[18F]FDG Micro-PET/MR Görüntüleme Kullanılarak Farelerde Kahverengi ve Bej Yağ Dokularının Görselleştirilmesi ve Ölçülmesi

Özet

Mikro-PET/MR görüntüleme tabanlı bir yaklaşım kullanılarak farelerde termojenik yağ depolarının fonksiyonel görüntülenmesi ve kantitasyonu.

Özet

Kahverengi ve bej adipositler artık obezite ve metabolik sendromlar için potansiyel terapötik hedefler olarak kabul edilmektedir. Non-invaziv moleküler görüntüleme yöntemleri, bu termojenik yağ depolarına kritik bilgiler sağlamak için gereklidir. Burada protokol, fare interskapuler kahverengi yağ dokusunda (iBAT) ve inguinal subkutan beyaz yağ dokusunda (iWAT) kahverengi ve bej adipositlerin aktivitesini değerlendirmek için PET/MR görüntüleme tabanlı bir yöntem sunmaktadır. Termojenik yağ depolarının görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi, MR görüntüleme tarafından sağlanan hassas anatomik bilgilerle birleştirildiğinde, radyotracer olarak metabolize edilemeyen glikoz analoğu olan [^18F] FDG kullanılarak gerçekleştirildi. PET/MR görüntüleme, termojenik yağ dokularının nispi mobilizasyonunu değerlendirmek için soğuk iklimlendirmesinden 7 gün sonra yapıldı ve farklı yağ depolarında [^18F] FDG sinyalinin kantitasyonu yapıldı. iBAT'ın uzaklaştırılması, farelerin iWAT'ında soğuk kaynaklı [^18F] FDG alımını önemli ölçüde arttırdı.

Giriş

Değişen beslenme ihtiyaçlarına yanıt olarak, yağ dokusu vücudun ihtiyaçlarını karşılamak için lipit depolama veya mobilizasyon modunu benimsemek için bir enerji önbelleği görevi ^görür1. Dahası, yağ dokusu ayrıca, fakültatif termojenez olarak da adlandırılan titremeyen termojenez adı verilen bir işlemle termoregülasyonda önemli bir işlev görür. Bu tipik olarak, bol miktarda mitokondri membran proteini ayırma proteini 1'i (UCP1) ifade eden kahverengi yağ dokusu (BAT) ile elde edilir. Bir proton taşıyıcısı olarak UCP1, proton taşınımını ve ATP üretimini ayırarak ısı ^üretir2. Soğuk stimülasyon üzerine, BAT'taki termojenez, sempatik sinir sisteminin (SNS) aktivasyonu ile harekete geçirilir, ardından norepinefrin (NE) salınır. NE, β3 adrenerjik reseptörlerine bağlanır ve hücre içi siklik AMP'nin (cAMP) yükselmesine yol açar. Sonuç olarak, CREB'nin (cAMP yanıt elemanı bağlayıcı protein) cAMP / PKA'ya bağımlı etkileşimi, CREB-yanıt elemanlarına (CRE) doğrudan bağlanma yoluyla Ucp1 transkripsiyonunu uyarır^. BAT'a ek olarak, kahverengi benzeri adipositler beyaz yağ dokusunda da bulunur ve bu nedenle bej veya brit (beyazda kahverengi) hücreler olarak ^{adlandırılır1,3}. Belirli uyaranlara (soğuk algınlığı gibi) yanıt olarak, bu aksi takdirde sessiz bej hücreler, multiloküler lipit damlacıkları, yoğun bir şekilde paketlenmiş mitokondri ve artırılmış UCP1 ekspresyonu3,4,5 dahil olmak üzere çoklu kahverengi benzeri özellikler sergileyecek şekilde yeniden şekillendirilir.

Hayvan çalışmaları, kahverengi ve bej adipositlerin, yağ azaltıcı etkisinin ötesinde, insülin duyarlılaştırma, lipit düşürme, anti-inflamasyon ve anti-ateroskleroz dahil olmak üzere birçok metabolik faydaya sahip olduğunu ^{göstermiştir6,7}. İnsanlarda, bej / kahverengi yağ miktarı yaş, insülin direnç indeksi ve kardiyometabolik bozukluklarla ters ^{orantılıdır8}. Ayrıca, insanlarda bej/kahverengi adipositlerin soğuk iklimlendirme veya β3 adrenerjik reseptör agonisti ile aktivasyonu, bir dizi metabolik bozukluğa karşı koruma sağlar4,9,10. Bu kanıtlar toplu olarak kahverengi ve bej yağ dokusunun indüklenmesinin, obezite ve ilgili tıbbi komplikasyonların yönetimi için potansiyel bir terapötik strateji olduğunu ^{göstermektedir8}.

İlginçtir ki, benzer işlevi paylaşmalarına rağmen, bej ve klasik kahverengi adipositler farklı öncüllerden türetilir ve örtüşen ancak farklı mekanizmalarla aktive ^edilir1. Bu nedenle, kahverengi ve bej adipositlerin in vivo görüntülenmesi ve miktarının belirlenmesi, bu yağ dokularının moleküler kontrolünün daha iyi anlaşılması için gereklidir. Günümüzde bilgisayarlı tomografi (BT) ile kombine 18F-florodeoksiglukoz ([^18F]FDG) pozitron emisyon tomografisi (PET) taraması, klinik çalışmalarda termojenik kahverengi ve bej hücrelerin karakterizasyonunda altın standart olmaya devam ^etmektedir8. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG), ayrıntılı anatomik yapılar üretmek için güçlü manyetik alanlar ve radyo frekansı darbeleri kullanır. BT taraması ile karşılaştırıldığında, MRG daha yüksek çözünürlüğe sahip organların ve yumuşak dokuların görüntülerini üretir. Burada, soğuğa maruz kalmaya alıştıktan sonra fare modellerinde fonksiyonel kahverengi ve bej yağların görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için bir protokol, yağ kahverengileşmesini indüklemenin yaygın ve en güvenilir yoludur. Bu yöntem, küçük hayvan modellerinde termojenik yağ depolarını yüksek hassasiyetle karakterize etmek için uygulanabilir.

Protokol

Aşağıda açıklanan protokol, Hong Kong Üniversitesi'nin hayvan bakım yönergelerini takip etmektedir. Çalışmada kullanılan hayvanlar 8 haftalık C57BL / 6J fareleriydi.

1. Hayvan cerrahi prosedürleri ve soğuk meydan okuma

1. İnterskapüler BAT (iBAT) diseksiyonu gerçekleştirin.
   1. İntraperitoneal ketamin / ksilazin enjeksiyonu ile fareleri anestezik hale getirin (100 mg / kg vücut ağırlığı ketamin ve 10 mg / kg vücut ağırlığı ksilazin). Anesteziden sonra, farenin saçlarını boyundan kürek kemiğinin hemen altına tıraş edin.
   2. Dezenfeksiyondan sonra fareleri ısıtma yastığına yerleştirin ve farelerin dorsal orta çizgisi boyunca 2 cm'lik bir kesi yapın.
   3. iBAT pedlerini (iki taraflı) çıkarın. Sahte olarak çalıştırılan grupta, aynı kesiyi yapın, ancak iBAT pedlerini sağlam bırakın.
   4. Kanama durduktan sonra 7 mm paslanmaz çelik yara klipsleri kullanarak kesiyi kapatın.
   5. Ameliyattan sonra, farelere 6 gün boyunca meloksikam (içme suyunda 5 mg / kg) verin ve 14 gün boyunca yoğun bakım ünitesinde (YBÜ) barındırın. Yara iyileşir iyileşmez (7-10 gün) klipleri çıkarın.
2. Farelerin soğuk mücadelesi: Fareleri 14 gün boyunca termonötritede (30 ° C) barındırın. 13. günde, hayvan kafeslerini gece boyunca soğukta (6 ° C) önceden soğutun. 14. günde, fareleri 7 gün boyunca çevre odasında 6 ° C'ye koyun. Her kafese iki fare yerleştirin.

2. Mikro-PET/MR kalibrasyonları ve iş akışı kurulumu

NOT: Mikro-PET/MR görüntüleme, sıralı bir PET/MR sistemi kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Her fare görüntüleme yatağına yerleştirilir; statik [^18F]FDG PET edinimi için PET görüş alanının (FOV) merkezine ilerlemeden önce anatomik referans (izci görünümü) için MR ile tarama yapın, ardından anatomik referans için MR görüntüleme izleyin. Görüntüleme oturumundan önce otomatik, sıralı PET/MR taramalarını etkinleştirmek için tarayıcı çalıştıran yazılımda (bkz. Malzeme Tablosu) bir görüntüleme iş akışı oluşturulur.

1. İşletim yazılımında statik PET alımı, zayıflama düzeltmesi için MRI alımları ve sırasıyla T1-weigthed 3D görüntüleme ve T2 ağırlıklı 2D görüntüleme kullanarak anatomik referans içeren bir görüntüleme iş akışı oluşturun.
2. PET'i elde etmek için 400-600 keV seviyesinde ayrım, F-18 çalışma izotopu, 1-5 tesadüf modu ve 20 dakikalık taramalar ayarlayın.
3. T1 ağırlıklı MR elde etmek için (zayıflama düzeltmesi için), Degrade Echo-3D'yi ayarlayın (TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, FOV = 90 x 60 mm, uyarma sayısı (NEX) = 3, 0,9 mm kalınlığında 28 dilim, voksel boyutu = 0,375 x 0,375 x 0,9 mm).
4. T2 ağırlıklı MR (anatomik referans) elde etmek için Hızlı Döndürme Yankısı 2D'yi ayarlayın (TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 x 60 mm, NEX = 5, 0,9 mm kalınlığında 32 dilim, voksel boyutu = 0,265 x 0,268 x 0,9 ^mm3).
5. PET'i yeniden yapılandırmak için Tera-Tomo 3D (TT3D) algoritmasını (8 yineleme, 6 alt küme) 1-3 tesadüf moduyla ve bozulma, ölü zaman, rastgele, zayıflama ve dağılım düzeltmeleriyle kullanarak genel olarak 0,3 ^mm3 voksel boyutunda görüntüler oluşturun.
6. PET kantitasyonunun doğruluğunu kontrol etmek için görüntüleme çalışmasının başlamasından bir gün önce mikro-PET / MR tarayıcının PET Aktivite Testini gerçekleştirin.
   1. Üretici kılavuzlarının önerdiği şekilde [^18F]FDG ile doldurulmuş 5 mL'lik bir şırınga hazırlayın (su veya tuzlu suda 140-220 μCi/5-8 MBq).
   2. Şırınganın aktivitesini bir doz kalibratör kullanarak kaydedin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve ölçüm zamanını not edin.
   3. Kurtarılan etkinliği yukarıda açıklandığı gibi ölçülen değerle karşılaştırmak üzere yeniden oluşturulan görüntüye bir ilgi hacmi (VOI) çizmek için İnterpolasyonlu Elips YG'yi seçin. İyi kalibre edilmiş bir tarayıcı için geri kazanılan aktivite %±5 içinde doğrudur.

3. [^18F]FDG enjeksiyonu

1. İlk planlanan enjeksiyondan yaklaşık 30 dakika önce görüntüleme laboratuvarına gelmesi için tedarikçiden [^18F] FDG (10 mCi / 370 MBq) klinik dozunu sipariş edin. Radyoaktif maddeler içeren paketi alırken laboratuvar önlüğü, eldiven, kişisel radyasyon dozimetresi gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giydiğinizden emin olun, örneğin Parmaklar, tüm vücut. Radyoaktivitenin çapraz kontaminasyonunu önlemek ve radyoaktif kaynaktan olan mesafeyi mümkün olduğunca artırmak için eldivenleri düzenli olarak değiştirin.
2. Forsepsleri kullanarak [^18F]FDG stok şişesini L-blok masa üstü kalkanının arkasına dikkatlice aktarın.
3. Bir aliquot [18F]FDG dağıtın ve ^100-150 μL'de 200-250 μCi/7-9 MBq) toplam aktivite konsantrasyonu vermek için sterilize edilmiş salin ile seyreltin.
4. [^18F]FDG çözeltisini iğneli 1 mL'lik bir şırıngaya çekin (Malzeme Tablosuna bakınız), F-18'e ayarlanmış bir doz kalibratör kullanarak radyoaktiviteyi ölçün ve ölçüm zamanını kaydedin.
5. Enjeksiyondan önce farenin ağırlığını kaydedin. Hazırlanan [^18F]FDG çözeltisini kuyruk damarı yoluyla enjekte edin. Çürüme düzeltmesini sağlamak için enjeksiyon süresini ve şırınganın radyoaktivitesinin kalıntılarını not alın.
6. Fareyi tekrar kafese koyun ve PET taramalarından önce 60 dakika boyunca [^18F]FDG alımına izin verin.
7. Aşağıdaki formülü kullanarak enjekte edilen [^18F]FDG etkinliğini ^{hesaplayın11}:
   Enjekte edilen aktivite (μCi/MBq)
   = Enjeksiyondan önce şırıngadaki aktivite
   - enjeksiyondan sonra şırıngadaki aktivite

4. Mikro-PET/MR edinimi

1. Sıcak havanın içinden geçmesine izin vermek için ısıtıcıyı fare yatağına açın.
2. Fareyi% 5 izofluran (1 L / dak tıbbi _O2) kullanarak anestezi yapın. İndüklendikten sonra, fareyi sıcak fare yatağına aktarın ve anesteziyi bir burun maskesi konisi aracılığıyla% 2 -% 3 izofluranda tutun. Fare kafasını ısırık çubuğunun üzerine eğimli olarak konumlandırın ve farenin yatağın çapının dışına taşmadığından emin olun. Kornea ülserlerinin kurumasını ve oluşumunu önlemek için göz yağlayıcısı uygulayın.
3. Vücut ısısını ve solunum hızını sırasıyla bir termal prob ve bir solunum yastığı ile izleyin. İzofluran seviyesini ayarlayarak vücut ısısını 36-37 ° C'de ve solunum hızını dakikada 70-80 nefeste (bpm) tutun.
4. Fare konumunu belirlemek için bir keşif görünümü gerçekleştirin. Fare yatağı konumunu, tüm fare gövdesini içerecek ve MR'nin merkez FOV'unun fare gövdesinin merkezinde olduğundan emin olacak şekilde ayarlayın.
5. Etüt listesi penceresindeki PET Edinme altında, yukarıda açıklandığı gibi izci görünümü konumunu kullanmak için Önceki Edinimde Tarama Aralığı'nı seçin. Hayvan yatağını MR'den PET'e taşımak için Hazırla'ya tıklayın. PET taramasını başlatmak için Tamam'ı seçin. [^18F] FDG uygulamasından önce ve sonra ölçülen enjeksiyon dozunu ve süresini Radyofarmasötik Editör'e kaydedin. Konu Bilgileri menüsünün altına farenin ağırlığını girin.
6. PET taraması tamamlandıktan sonra, MR'ye geçmek için Hazırla'yı seçin ve çalışma listesi penceresindeki tüm MR alımlarını tamamlayın. MR taramalarını başlatmak için Tamam'ı seçin.
7. Tüm iş akışı tamamlandıktan sonra, işlem sonrası yazılımı kullanarak elde edilen MR görüntülerinin kalitesini kısaca değerlendirin (bkz. Fare yatağını MR'den orijinal konumuna taşımak için Ana Sayfa düğmesine tıklayın.
8. Fareyi tarayıcıdan dikkatlice çıkarın ve sıcak ortamda iyileşmeyi sağlamak için altında ısıtmalı bir ped bulunan temiz bir muhafaza kafesine geri koyun. Fareye yiyecek ve su sağlayın. Sistem artık sıradaki bir sonraki fare için hazırdır.
9. Verileri yeniden oluşturmak için, tamamlanan PET taramasını yüklemek üzere Ham Tarama menüsü altında PET Alımı'nı seçin. Malzeme haritası oluşturma için T1 ağırlıklı MR Alımı'nı seçin. Verileri yukarıda açıklandığı gibi yeniden oluşturun (bkz. adım 2.5).
10. PET sonrası görüntüleme faresinin bakımı ve kullanımı ile ilgili yerel ve enstitü yönetmeliklerine uyun. Kullanılmış tüm şırıngaları/iğneleri, eldivenleri, yatak takımlarını ve dışkı maddelerini yerel yönetmeliklere uygun olarak özel elleçleme/bertaraf gerektiren radyoaktif atıklar olarak düşünün.

5. Görüntüleme sonrası analiz

1. Görüntü Analizi yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu) ve ilgili MR ve PET görüntülerini almak için DICOM Verilerini Yükle'ye tıklayın.
2. MR ve PET görüntülerinin birlikte kaydını, bu görüntüleri görüntüleme penceresine sürükleyerek gerçekleştirin. Otomatik Kayıt fonksiyonuna tıklayın.
   1. Kayıt Ayarları açılır menüsünün altında Katı dönüşüm'ü seçin. Sert/Afin menüsünün altındaki Shift ve Rotation (Kaydırma ve Döndürme) seçeneğini işaretleyin.
   2. Global Rol Seçimi menüsü altında Referans olarak T1 ağırlıklı MR alımını ve Reslice olarak PET alımını seçin.
   3. MR ve PET görüntüleri arasında mükemmel bir uyum olduğundan emin olmak için kaydı üç boyutta da inceleyin. Manuel olarak ayarlamak için, Manuel Kayıt'a tıklayın.
3. Referans olarak MR görüntüsünü kullanarak ilgilenilen dokuya, yani iBAT ve kasık beyazı yağ dokusuna (iWAT) VOI çizmek için İnterpolasyonlu Elips ROI'yi kullanın. VOI kenarlığını tanımlamak için Fırça Aracı ve Silgi Aracı'nı kullanın; dolayısıyla dokuların anatomisi. Komşu organlardan yayılmayı önlemek için PET görüntüsünü kullanarak örtüşme alımı olmadığından emin olun. Tüm VOI tanımlanana kadar işlemi slayt slayt tekrarlayın. Gerekirse, her fare arasında tutarlı VOI hacimlerini korumak için VOI'leri düzenleyin.
4. Referans organ olarak akciğere 3 ^mm3 VOI çizmek için Elipsoid VOI kullanın. Komşu kalp ve kastan herhangi bir yayılmayı önleyin.
5. Tamamlandığında, her VOI'yi yeniden adlandırmak için YG Tablosunu Göster'e tıklayın. Ortalama radyoaktiviteyi VOI ve doku hacmi ile bir elektronik tabloya kaydedin. VOI çizimlerini ve görüntüleme verilerini bir veri depolama cihazında arşivleyin.
6. Aşağıdaki denklemi kullanarak tüm VOI'ler için standartlaştırılmış alım değerini (SUV) ^{hesaplayın11}:
   _SUVmean = kBq / 'de VOI radyoaktivitesi (Çürüme - kg cinsinden kBq / fare vücut ağırlığında düzeltilmiş enjekte edilen doz), 1 g / mL'lik bir doku yoğunluğu varsayarak.

Sonuçlar

Bu çalışmada üç grup fareye (grup başına n = 3) mikro-PET / MR görüntüleme uygulandı ve burada 7 gün boyunca termonötrite (30 ° C) veya soğuk (6 ° C) olarak yerleştirildiler. Bir grup fare (n = 3), soğuk muameleden önce iBAT'lerini (iBATx) çıkardı (Şekil 1A). Bu yöntem, her üç farede de beyaz yağ dokusu aktivitesinde bir değişikliğe yol açtı. Özellikle, mikro-PET/MR görüntüleme kullanılarak iWAT'ta [^18F]FDG alımında kayda değer bir artış g...

Tartışmalar

Bu çalışmada küçük hayvanlarda fonksiyonel kahverengi ve bej yağ dokusunun PET/MR tabanlı görüntülenmesi ve nicelleştirilmesi amaçlanmıştır. Bu yöntem, metabolize edilemeyen glukoz analoğunu [^18F] FDG'yi görüntüleme biyobelirteci olarak kullanır, böylece yüksek glikoz talebine sahip yağ dokularını invaziv olmayan bir şekilde tanımlar. MR iyi yumuşak doku kontrastı sunar ve yağ dokularını komşu yumuşak dokulardan ve kastan daha iyi ayırt edebilir. PET ile kombine edildiğind...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sterile saline	BBraun		0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
Dose Calibrator	Biodex		Atomlab 500
Eye lubricant	Alcon Duratears		Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle
InterView Fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Isoflurane	Chanelle Pharma		Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
Metacam	Boehringer Ingelheim		5 mg/mL Meloxicam solution for injection for dogs and cats, 10 mL
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso		3 Tesla MR
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Wound clips	Reflex 7	203-100	7mm Stainless steel wound clips, 20 clips
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL