Visualização e Quantificação de Tecidos Adiposos Marrons e Bege em Camundongos usando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Resumo

Imagem funcional e quantitação de depósitos de adiposos termogênicos em camundongos usando uma abordagem baseada em imagens micro-PET/MR.

Resumo

Os adipócitos marrons e beges são agora reconhecidos como potenciais alvos terapêuticos para obesidade e síndromes metabólicas. Métodos de imagem molecular não invasivos são essenciais para fornecer insights críticos sobre esses depósitos de adiposos termogênicos. Aqui, o protocolo apresenta um método baseado em imagem PET/MR para avaliar a atividade de adipócitos marrons e bege no tecido adiposo marrom interscapular do rato (iBAT) e tecido adiposo branco subcutâneo inguinal (iWAT). A visualização e quantificação dos depósitos de adiposos termogênicos foram obtidas utilizando-se ^o FDG ,o análogo de glicose não metabolizável, como o radiotracer, quando combinado com as informações anatômicas precisas fornecidas pela imagem mr. A imagem PET/MR foi realizada 7 dias após a aclimatação a frio e a quantitação do sinal FDG em diferentes depósitos adiposos foi realizada para avaliar a mobilização relativa de tecidos adiposos termogênicos. A remoção do iBAT aumentou substancialmente a captação de FDG evocada a frio no iWAT dos camundongos.

Introdução

Em resposta às mudanças nas necessidades nutricionais, o tecido adiposo serve como um cache energético para adotar o armazenamento lipíde ou o modo de mobilização para atender às necessidades do ^corpo1. Além disso, o tecido adiposo também desempenha uma função fundamental na termoregulação, através de um processo chamado termogênese não-trêmica, também chamado de termogênese facultativa. Isso é tipicamente conseguido pelo tecido adiposo marrom (BAT), que expressa um nível abundante de proteína de membrana mitocôndria desacoplamento da proteína 1 (UCP1). Como portador de prótons, o UCP1 gera calor desacoplando o transporte de prótons e a produção ^ATP2. Após a estimulação a frio, a termogênese no BAT é iniciada pela ativação do sistema nervoso simpático (SNS), seguido pela liberação de norepinefrina (NE). Ne se liga aos receptores β3 adrenérgicos e leva à elevação do AMP cíclico intracelular (cAMP). Como consequência, o engajamento dependente de cAMP/PKA do CREB (proteína vinculante de elemento de resposta cAMP) estimula a transcrição do Ucp1 por meio de vinculação direta aos elementos de resposta creb (CRE)². Além do BAT, os adipócitos de forma marrom também são encontrados dentro do tecido adiposo branco e são, portanto, chamados de células bege ou brite (marrom-em-branco)^1,3. Em resposta a estímulos específicos (como o frio), essas células bege quiescentes são remodeladas para exibir múltiplas características semelhantes a marrons, incluindo gotículas lipídicas multiloculares, mitocôndrias densamente embaladas e expressão aumentada de UCP13,4,5.

Estudos em animais demonstraram que os adipócitos marrons e beges possuem múltiplos benefícios metabólicos além de seu efeito redutor de gordura, incluindo a sensibilização da insulina, redução lipídica, anti-inflamação e anti-aterosclerose6,7. Em humanos, a quantidade de gordura bege/marrom está inversamente correlacionada com a idade, índice de resistência à insulina e distúrbios cardiometabólicos8. Além disso, a ativação de adipócitos bege/marrom em humanos por aclimatação fria ou β3 agonista receptor adrenérgico confere proteção contra uma série de distúrbios metabólicos4,9,10. Essas evidências indicam coletivamente que a indução do tecido adiposo marrom e bege é uma estratégia terapêutica potencial para o manejo da obesidade e suas complicações médicas ^{relacionadas8}.

Curiosamente, embora compartilhem função semelhante, adipócitos bege e castanhos clássicos são derivados de diferentes precursores e ativados por mecanismos sobrepostos, mas ^distintos1. Portanto, a imagem in vivo e a quantificação de adipócitos marrons e beges são essenciais para obter uma melhor compreensão do controle molecular desses tecidos adiposos. Atualmente^{, a} tomografia de emissão de pósitrons (PET) combinada com tomografia computadorizada (TC) continua sendo o padrão ouro para caracterização de células parógênicas e bege termogênicas em estudos ^clínicos8. A ressonância magnética (MrI) utiliza poderosos campos magnéticos e pulsos de radiofrequência para produzir estruturas anatômicas detalhadas. Em comparação com a tomografia computadorizada, a ressonância magnética gera imagens de órgãos e tecidos moles com maior resolução. Fornecido aqui é um protocolo para visualização e quantificação de adiposos marrons e bege funcionais em modelos de camundongos após aclimatação à exposição a frio, uma maneira comum e mais confiável de induzir o browning adiposo. Este método pode ser aplicado para caracterizar os depósitos de adiposos termogênicos em pequenos modelos animais com alta precisão.

Protocolo

O protocolo descrito abaixo segue as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Hong Kong. Os animais utilizados no estudo foram camundongos C57BL/6J de 8 semanas de idade.

1. Procedimentos cirúrgicos animais e desafio frio

1. Realize a dissecção bat (iBAT) interescapular.
   1. Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina (100 mg/kg de cetamina bodyweight e 10 mg/kg de xilazina). Após anestesia, raspe o cabelo do rato do pescoço até logo abaixo da escápula.
   2. Coloque os ratos na almofada de aquecimento após a desinfecção e faça uma incisão de 2 cm ao longo da linha média dorsal dos camundongos.
   3. Remova as almofadas iBAT (bilaterais). No grupo operado por farsas, faça a mesma incisão, mas deixe as almofadas iBAT intactas.
   4. Feche a incisão usando clipes de aço inoxidável de 7 mm depois que o sangramento parar.
   5. Após a cirurgia, dê meloxicam (5 mg/kg em água potável) aos camundongos por 6 dias e abriga-os em uma unidade de terapia intensiva (UTI) por 14 dias. Remova os clipes assim que a ferida estiver curada (7-10 dias).
2. Desafio frio dos ratos: Abrigar os ratos na termoneutralidade (30 °C) por 14 dias. No dia 13, pré-chill as gaiolas animais em frio (6 °C) durante a noite. No dia 14, coloque os ratos a 6°C na câmara ambiental por 7 dias. Coloque dois ratos em cada gaiola.

2. Calibrações micro-PET/MR e configuração do fluxo de trabalho

NOTA: A imagem micro-PET/MR é realizada utilizando um sistema PET/MR sequencial (ver Tabela de Materiais). Cada rato é colocado na cama de imagem; primeiro digitalize com o MR para uma referência anatômica (visão de scout) antes de avançar para o centro do campo de visão PET (FOV) para uma aquisição estática [^18F]FDG PET, seguida de imagem MR para referência anatômica. Um fluxo de trabalho de imagem é criado no software operacional do scanner (ver Tabela de Materiais) para permitir varreduras PET/MR automatizadas e sequenciais antes da sessão de imagem.

1. Crie um fluxo de trabalho de imagem no software operacional que inclua aquisição estática de PET, aquisições de ressonância magnética para correção de atenuação e referência anatômica usando imagens 3D t1-weigthed e imagem 2D ponderada t2, respectivamente.
2. Para adquirir PET, estabeleça discriminação de nível de 400-600 keV, isótopo de estudo F-18, modo 1-5 coincidência e 20 min de varreduras.
3. Para adquirir MR ponderado T1 (para correção de atenuação), defina Gradiente Echo-3D (TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, FOV = 90 x 60 mm, número de excitações (NEX) = 3, 28 fatias com espessura de 0,9 mm, tamanho do voxel = 0,375 x 0,375 x 0,9 mm).
4. Para adquirir MR ponderado T2 (referência anatômica), defina o Fast-spin Echo 2D (TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 x 60 mm, NEX = 5, 32 fatias com espessura de 0,9 mm, tamanho do voxel = 0,265 x 0,268 x ^0,93 mm).
5. Para reconstruir o PET, use o algoritmo Tera-Tomo 3D (TT3D) (8 iterações, 6 subconjuntos) com modo coincidência 1-3, e com decaimento, tempo morto, atenuação aleatória e correções de dispersão para criar imagens com um tamanho geral de ^{0,3 mm3} voxel.
6. Realize um teste de atividade PET do scanner micro-PET/MR um dia antes do início do estudo de imagem para verificar a precisão da quantitação PET.
   1. Prepare uma seringa de 5 mL preenchida com [^18F]FDG conforme recomendado pelas diretrizes do fabricante (140-220 μCi/5-8 MBq em água ou soro fisiológico).
   2. Registo a atividade da seringa utilizando um calibrador de dose (ver Tabela de Materiais) e observe o tempo de medição.
   3. Selecione ROI de Elipse Interpolada para desenhar um VOI de volume de interesse (VOI) na imagem reconstruída para comparar a atividade recuperada com o valor medido como descrito acima. A atividade recuperada para um scanner bem calibrado é precisa dentro de ±5%.

3. Injeção de [^18F]FDG

1. Peça uma dose clínica de FDG (¹⁰ mCi/370 MBq) do fornecedor para sua chegada ao laboratório de imagem aproximadamente 30 minutos antes da primeira injeção programada. Certifique-se de usar equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, como um jaleco, luvas, dosímetro de radiação pessoal, por exemplo, dedos, corpo inteiro ao receber a embalagem contendo materiais radioativos. Troque as luvas regularmente para evitar a contaminação cruzada da radioatividade e aumente a distância da fonte radioativa o máximo possível.
2. Use os fórceps para transferir cuidadosamente o frasco de estoque FDG [^18F]atrás de um escudo superior de mesa de bloco L.
3. Dispense uma alíquota de FDG [^18F]e dilua com soro fisiológico esterilizado para dar uma concentração total de atividade em 200-250 μCi/7-9 MBq) em 100-150 μL.
4. Desenhe a solução FDG [^18F]em uma seringa de 1 mL com agulha (ver Tabela de Materiais), meça a radioatividade usando um calibrador de dose definido para F-18 e registe o tempo de medição.
5. Regisso o peso do mouse antes da injeção. Injete a solução FDG ^{preparada através da} veia traseira. Tome nota do tempo de injeção e resíduo da radioatividade da seringa para permitir a correção da decomposição.
6. Coloque o mouse de volta na gaiola e deixe [^18F]captação de FDG por 60 minutos antes do PET scans.
7. Calcule a atividade de FDG injetada [^18F]usando a seguinte ^fórmula11:
   Atividade injetada (μCi/MBq)
   = Atividade na seringa antes da injeção
   - atividade na seringa após injeção

4. Aquisição de Micro-PET/MR

1. Ligue o aquecedor de ar para a cama do rato para permitir que o ar quente passe por ele.
2. Anestesiar o mouse usando 5% de isoflurane (1 L/min médico _O2). Uma vez induzido, transfira o rato para a cama quente do rato e mantenha a anestesia em 2%-3 % isoflurane através de um cone de máscara de nariz. Posicione a cabeça do mouse na barra de mordida e certifique-se de que o mouse não se projede fora do diâmetro da cama. Aplique lubrificante ocular para evitar a secagem e formação de úlceras córneas.
3. Monitore a temperatura corporal e a taxa respiratória por uma sonda térmica e uma almofada respiratória, respectivamente. Mantenha a temperatura corporal a 36-37 °C, e a taxa respiratória a 70-80 respirações por minuto (bpm) ajustando o nível de isoflurane.
4. Execute uma visão de batedor para determinar a posição do mouse. Ajuste a posição da cama do mouse para incluir todo o corpo do mouse, e para garantir que o FOV central de MR esteja no centro do corpo do mouse.
5. De acordo com a aquisição pet na janela de lista de estudo, selecione Faixa de varredura na aquisição anterior para usar a posição de exibição do scout conforme descrito acima. Clique em Prepare-se para mover a cama animal de MR para PET. Selecione OK para iniciar a varredura PET. Registo da dose de injeção e tempo medido antes e ^{depois da administração} FDG no Editor Radiofarmacêutico. Digite o peso do mouse no menu Informações de Assunto .
6. Uma vez concluída a varredura PET, selecione Preparar para mover-se para MR e concluir todas as aquisições de MR na janela da lista de estudo. Selecione OK para iniciar as varreduras de Mr.
7. Após todo o fluxo de trabalho ser concluído, avalie brevemente a qualidade das imagens de MR adquiridas usando o software pós-processamento (ver Tabela de Materiais). Clique no botão Home para mover a cama do mouse do MR para a posição original.
8. Remova cuidadosamente o mouse do scanner e devolva-o a uma gaiola de habitação limpa com uma almofada aquecida por baixo para permitir a recuperação em ambiente quente. Forneça comida e água ao rato. O sistema está pronto para o próximo mouse na fila.
9. Para reconstruir os dados, selecione a aquisição pet no menu Raw Scan para carregar a varredura PET concluída. Selecione A aquisição mr ponderada t1 para a criação de mapas materiais. Reconstrua os dados descritos acima (ver passo 2.5).
10. Siga as normas locais e do instituto sobre o cuidado e manuseio do mouse de imagem pós-PET. Considere todas as seringas/agulhas usadas, luvas, roupas de cama e matéria fecal como resíduos radioativos que requerem manuseio/descarte especial de acordo com as normas locais.

5. Análise pós-imagem

1. Abra o software de Análise de Imagem (ver Tabela de Materiais) e clique em Carregar dados DICOM para recuperar as imagens MR e PET correspondentes.
2. Realize o co-registro da imagem MR e PET arrastando essas imagens para a janela de exibição. Clique na função Registro Automático .
   1. Selecione a transformação rígida no menu suspenso da configuração de registro . Verifique Shift e Rotação no menu Rígido/Affine .
   2. Selecione a aquisição de MR ponderada por T1 como a aquisição de Referência e PET como a Reslice no menu Seleção de Funções Globais.
   3. Inspecione o registro nas três dimensões para garantir um alinhamento perfeito entre as imagens MR e PET. Para ajustá-lo manualmente, clique em Registro Manual.
3. Use ROI de Elipse Interpolada para desenhar VOI no tecido de interesse, ou seja, iBAT e tecido adiposo branco inguinal (iWAT) usando imagem MR para referência. Use a ferramenta pincéis e a ferramenta de borracha para definir a borda VOI; daí, a anatomia dos tecidos. Certifique-se de que não há absorção de sobreposição usando imagem PET para evitar derramamento dos órgãos vizinhos. Repita o processo slide-by-slide até que todo o VOI esteja delineado. Se necessário, edite os VOIs para manter volumes de VOI consistentes entre cada mouse.
4. Use Ellipsoid VOI para desenhar um VOI de ^{3 mm3} no pulmão como órgão de referência. Evite qualquer derramamento do coração e músculo vizinhos.
5. Após a conclusão, clique em Mostrar tabela ROI para renomear cada VOI. Grave a radioatividade média com o VOI e o volume de tecido em uma planilha. Arquive os desenhos voi e os dados de imagem em um dispositivo de armazenamento de dados.
6. Calcule o valor de absorção padronizado (SUV) para todos os VOIs usando a seguinte ^equação11:
   _SUVMEAN = Radioatividade VOI no kBq / (Decay - dose injetada corrigida no kBq / peso corporal do rato em kg), assumindo uma densidade tecidual de 1 g/mL.

Resultados

Três grupos de camundongos (n = 3 por grupo) foram submetidos a imagens micro-PET/MR neste estudo, onde estavam alojados em termoneutralidade (30 °C) ou frio (6 °C) durante 7 dias. Um grupo de camundongos (n = 3) teve seu iBAT removido (iBATx) antes do tratamento frio (Figura 1A). Este método levou a uma alteração na atividade do tecido adiposo branco em todos os três camundongos. Em particular, observou-se um aumento notável na absorção de FDG [^18F], utilizando-se image...

Discussão

Neste estudo, foi descrita uma imagem baseada em PET/MR e quantificação de tecido adiposo marrom e bege funcional em animais de pequeno porte. Este método utiliza o análogo de glicose não metabolizável [^18F]FDG como biomarcador de imagem para identificar os tecidos adiposos com alta demanda de glicose de forma não invasiva. Mr oferece bom contraste de tecido mole e pode diferenciar melhor os tecidos adiposos dos tecidos moles e músculos vizinhos. Quando combinado com PET, isso permite a imagem e quanti...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sterile saline	BBraun		0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
Dose Calibrator	Biodex		Atomlab 500
Eye lubricant	Alcon Duratears		Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle
InterView Fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Isoflurane	Chanelle Pharma		Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
Metacam	Boehringer Ingelheim		5 mg/mL Meloxicam solution for injection for dogs and cats, 10 mL
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso		3 Tesla MR
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Wound clips	Reflex 7	203-100	7mm Stainless steel wound clips, 20 clips
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL