Visualización y cuantificación de tejidos adiposos marrones y beige en ratones utilizando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Resumen

Imágenes funcionales y cuantificación de depósitos adiposos termogénicos en ratones utilizando un enfoque basado en imágenes micro-PET / MR.

Resumen

Los adipocitos marrones y beige ahora se reconocen como posibles objetivos terapéuticos para la obesidad y los síndromes metabólicos. Los métodos de imágenes moleculares no invasivas son esenciales para proporcionar información crítica sobre estos depósitos adiposos termogénicos. Aquí, el protocolo presenta un método basado en imágenes PET / MR para evaluar la actividad de los adipocitos marrón y beige en el tejido adiposo marrón interescapular de ratón (iBAT) y el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal (iWAT). La visualización y cuantificación de los depósitos adiposos termogénicos se logró utilizando [^18F]FDG, el análogo de glucosa no metabolizable, como radiotrazador, cuando se combinó con la información anatómica precisa proporcionada por las imágenes de RM. La imagen PET/MR se realizó 7 días después de que se realizara la aclimatación en frío y la cuantificación de la señal [^18F]FDG en diferentes depósitos adiposos para evaluar la movilización relativa de los tejidos adiposos termogénicos. La eliminación de iBAT aumentó sustancialmente la absorción de FDG evocada por frío [^18F] en iWAT de los ratones.

Introducción

En respuesta a las necesidades nutricionales cambiantes, el tejido adiposo sirve como un depósito de energía para adoptar el almacenamiento de lípidos o el modo de movilización para satisfacer las necesidades del ^cuerpo1. Además, el tejido adiposo también desempeña una función clave en la termorregulación, a través de un proceso llamado termogénesis no temblorosa, también llamada termogénesis facultativa. Esto se logra típicamente por el tejido adiposo marrón (BAT), que expresa un nivel abundante de proteína de desacoplamiento de la membrana mitocondrial proteína 1 (UCP1). Como portador de protones, UCP1 genera calor al desacoplar el transporte de protones y la producción de ^ATP2. Tras la estimulación en frío, la termogénesis en BAT se pone en marcha mediante la activación del sistema nervioso simpático (SNS), seguida de la liberación de norepinefrina (NE). NE se une a los receptores adrenérgicos β3 y conduce a la elevación del AMP cíclico intracelular (cAMP). Como consecuencia, la participación dependiente de cAMP/PKA de CREB (cAMP response element-binding protein) estimula la transcripción de Ucp1 a través de la unión directa a elementos de respuesta CREB (CRE)². Además de bat, los adipocitos de color marrón también se encuentran dentro del tejido adiposo blanco y, por lo tanto, se denominan células beige o brite (marrón en blanco)^1,3. En respuesta a estímulos específicos (como el frío), estas células beige inactivas se remodelan para exhibir múltiples características similares al marrón, incluidas gotas lipídicas multiloculares, mitocondrias densamente empaquetadas y expresión aumentada de UCP13,4,5.

Estudios en animales han demostrado que los adipocitos marrones y beige poseen múltiples beneficios metabólicos más allá de su efecto reductor de grasa, incluyendo sensibilización a la insulina, hipolipemiante, antiinflamación y antiaterosclerosis6,7. En humanos, la cantidad de grasa beige/marrón se correlaciona inversamente con la edad, el índice de resistencia a la insulina y los trastornos cardiometabólicos8. Además, la activación de los adipocitos beige/marrón en humanos por aclimatación en frío o agonista del receptor adrenérgico β3 confiere protección frente a una serie de trastornos metabólicos4,9,10. Estas evidencias indican colectivamente que la inducción de tejido adiposo marrón y beige es una estrategia terapéutica potencial para el manejo de la obesidad y sus complicaciones médicas ^{relacionadas8}.

Curiosamente, aunque comparten una función similar, los adipocitos beige y marrón clásico se derivan de diferentes precursores y se activan por mecanismos superpuestos pero ^distintos1. Por lo tanto, la imagen in vivo y la cuantificación de los adipocitos marrón y beige son esenciales para lograr una mejor comprensión del control molecular de estos tejidos adiposos. Actualmente, la tomografía por emisión de positrones (PET) con 18F-fluorodesoxiglucosa ([^18F]FDG) combinada con tomografía computarizada (TC) sigue siendo el estándar de oro para la caracterización de células termogénicas de color marrón y beige en estudios ^clínicos8. La resonancia magnética (MRI) utiliza potentes campos magnéticos y pulsos de radiofrecuencia para producir estructuras anatómicas detalladas. En comparación con la tomografía computarizada, la resonancia magnética genera imágenes de órganos y tejidos blandos con una resolución más alta. Aquí se proporciona un protocolo para la visualización y cuantificación de las adiposas funcionales de color marrón y beige en modelos de ratón después de la aclimatación a la exposición al frío, una forma común y más confiable de inducir el pardeamiento adiposo. Este método se puede aplicar para caracterizar los depósitos adiposos termogénicos en modelos de animales pequeños con alta precisión.

Protocolo

El protocolo que se describe a continuación sigue las pautas de cuidado animal de la Universidad de Hong Kong. Los animales utilizados en el estudio fueron ratones C57BL / 6J de 8 semanas de edad.

1. Procedimientos quirúrgicos en animales y desafío al frío

1. Realizar disección interescapular BAT (iBAT).
   1. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina (100 mg/kg de ketamina de peso corporal y 10 mg/kg de xilazina de peso corporal). Después de la anestesia, afeite el pelo del ratón desde el cuello hasta justo debajo de las escápulas.
   2. Coloque los ratones en la almohadilla térmica después de la desinfección y haga una incisión de 2 cm a lo largo de la línea media dorsal de los ratones.
   3. Retire las almohadillas iBAT (bilaterales). En el grupo operado simuladamente, haga la misma incisión pero deje intactas las almohadillas iBAT.
   4. Cierre la incisión con clips enrollados de acero inoxidable de 7 mm después de que se detenga el sangrado.
   5. Después de la cirugía, administre meloxicam (5 mg/kg en agua potable) a los ratones durante 6 días y aloje en una unidad de cuidados intensivos (UCI) durante 14 días. Retire los clips tan pronto como la herida esté curada (7-10 días).
2. Desafío en frío de los ratones: Alojar a los ratones en termoneutralidad (30 °C) durante 14 días. El día 13, enfríe previamente las jaulas de animales en frío (6 ° C) durante la noche. El día 14, coloque a los ratones a 6 ° C en la cámara ambiental durante 7 días. Coloque dos ratones en cada jaula.

2. Calibraciones micro-PET/MR y configuración del flujo de trabajo

NOTA: Las imágenes micro-PET/MR se realizan utilizando un sistema secuencial PET/MR (ver Tabla de Materiales). Cada ratón se coloca en el lecho de imágenes; primero escanee con la RM para obtener una referencia anatómica (vista de exploración) antes de avanzar al centro del campo de visión (FOV) de PET (FOV) de PET estático [^18F], seguido de imágenes de RM para referencia anatómica. Se crea un flujo de trabajo de imágenes en el software que opera el escáner (consulte la Tabla de materiales) para permitir escaneos PET/MR secuenciales automatizados antes de la sesión de imágenes.

1. Cree un flujo de trabajo de imágenes en el software operativo que incluya adquisición de PET estático, adquisiciones de RESONANCIA magnética para corrección de atenuación y referencia anatómica utilizando imágenes 3D con peso T1 e imágenes 2D ponderadas en T2, respectivamente.
2. Para adquirir PET, establezca una discriminación de nivel de 400-600 keV, isótopo de estudio F-18, modo de coincidencia de 1-5 y escaneos de 20 minutos.
3. Para adquirir RM ponderada en T1 (para corrección de atenuación), establezca Gradient Echo-3D (TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, FOV = 90 x 60 mm, número de excitaciones (NEX) = 3, 28 rodajas con 0,9 mm de grosor, tamaño del vóxel = 0,375 x 0,375 x 0,9 mm).
4. Para adquirir RM ponderada en T2 (referencia anatómica), establezca Fast-spin Echo 2D (TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 x 60 mm, NEX = 5, 32 rodajas con 0,9 mm de grosor, tamaño del vóxel = 0,265 x 0,268 x 0,9 ^mm3).
5. Para reconstruir PET, use el algoritmo Tera-Tomo 3D (TT3D) (8 iteraciones, 6 subconjuntos) con modo de coincidencia 1-3, y con correcciones de decaimiento, tiempo muerto, aleatorio, atenuación y dispersión para crear imágenes con un tamaño total de vóxel de ^{0.3 mm3} .
6. Realice una prueba de actividad PET del escáner micro-PET / MR un día antes del inicio del estudio de imágenes para verificar la precisión de la cuantificación de PET.
   1. Prepare una jeringa de 5 ml llena de [^18F]FDG según lo recomendado por las directrices del fabricante (140-220 μCi/5-8 MBq en agua o solución salina).
   2. Registre la actividad de la jeringa utilizando un calibrador de dosis (consulte la Tabla de materiales) y anote el tiempo de medición.
   3. Seleccione ROI de elipse interpolado para dibujar un volumen de interés (VOI) en la imagen reconstruida para comparar la actividad recuperada con el valor medido como se describió anteriormente. La actividad recuperada para un escáner bien calibrado tiene una precisión de ±5%.

3. Inyección de [^18F]FDG

1. Solicite una dosis clínica de [^18F]FDG (10 mCi/370 MBq) al proveedor para su llegada al laboratorio de imágenes aproximadamente 30 minutos antes de la primera inyección programada. Asegúrese de usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado, como una bata de laboratorio, guantes, dosímetro de radiación personal, por ejemplo, dedos, todo el cuerpo cuando reciba el paquete que contiene materiales radiactivos. Cambie los guantes regularmente para evitar la contaminación cruzada de la radiactividad y aumentar la distancia de la fuente radiactiva tanto como sea posible.
2. Utilice los fórceps para transferir cuidadosamente el vial de stock [^18F]FDG detrás de un protector de mesa de bloque L.
3. Dispensar una alícuota de [^18F]FDG y diluir con solución salina esterilizada para dar una concentración de actividad total a 200-250 μCi/7-9 MBq) en 100-150 μL.
4. Extraiga la solución [^18F]FDG en una jeringa de 1 ml con aguja (consulte la Tabla de materiales), mida la radiactividad utilizando un calibrador de dosis ajustado a F-18 y registre el tiempo de medición.
5. Registre el peso del ratón antes de la inyección. Inyecte la solución preparada [^18F]FDG a través de la vena de la cola. Tome nota del tiempo de inyección y del residuo de la radiactividad de la jeringa para permitir la corrección de la descomposición.
6. Vuelva a colocar el ratón en la jaula y permita la absorción de [^18F]FDG durante 60 minutos antes de las exploraciones PET.
7. Calcule la actividad de [^18F]FDG inyectada utilizando la siguiente ^fórmula11:
   Actividad inyectada (μCi/MBq)
   = Actividad en la jeringa antes de la inyección
   - actividad en la jeringa después de la inyección

4. Adquisición de Micro-PET/MR

1. Encienda el calentador de aire en la cama del ratón para permitir que el aire caliente pase a través de ella.
2. Anestesiar al ratón con isoflurano al 5% (1 L/min de _O2 médico). Una vez inducido, transfiera el ratón al lecho caliente del ratón y mantenga la anestesia al 2% -3 % de isoflurano a través de un cono de máscara nasal. Coloque la cabeza del ratón inclinada sobre la barra de mordida y asegúrese de que el ratón no sobresalga fuera del diámetro de la cama. Aplique lubricante para los ojos para evitar el secado y la formación de úlceras corneales.
3. Controle la temperatura corporal y la frecuencia respiratoria mediante una sonda térmica y una almohadilla respiratoria, respectivamente. Mantener la temperatura corporal a 36-37 °C, y la frecuencia respiratoria a 70-80 respiraciones por minuto (lpm) ajustando el nivel de isoflurano.
4. Realice una vista de exploración para determinar la posición del ratón. Ajuste la posición de la cama del ratón para incluir todo el cuerpo del ratón y para asegurarse de que el FOV central de la RM esté en el centro del cuerpo del ratón.
5. En la ventana Adquisición de PET en la lista de estudio, seleccione Rango de escaneo en adquisición anterior para usar la posición de vista de exploración como se describió anteriormente. Haga clic en Preparar para mover la cama del animal de MR a PET. Seleccione Aceptar para iniciar la exploración PET. Registre la dosis de inyección y el tiempo medido antes y después de la administración de [^18F]FDG en el Editor Radiofarmacéutico. Introduzca el peso del ratón en el menú Información del asunto .
6. Una vez completada la exploración PET, seleccione Preparar para pasar a MR y complete todas las adquisiciones de MR en la ventana de la lista de estudios. Seleccione Aceptar para iniciar los análisis de RM.
7. Una vez completado todo el flujo de trabajo, evalúe brevemente la calidad de las imágenes de MR adquiridas utilizando el software de posprocesamiento (consulte la Tabla de materiales). Haga clic en el botón Inicio para mover la cama del ratón de MR a la posición original.
8. Retire con cuidado el ratón del escáner y devuélvalo a una jaula de carcasa limpia con una almohadilla calentada debajo para permitir la recuperación en un ambiente cálido. Suministre al ratón comida y agua. El sistema ya está listo para el siguiente ratón en cola.
9. Para reconstruir los datos, seleccione Adquisición de PET en el menú Escaneo sin procesar para cargar el escaneo PET completado. Seleccione Adquisición de MR ponderada en T1 para la creación de mapas de materiales. Reconstruya los datos como se describió anteriormente (consulte el paso 2.5).
10. Siga las regulaciones locales e instituyentes con respecto al cuidado y manejo del ratón de imágenes post-PET. Considere todas las jeringas/ agujas, guantes, ropa de cama y materia fecal usadas como desechos radiactivos que requieren un manejo / eliminación especial de acuerdo con las regulaciones locales.

5. Análisis post-imagen

1. Abra el software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales) y haga clic en Cargar datos DICOM para recuperar las imágenes MR y PET correspondientes.
2. Realice el registro conjunto de la imagen MR y PET arrastrando estas imágenes a la ventana de visualización. Haga clic en la función Registro automático .
   1. Seleccione Transformación rígida en el menú desplegable Configuración de registro . Marque Mayús y Rotación en el menú Rígido/Afín .
   2. Seleccione Adquisición de MR ponderada T1 como Referencia y Adquisición de PET como Reslice en el menú Selección global de roles.
   3. Inspeccione el registro en las tres dimensiones para asegurarse de una alineación perfecta entre las imágenes MR y PET. Para ajustarlo manualmente, haga clic en Registro manual.
3. Utilice el ROI de elipse interpolado para dibujar VOI en el tejido de interés, es decir, iBAT y tejido adiposo blanco inguinal (iWAT) utilizando la imagen de RM como referencia. Utilice la herramienta Pincel y la herramienta Borrador para definir el borde VOI; de ahí la anatomía de los tejidos. Asegúrese de que no haya superposición mediante el uso de la imagen PET para evitar el derrame de los órganos vecinos. Repita el proceso diapositiva por diapositiva hasta que se delinee todo el VOI. Si es necesario, edite los VOI para mantener volúmenes VOI consistentes entre cada mouse.
4. Utilice VOI elipsoide para dibujar un VOI de ^{3 mm3} en el pulmón como órgano de referencia. Evite cualquier derrame del corazón y los músculos vecinos.
5. Al finalizar, haga clic en Mostrar tabla de ROI para cambiar el nombre de cada VOI. Registre la radiactividad media con el VOI y el volumen del tejido en una hoja de cálculo. Archive los dibujos VOI y los datos de imagen en un dispositivo de almacenamiento de datos.
6. Calcule el valor de absorción estandarizado (SUV) para todos los VOI utilizando la siguiente ^ecuación11:
   _SUVmean = radiactividad VOI en kBq / (Decay - dosis inyectada corregida en kBq / peso corporal del ratón en kg), suponiendo una densidad tisular de 1 g / ml.

Resultados

Tres grupos de ratones (n = 3 por grupo) se sometieron a imágenes micro-PET / MR en este estudio, donde fueron alojados en termoneutralidad (30 ° C) o frío (6 ° C) durante 7 días. A un grupo de ratones (n = 3) se les extirpó el iBAT (iBATx) antes del tratamiento con frío (Figura 1A). Este método condujo a una alteración de la actividad del tejido adiposo blanco en los tres ratones. En particular, se observó un aumento notable en la captación de [^18F]FDG en iWAT utilizan...

Discusión

En este estudio, se describió una imagen basada en PET / MR y cuantificación del tejido adiposo marrón y beige funcional en animales pequeños. Este método utiliza el análogo de glucosa no metabolizable [^18F]FDG como biomarcador de imagen para identificar los tejidos adiposos con alta demanda de glucosa de una manera no invasiva. La RM ofrece un buen contraste de tejidos blandos y puede diferenciar mejor los tejidos grasos adiposos de los tejidos blandos y músculos vecinos. Cuando se combina con PET, est...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sterile saline	BBraun		0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
Dose Calibrator	Biodex		Atomlab 500
Eye lubricant	Alcon Duratears		Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle
InterView Fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Isoflurane	Chanelle Pharma		Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
Metacam	Boehringer Ingelheim		5 mg/mL Meloxicam solution for injection for dogs and cats, 10 mL
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso		3 Tesla MR
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Wound clips	Reflex 7	203-100	7mm Stainless steel wound clips, 20 clips
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL