세포와 골세포의 존재를 드러낸다. 더욱이, VIC의 골성 분화는 체외 및 인간 판막 조직⁸모두에서 관찰되었다. 이 과정은 주로 Runt 관련 전사 인자 2 (Runx2) 및 뼈 형태 유전학 단백질 (BmPs)^8,9에의해 오케스트레이션된다.

프로토콜

참고: 여기에 설명된 모든 동물 절차는 마운트 시나이 기관 핵심 및 사용 위원회에서 Icahn 의과 대학에 의해 승인되었습니다.

1. 성인 마우스에서 밸브 세포 격리 전에 준비

1. 도 1A에 표시된 모든 수술 기구를 70% v/v 에탄올을 사용하고 30분 동안 자동 으로 자동화하여 모든 수술 기구를 청소하고 살균합니다.
2. 페니실린 연쇄 절제술 500μL을 10mm HEPES의 50mL에 추가합니다. 1x 인산염 완충식식염(PBS)의 50mL 알리쿼트(aliquot)를 준비한다. 얼음 에 솔루션을 유지합니다.
3. 1 mg/mL 및 4.5 mg/mL 콜라게나아제 용액을 준비하고, 전체 절차를 수행하기 위해 15mL 튜브에 각 용액의 5mL을 사용합니다. 1 mg/mL 콜라게나아제 5mL를 준비하려면 콜라게나아제 5 mg을 덜벡코의 수정 이글 매체(DMEM, 태아소 세럼(FBS)-무료)와 항생제로 보충한 10m HEPES 2.5mL(1% 페니실린-sttop)와 혼합합니다. 0.22 μm 필터를 통해 솔루션을 필터링하여 오염을 제거합니다.
   참고: 효소를 보호하기 위해 얼음 에 용액을 유지합니다.
4. DMEM 용액을 37°C로 따뜻하게 한 후 아래에 설명된 모든 단계에서 사용하십시오. DMEM을 1% 페니실린-연쇄절제술, 1% 피루바테 나트륨, 200mM L-글루타민 5mL, 마이코플라즈마 제거 시약 1mL(재료표참조), 10% FBS로 보충하여 완벽한 매체를 준비한다.

2. 밸브 셀의 격리

1. 실험을 위해^106개의 세포를 얻으려면, 5개의 8주 된 마우스(최소 3개)를 사용하십시오. 이소플루란 1mL에 담근 작은 티슈 페이퍼와 함께 유도실에 마우스를 놓지만 조직과의 접촉을 허용하지 않습니다. 동물이 완전히 마취되어 있는지 확인하려면; 발가락 핀치 반사를 확인한 다음 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시하십시오. 아래에 설명된 절차가 말단이기 때문에 자궁 경부 탈구 전에 통증을 완화하기 위해 이소플루란을 사용하십시오.
2. 마우스를 해부 플랫폼에 놓고 칸누아로 발을 고정하여 제자리에 고정합니다. 에탄올로 가슴과 복부를 청소; 가위로 복부와 가슴을 엽니다. 작은 수술 가위와 함께, 마우스를 exsanguiex 왼쪽 심실 사이 절단. 심장에서 혈액을 제거하기 위해 감기 1x PBS의 10 mL로 심장을 퍼퓨즈하십시오.
3. 도 1B에도시된 바와 같이 심장을 자르고, 상승대에서 3mm를 유지한다. 스테레오 현미경으로 대동맥 밸브를 해부합니다. 심실 의 중간에 수평으로 심장을 잘라(도 1C). 좌심실을 대동맥쪽으로 자르고 대동맥 판막(도1D-F)을조심스럽게 해부한다. 작은 35mm 조직 배양 접시에 함께 밸브를 풀.
4. 혈액을 제거하기 위해 항생제 (1 % 페니실린 연쇄 절제술)로 보충된 감기 HEPES (10 mM)의 5mL로 75mm 세포 배양 접시에서 분리 된 밸브를 세척하십시오(그림 2). 콜라게나아제 1 mg/mL 및 4.5 mg/mL의 15mL 튜브를 1.3단계에서 준비한다.
   참고: 해부 후 멸균 생물 안전 후드에서 격리된 밸브를 조작하여 오염을 최소화합니다.
5. 콜라게나제 타입 I(1 mg/mL)에서 30분 동안 37°C에서 연속흔들림(그림 2)으로밸브를 배양한다. 150 ×g에서5분 동안 튜브를 원심분리하고, HEPES(10mMM)의 2mL로 한 번 펠릿을 세척하고, 30초의 소용돌이를 고속으로 세척한다. 이 튜브의 내용을 35mm 배양 접시에 붓고 얇은 핀셋을 사용하여 조직의 조각을 새로운 튜브로 조심스럽게 전달합니다.
   참고 : 이 단계에서 VICs는 여전히 조직에서 해리되지 않으며 펠릿에는 조직 조각이 포함되어 있습니다. 내피 세포오염을 피하려면 2.5단계에서 소용돌이를 피한 후 원심분리기를 사용하지 마십시오.
6. 펠릿을 15mL 튜브에 5mL의 콜라게나아제 타입 I(4.5 mg/mL)를 35분 동안 연속 교반하여 37°C로 배양한다. 세포를 분리하기 위해 1mL 파이펫으로 세포를 다시 중단하고, 원심분리기는 150 × g에서 4°C에서 5분 동안 분리한다.
7. 상체를 버리고 완전한 DMEM의 2mL에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 원심분리기는 150 × g에서 4°C에서 5분 동안. 이 단계를 두 번 반복하여 세포를 청소합니다.
   참고: 펠릿에는 여전히 조직 조각이 있습니다.
8. 완전한 배지의 1mL에서 펠릿을 다시 중단하고, 배양 접시에 부착을 용이하게 하기 위해 최소 량의 배지로 6웰 세포 배양 접시의 한 웰에 세포를 플레이트한다. 37°C 인큐베이터에 5%의 이산화탄소를 가진 세포를 방해받지 않고 둡니다.
9. 3 일 후, 현미경의 밑에 세포를 확인하여 조직 파편에 가까운 좋은 성장을 확인하십시오. 일단 1,000개의 세포가 현미경의 밑에 나타나면, 오토클레이브 핀셋으로 조직 파편을 주의 깊게 제거하고 매체를 변경합니다.
   참고: 접시가 방해되어서는 안 됩니다. 필요한 수의 세포가 관찰되지 않으면 세포 배양 접시를 인큐베이터에 다시 2일 동안 놓습니다.
10. 세포가 70% 컨실수(2.5 ×^105)일때, 트립시니화한 다음 75mm 조직 배양 접시로 옮기다.

3. 세포 정체성 및 형태 분석

참고: 면역형광 염색은 세포 형태학 및 내피 세포 오염을 연구하기 위하여 이용되었습니다.

1. 70% v/v/에탄올로 후드를 청소합니다. 멸균 커버립(22mm x 22mm)을 6웰 플레이트에 놓습니다.
   참고: 커버립을 살균하려면 70% 에탄올로 씻어내고 자외선 아래에서 밤새 후드에 보관하십시오.
2. 6웰 플레이트에서 잘 당 100,000개의 세포를 시드합니다. 24 시간 후, 1 x PBS에서 세포를 두 번 세척하고 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 고정하십시오. 1x PBS로 다시 두 번 씻어내십시오.
   참고: 이 시점에서, 세포는 염색 절차의 시작까지 4°C에서 PBS에 보관될 수 있었습니다.
3. VIC의 순도를 확인하려면 알파-부드러운 근육 액틴(αSMA), 바이멘틴 및 분화 31(CD31)의 클러스터를 사용하여 VEC로 오염을 감지합니다.
4. 일반 혈청 500 μL(이차 항체와 동일한 종), 1x PBS의 9.5mL, 트리톤 X-100의 30 μL을 혼합하여 차단 버퍼의 알리쿼트(aliquot)를 준비한다. 1 h에 대한 차단 버퍼의 2 mL에서 세포를 배양한다.
5. 트리톤 X-100의 30 μL, 1x PBS의 10mL, 소 혈청 알부민(BSA)의 0.1 g를 포함하는 항체 희석 버퍼를 준비한다.
6. 빈 팁 상자를 가지고, 습한 챔버를 만들기 위해 물로 상자의 절반을 채웁니다. 팁 홀더를 젖은 티슈로 덮은 다음 파라필름 시트로 덮습니다.
7. 1차 항체의 1μL을 복용하고 3.5단계에서 제조된 희석 버퍼의 100 μL과 혼합한다. 파라필름에 희석된 항체의 50 μL을 놓습니다. 우물에서 커버립을 가지고 뒤집어 항체 의 방울 의 상단에 배치; 항체로 하룻밤 동안 세포를 배양한다.
8. 6웰 플레이트에 1mL의 PBS를 추가합니다. 조심스럽게 파라필름에서 커버슬립을 꺼내 뒤집어 우물에 놓습니다. 5 분 동안 연속 부드러운 동요로 세포를 씻어. PBS를 신선한 PBS로 교체하십시오. 셀을 3번 씻으시면 됩니다.
9. 희석된 이차 항체(1/500)(Alexa-488, Alexa-555)를 1h로 세포를 배양한다. 이차 항체의 1 μL을 항체 희석 버퍼의 500 μL에 추가합니다(3.5단계에서 제조). 알루미늄 호일로 접시를 덮습니다. 연속 교반으로 1x PBS의 1mL로 셀을 3 번 씻으시다.
10. 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)장착 매체의 50 μL로 커버립을 마운트하고, 세포 및 VEC 오염의 형태를 분석하기 위해 현미경의 밑에 세포를 관찰한다.

4. 체외 석회화 분석

1. 후드를 70% 에탄올로 청소하고 DMEM 배지를 37°C로 데우도록 데워주세요.
2. 100,000개의 세포/상태를 완전한 DMEM에서 6웰 플레이트로 시드하고, 37°C에서 24시간 배양하였다.
3. DMEM에서 NaH₂PO_4,^10-7M 인슐린 및 50 μg/mL 아스코르브산의 2mM을 5% FBS로 혼합하여 석회화 매체를 준비한다. DMEM의 93mL의 경우, FBS 5mL, 항생제 1mL(최종 농도 1%), 피루바테 나트륨 1mL(100mMM), NaH₂PO 4 2mg, 인슐린 5.8mg, 아스코르빅산 5mg을 추가한다.
   참고: 사용하기 전에 0.22 μm 필터를 사용하여 솔루션을 필터링합니다.
4. 24시간 후, 상주 배지를 석회화 매체로 교체한다. 37°C에서 7일 동안 세포를 배양한다. 3^일 일에신선한 석회화 매체로 교체하고 7 일간의 치료를 완료하기 위해 인큐베이터에 플레이트를 다시 놓습니다.
5. 7 일 후, 배지를 제거하고 1 x PBS의 2 mL로 두 번 세포를 씻으라. 세포는 37°C에서 24시간 동안 0.6N 염산(HCl)의 1mL로 세포를 배양한다. 1.5mL 튜브에서 HCl을 수집하고 회전 증발기에서 증발합니다. HCl의 60 μL에서 모든 튜브의 내용을 다시 일시 중단합니다.
   참고: 건조 절차는 용액을 집중하고 각 조건에 대해 동일한 부피를 갖는 것이 중요합니다.
6. 96웰 플레이트를 사용하여 Arsenazo III 시약을 사용하여 칼슘 농도를 측정할 수 있으며, 즉시 사용할 수 있는 키트로 제공됩니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
7. 10 mg/dL 농도의 칼슘 표준 용액을 준비하십시오. 수산화칼슘 10 mg(CA(OH)_2)의무게를 측정하고 증류수 100mL에 용해합니다.
8. 명확한 96 웰 플레이트에서, 파이프 2 μL의 빈 용액 (HCl, 0.6 N), 표준 용액, 우물 당 샘플 (10 mg/dL), 및 샘플. 트리플리케이트에서 실험을 수행하여 파이펫팅 가변성을 확인합니다. 각 조건에 대해 시약의 200 μL을 추가합니다.
   참고: 위의 샘플 15 mg/dL 은 식염수, 재분석, 결과 2배곱으로 1:1을 희석해야 합니다.
9. 실온에서 15 분 동안 반응을 배양하십시오.
   참고: 반응은 60분 동안 안정적입니다.
10. 650 nm에서 플레이트의 흡광도를 읽고 기록합니다. 다음 수식을 사용하여 샘플의 칼슘 양을 계산합니다.
    칼슘(mg/mL) = (표준의 시료/흡수도 흡수) × 표준 농도

결과

murine 대동맥 판막은 일반적으로 직경이 1mm이기 때문에, 다른 실험 절차를 위해 백만 개의 실행 가능한 세포를 수집하기 위해 적어도 3 개의 밸브를 풀링해야합니다. VIC 격리 프로세스의 다른 단계는 도 1 및 도 2에표시됩니다. 밸브 조직을 수동으로 긁어내는 것이 어렵기 때문에, VEC를 제거하기 위해 소용돌이에 의해 생성된 전단 응력사용이 바람직하다...

토론

이 문서에서는 1차 배양에 대한 마우스 밸브 셀 격리의 상세한 프로토콜을 제시합니다. 8주 된 마우스의 3개의 대동맥 판막은 충분한 수의 세포를 얻기 위하여 풀링되었습니다. 또한, 본 프로토콜은 VIC 표현형및 체외 광물화 분석의 특성화를설명합니다. 이 방법은 이전에 설명된 마티유 등으로부터 이전에 설명된 프로토콜로부터 적용하였다.^7.

?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm cutting edge scissors	F.S.T	15000-00
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody	abcam
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate	Cell Signaling	4412
Arsenazo-III reagent set	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	a Kit to measure the concentration of calcium
Bonn Scissors	F.S.T	14184-09
Calcium hydroxide	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Collagenase type I  (125 units/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
Extra fine graefe forceps	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
Fine forceps	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M solution	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Mycoplasma elimination reagent
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Sodium Pyruvate 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
Standard pattern forceps	F.S.T	11000-12
Surgical Scissors - Sharp-Blunt	F.S.T	14008-14
Trypsin 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam