[18F]FDGマイクロPET/MRイメージングを用いたマウスの褐色およびベージュ色の脂肪組織の可視化と定量化

要約

マイクロPET/MRイメージングベースのアプローチを用いたマウスにおける熱発生性脂肪デポーの機能イメージングおよび定量。

要約

褐色およびベージュ色の脂肪細胞は、現在、肥満およびメタボリックシンドロームの潜在的な治療標的として認識されている。非侵襲的分子イメージング法は、これらの熱発生性脂肪貯蔵所に重要な洞察を提供するために不可欠です。ここで、プロトコルは、マウス肩甲骨間褐色脂肪組織(iBAT)および鼠径部皮下白色脂肪組織(iWAT)における褐色およびベージュ色の脂肪細胞の活性を評価するためのPET/MRイメージングベースの方法を提示する。熱発生性脂肪貯蔵所の可視化および定量は、MRイメージングによって提供される正確な解剖学的情報と組み合わせると、放射性トレーサーとして非代謝可能なグルコース類似体である[^18F]FDGを使用して達成された。PET/MRイメージングは、熱発生脂肪組織の相対的動員を評価するために、低温馴化および異なる脂肪デポーにおける[^18F]FDGシグナルの定量が行われた7日後に実施された。iBATの除去は、マウスのiWATにおける冷熱誘発[^18F]FDG取り込みを実質的に増加させた。

概要

変化する栄養ニーズに対応して、脂肪組織は、身体のニーズを満たすために脂質貯蔵または動員モードのいずれかを採用するためのエネルギーキャッシュとして機能します¹。さらに、脂肪組織はまた、通性熱発生とも呼ばれる非震え熱発生と呼ばれるプロセスを介して、体温調節において重要な機能を果たしている。これは典型的には、褐色脂肪組織(BAT)によって達成され、豊富なレベルのミトコンドリア膜タンパク質脱共役タンパク質1(UCP1)を発現する。プロトンキャリアとして、UCP1はプロトン輸送とATP生成²を解離して発熱します。低温刺激を受けると、BATにおける熱発生は交感神経系の活性化(SNS)によって動き始め、続いてノルエピネフリン(NE)の放出が続く。NEはβ3アドレナリン作動性受容体に結合し、細胞内サイクリックAMP(cAMP)の上昇をもたらす。その結果、CREBのcAMP/PKA依存性の関与(cAMP応答エレメント結合タンパク質)は、CREB応答エレメント(CRE)²への直接結合を介してUcp1転写を刺激する。BATに加えて、褐色様脂肪細胞も白色脂肪組織内に見出されるため、ベージュまたはブライト(ブラウン・イン・ホワイト)細胞と命名される^1,3。特定の刺激(寒さなど)に応答して、これらの静止ベージュ細胞は、多座性脂肪滴、密集したミトコンドリア、および増強されたUCP1発現を含む複数の茶色様の特徴を示すように改造される³、^4、5。

動物実験では、褐色およびベージュ色の脂肪細胞が、インスリン感作、脂質低下、抗炎症、および抗アテローム性動脈硬化症を含む、脂肪減少効果を超えて複数の代謝利益を有することが実証されている^6,7。ヒトでは、ベージュ色/褐色の脂肪の量は、年齢、インスリン抵抗性指数、および心臓代謝障害と反比例します⁸。さらに、低温馴化またはβ3アドレナリン受容体アゴニストのいずれかによるヒトにおけるベージュ色/褐色脂肪細胞の活性化は、一連の代謝障害に対する保護を与える^4,9,10。これらの証拠は、褐色およびベージュ色の脂肪組織の誘導が肥満およびそれに関連する医学的合併症の管理のための潜在的な治療戦略であることを集合的に示している⁸。

興味深いことに、ベージュ色と古典褐色の脂肪細胞は同様の機能を共有していますが、異なる前駆体に由来し、重複しているが別個のメカニズムによって活性化されます¹。したがって、褐色およびベージュ色の脂肪細胞のインビボイメージングおよび定量化は、これらの脂肪組織の分子制御のより良い理解を達成するために不可欠である。現在、18F-フルオロデオキシグルコース([^18F]FDG)陽電子放射断層撮影(PET)スキャンとコンピュータ断層撮影法(CT)の組み合わせは、臨床研究における熱発生性褐色およびベージュ色の細胞の特性評価のゴールドスタンダードのままです⁸。磁気共鳴イメージング(MRI)は、強力な磁場と無線周波数パルスを使用して、詳細な解剖学的構造を生成します。CTスキャンと比較して、MRIはより高い解像度で臓器や軟部組織の画像を生成します。ここでは、低温曝露に順応した後のマウスモデルにおける機能性褐色およびベージュ脂肪の視覚化および定量化のためのプロトコルが提供され、脂肪の褐変を誘発する一般的で最も信頼性の高い方法である。この方法は、小動物モデルにおける熱発生性脂肪貯蔵所を高精度に特徴付けるために適用することができる。

プロトコル

以下に説明するプロトコルは、香港大学の動物ケアガイドラインに従っています。本試験に用いた動物は、8週齢のC57BL/6Jマウスであった。

1. 動物の外科的処置とコールドチャレンジ

1. 肩甲骨間バット(iBAT)解剖を行う。
   1. ケタミン/キシラジン(100mg/kg体重ケタミンおよび10mg/kg体重キシラジン)の腹腔内注射によりマウスを麻酔する。麻酔後、マウスの髪を首から肩甲骨のすぐ下まで剃ります。
   2. 消毒後にマウスを加熱パッドの上に置き、マウスの背側正中線に沿って2cmの切開を行う。
   3. iBAT パッド (両側) を取り外します。偽操作グループでは、同じ切開を行いますが、iBATパッドはそのままにしておきます。
   4. 出血が止まった後、7mmのステンレス製の巻線クリップを使用して切開部を閉じます。
   5. 手術後、メロキシカム(飲料水中5mg / kg)をマウスに6日間与え、集中治療室(ICU)に14日間収容する。傷が治癒したらすぐにクリップを取り外します(7-10日)。
2. マウスのコールドチャレンジ:マウスを熱中性(30°C)で14日間飼育する。13日目に、動物ケージを寒さ(6°C)で一晩予冷する。14日目に、マウスを環境チャンバー内に6°Cで7日間入れた。各ケージに2匹のマウスを置きます。

2. マイクロPET/MRキャリブレーションとワークフロー設定

メモ:マイクロPET/MRイメージングは、シーケンシャルPET/MRシステムを使用して実行されます( 材料表を参照)。各マウスはイメージングベッド上に置かれます。最初にMRで解剖学的参照(スカウトビュー)をスキャンしてから、静的な[^18F]FDG PET取得のためにPET視野(FOV)の中心に進み、続いて解剖学的参照のためにMRイメージングを行います。イメージングワークフローは、スキャナ操作ソフトウェア( 材料表を参照)で作成され、イメージングセッションの前に自動化されたシーケンシャルPET/MRスキャンを可能にします。

1. 静的PET取得、減衰補正のためのMRI取得、およびT1ウェイグス3DイメージングとT2強調2Dイメージングを使用した解剖学的参照を含むイメージングワークフローをオペレーティングソフトウェアで作成します。
2. PETを取得するには、400-600keVレベルの識別、F-18研究同位体、1-5コインシデンスモード、および20分のスキャンを設定します。
3. T1 強調 MR (減衰補正用) を取得するには、グラジエント エコー-3D (TE = 4.3 ms、TR = 16 ms、FOV = 90 x 60 mm、励起数 (NEX) = 3、厚さ 0.9 mm のスライス 28 枚、ボクセルサイズ = 0.375 x 0.375 x 0.9 mm) を設定します。
4. T2 強調 MR (解剖学的リファレンス) を取得するには、ファストスピンエコー 2D (TE = 71.8 ms、TR = 3000 ms、FOV = 90 x 60 mm、NEX = 5、厚さ 0.9 mm のスライスを 32 枚、ボクセルサイズ = 0.265 x 0.268 x 0.9 ^mm3) に設定します。
5. PETを再構築するには、Tera-Tomo 3D(TT3D)アルゴリズム(8反復、6サブセット)を使用し、1〜3の一致モード、減衰補正、デッドタイム補正、ランダム補正、減衰補正、散乱補正を使用して、ボクセルサイズが全体的に0.3mm3の画像を作成します。
6. イメージング研究開始の1日前にマイクロPET/MRスキャナーのPET活性試験を行い、PET定量の精度を確認します。
   1. 製造元のガイドライン(水または生理食塩水で140-220 μCi/5-8 MBq)で推奨されているように、[^18F]FDGで満たされた5 mLシリンジを準備します。
   2. 用量校正器( 材料表を参照)を使用してシリンジの活性を記録し、測定時刻を書き留めます。
   3. 補間楕円ROIを選択して、再構成された画像上に関心体積(VOI)を描画し、回復された活性を上記のように測定された値と比較する。十分に校正されたスキャナーの回収されたアクティビティは、±5%以内の精度です。

3. [^18F]FDGの注入

1. [^18F]FDG(10 mCi/370 MBq)の臨床用量をサプライヤーに注文し、最初の予定された注射の約30分前にイメージングラボに到着します。放射性物質を含むパッケージを受け取るときは、ラボコート、手袋、個人用放射線線量計(指など)、全身などの適切な個人用保護具(PPE)を必ず着用してください。放射能の交差汚染を防ぎ、放射能源からの距離をできるだけ長くするために、手袋を定期的に交換してください。
2. 鉗子を使用して、[^18F]FDGストックバイアルをLブロックテーブルトップシールドの後ろに慎重に移します。
3. [^18F]FDGのアリコートを分注し、滅菌生理食塩水で希釈して、100-150 μLで200-250 μCi/7-9 MBq)の総活性濃度を得た。
4. [^18F]FDG溶液を針付きの1mLシリンジに引き込み( 材料表を参照)、F-18にセットした線量校正器を用いて放射能を測定し、測定時間を記録する。
5. 注射前にマウスの体重を記録します。調製した[^18F]FDG溶液を尾静脈を介して注入する。シリンジの放射能の注入時間と残留物に注意して、崩壊補正を有効にします。
6. マウスをケージに戻し、PETスキャンの前に[^18F]FDGを60分間取り込みます。
7. 注入された[^18F]FDG活性を、以下の式¹¹を用いて計算する:
   注入された活性(μCi/MBq)
   = 注射前のシリンジ内の活性
   - 注射後のシリンジ内の活性

4. マイクロペット/MR取得

1. マウスベッドのエアヒーターをオンにして、暖かい空気がマウスベッドを通過できるようにします。
2. 5%イソフルラン(1 L/min医療用_O2)を使用してマウスを麻酔する。誘導されたら、マウスを暖かいマウスベッドに移し、鼻マスクコーンを介して2%〜3%イソフルランで麻酔を維持する。マウスの頭を噛み付きバーの上に置き、マウスがベッドの直径の外側にはみ出していないことを確認します。角膜潰瘍の乾燥および形成を避けるために、眼の潤滑剤を塗布する。
3. 体温と呼吸数をそれぞれサーマルプローブと呼吸パッドで監視します。体温を36~37°Cに維持し、呼吸数を毎分70~80呼吸(bpm)に維持し、イソフルラン値を調整します。
4. スカウトビューを実行して、マウスの位置を確認します。マウスのベッド位置を調整して、マウス本体全体を含め、MRの中心FOVがマウス本体の中心にあることを確認します。
5. 試験リストウィンドウの PET 取得で、 前回の取得でスキャン範囲 を選択して、上記のようにスカウトビューの位置を使用します。 [準備] をクリックして、動物のベッドをMRからPETに移動します。[ OK ] を選択して PET スキャンを開始します。[^18F]FDG投与前後に測定した注射用量と時間を 放射性医薬品エディターに記録します。 [被写体情報] メニューの下にマウスの太さを入力します。
6. PETスキャンが完了したら、MRに移動し、試験リストウィンドウですべての MR取得を完了するために準備 を選択します。[ OK ] を選択して MR スキャンを開始します。
7. ワークフロー全体が完了したら、後処理ソフトウェアを使用して、取得したMR画像の品質を簡単に評価します( 材料表を参照)。 ホーム ボタンをクリックして、マウスベッドをMRから元の位置に移動します。
8. スキャナーからマウスを慎重に取り外し、暖かい環境での回復を可能にするために、下に加熱パッドがある清潔なハウジングケージに戻します。マウスに食物と水を供給します。これで、システムはキュー内の次のマウスの準備が整いました。
9. データを再構築するには、[未加工スキャン]メニューの[PET集録]を選択して、完了したPETスキャンをロードします。材料マップの作成に [T1 加重 MR 取得]を選択します。上記のようにデータを再構築します (ステップ 2.5 を参照)。
10. PET後のイメージングマウスのケアと取り扱いに関する地元および研究所の規制に従ってください。使用済みの注射器/針、手袋、寝具、糞便はすべて放射性廃棄物であり、現地の規制に従って特別な取り扱い/廃棄が必要です。

5. ポストイメージング解析

1. 画像解析ソフトウェア(材料表を参照)を開き、[DICOMデータのロード]をクリックして、対応するMRおよびPET画像を取得します。
2. MR画像とPET画像の連登録は、これらの画像を表示ウィンドウにドラッグして行います。 自動登録 機能をクリックします。
   1. [登録設定]ドロップダウンメニューの[剛体変換]を選択します。剛体/アフィンメニューの下にあるシフトと回転にチェックを入れます。
   2. 「グローバルロール選択」メニューの「参照」として「T1 加重 MR 取得」を選択し、「再スライス」として PET 取得を選択します。
   3. 3 次元すべての登録を検査して、MR 画像と PET 画像が完全に揃っていることを確認します。手動で調整するには、[ 手動登録]をクリックします。
3. 補間楕円ROIを使用して、参照用のMR画像を使用して、関心組織、すなわちiBATおよび鼠径部白色脂肪組織(iWAT)上にVOIを描画する。ブラシツールと消しゴムツールを使用して、VOI 境界線を定義します。したがって、組織の解剖学。隣接する臓器からの波及を避けるために、PET画像を使用してオーバーラップ取り込みがないことを確認してください。VOI全体が線引きされるまで、このプロセスをスライドごとに繰り返します。必要に応じて、VOI を編集して、各マウス間で一貫した VOI ボリュームを維持します。
4. 楕円体VOIを使用して、基準臓器として肺に^3mm3のVOIを描画します。隣接する心臓や筋肉からのこぼれを避けてください。
5. 完了したら、[ ROI テーブルの表示 ] をクリックして、各 VO の名前を変更します。VOIと組織体積で平均放射能をスプレッドシートに記録します。VOI図面とイメージングデータをデータストレージデバイスにアーカイブします。
6. 次の式¹¹を使用して、すべてのVOIの標準化された取り込み値(SUV)を計算します。
   _SUVmean = VOI放射能(kBq)/(減衰-補正注入用量(kBq/マウス体重(kg))を、組織密度を1g/mLと仮定した。

結果

この研究では、3群のマウス(1群あたりn = 3匹)がマイクロPET/MRイメージングを受け、そこで熱中性(30°C)または低温(6°C)のいずれかで7日間飼育した。1群のマウス(n=3)は、低温処理の前にiBATを除去した(iBATx)。この方法は、3匹のマウス全てにおいて白色脂肪組織活性の変化をもたらした。特に、[^18F]FDG取り込みの顕著な増加は、マイクロPET/MRイメージングを用いたiWAT...

ディスカッション

この研究では、PET/MRベースのイメージングと、小動物における機能的な茶色およびベージュの脂肪組織の定量化が記述されました。この方法は、非代謝性グルコース類似体[^18F]FDGをイメージングバイオマーカーとして使用し、非侵襲的な方法でグルコース需要の高い脂肪組織を同定する。MRは良好な軟部組織のコントラストを提供し、脂肪脂肪組織を隣接する軟部組織および筋肉から?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sterile saline	BBraun		0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
Dose Calibrator	Biodex		Atomlab 500
Eye lubricant	Alcon Duratears		Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle
InterView Fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Isoflurane	Chanelle Pharma		Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
Metacam	Boehringer Ingelheim		5 mg/mL Meloxicam solution for injection for dogs and cats, 10 mL
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso		3 Tesla MR
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Wound clips	Reflex 7	203-100	7mm Stainless steel wound clips, 20 clips
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL