Visualizzazione e quantificazione dei tessuti adiposi marroni e beige nei topi utilizzando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Riepilogo

Imaging funzionale e quantificazione di depositi adiposi termogenici nei topi utilizzando un approccio basato sull'imaging micro-PET/MR.

Abstract

Gli adipociti marroni e beige sono ora riconosciuti come potenziali bersagli terapeutici per l'obesità e le sindromi metaboliche. I metodi di imaging molecolare non invasivi sono essenziali per fornire informazioni critiche su questi depositi adiposi termogenici. Qui, il protocollo presenta un metodo basato sull'imaging PET / MR per valutare l'attività degli adipociti marroni e beige nel tessuto adiposo bruno interscapolare di topo (iBAT) e nel tessuto adiposo bianco sottocutaneo inguinale (iWAT). La visualizzazione e la quantificazione dei depositi adiposi termogenici sono state ottenute utilizzando [^18F]FDG, l'analogo del glucosio non metabolizzabile, come radiotracciante, quando combinato con le precise informazioni anatomiche fornite dall'imaging MR. L'imaging PET/MR è stato condotto 7 giorni dopo l'acclimatazione a freddo e la quantificazione del segnale [^18F]FDG in diversi depositi adiposi è stata condotta per valutare la mobilizzazione relativa dei tessuti adiposi termogenici. La rimozione di iBAT ha aumentato sostanzialmente l'assorbimento di [^18F] FDG evocato dal freddo in iWAT dei topi.

Introduzione

In risposta alle mutevoli esigenze nutrizionali, il tessuto adiposo funge da cache di energia per adottare la modalità di stoccaggio dei lipidi o di mobilizzazione per soddisfare le esigenze del ^corpo1. Inoltre, il tessuto adiposo svolge anche una funzione chiave nella termoregolazione, attraverso un processo chiamato termogenesi non tremante, chiamato anche termogenesi facoltativa. Ciò è tipicamente ottenuto dal tessuto adiposo bruno (BAT), che esprime un livello abbondante di proteina di disaccoppiamento della proteina di membrana dei mitocondri 1 (UCP1). Come vettore di protoni, UCP1 genera calore disaccoppiando il trasporto di protoni e la produzione di ^ATP2. Dopo la stimolazione a freddo, la termogenesi nella BAT viene messa in moto dall'attivazione del sistema nervoso simpatico (SNS), seguita dal rilascio di noradrenalina (NE). NE si lega ai recettori adrenergici β3 e porta all'elevazione dell'AMP ciclico intracellulare (cAMP). Di conseguenza, l'impegno cAMP/PKA-dipendente di CREB (cAMP response element-binding protein) stimola la trascrizione di Ucp1 tramite il legame diretto sugli elementi di risposta CREB (CRE)². Oltre alla BAT, gli adipociti simili al marrone si trovano anche all'interno del tessuto adiposo bianco e sono quindi denominati cellule beige o brite (marrone in bianco)^1,3. In risposta a stimoli specifici (come il freddo), queste cellule beige altrimenti quiescenti vengono rimodellate per mostrare molteplici caratteristiche simili al marrone, tra cui goccioline lipidiche multiloculari, mitocondri densamente imballati e espressione aumentata di UCP13,4,5.

Studi su animali hanno dimostrato che gli adipociti marroni e beige possiedono molteplici benefici metabolici oltre al suo effetto di riduzione del grasso, tra cui sensibilizzazione all'insulina, abbassamento dei lipidi, anti-infiammazione e anti-aterosclerosi6,7. Nell'uomo, la quantità di grasso beige / marrone è inversamente correlata con l'età, l'indice di insulino-resistenza e i disturbi cardiometabolici8. Inoltre, l'attivazione degli adipociti beige/marroni nell'uomo mediante acclimatazione a freddo o agonista del recettore adrenergico β3 conferisce protezione contro una serie di disturbi metabolici4,9,10. Queste prove indicano collettivamente che l'induzione del tessuto adiposo marrone e beige è una potenziale strategia terapeutica per la gestione dell'obesità e delle relative complicanze ^mediche8.

È interessante notare che, sebbene condividano una funzione simile, gli adipociti beige e marrone classico sono derivati da precursori diversi e attivati da meccanismi sovrapposti ma ^distinti1. Pertanto, l'imaging in vivo e la quantificazione degli adipociti marroni e beige sono essenziali per ottenere una migliore comprensione del controllo molecolare di questi tessuti adiposi. Attualmente la tomografia ad emissione di positroni (PET) 18F-fluorodeossiglucosio ([^18F]FDG) combinata con la tomografia computerizzata (CT) rimane il gold standard per la caratterizzazione delle cellule termogeniche marroni e beige negli studi ^clinici8. La risonanza magnetica (MRI) utilizza potenti campi magnetici e impulsi a radiofrequenza per produrre strutture anatomiche dettagliate. Rispetto alla TAC, la risonanza magnetica genera immagini di organi e tessuti molli con una risoluzione più elevata. Qui è fornito un protocollo per la visualizzazione e la quantificazione degli adiposi funzionali marroni e beige nei modelli murini dopo l'acclimatazione all'esposizione al freddo, un modo comune e più affidabile per indurre l'imbrunimento adiposo. Questo metodo può essere applicato per caratterizzare con alta precisione i depositi adiposi termogenici in modelli animali di piccole dimensioni.

Protocollo

Il protocollo descritto di seguito segue le linee guida per la cura degli animali dell'Università di Hong Kong. Gli animali utilizzati nello studio erano topi C57BL / 6J di 8 settimane.

1. Procedure chirurgiche animali e sfida a freddo

1. Eseguire la dissezione BAT interscapolare (iBAT).
   1. Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina/xilazina (100 mg/kg di ketamina a corpo libero e 10 mg/kg di xilazina peso corporeo). Dopo l'anestesia, radere i capelli del topo dal collo a appena sotto le scapole.
   2. Posizionare i topi sulla piastra riscaldante dopo la disinfezione e fare un'incisione di 2 cm lungo la linea mediana dorsale dei topi.
   3. Rimuovere i pad iBAT (bilaterali). Nel gruppo operato in modo fittizio, fare la stessa incisione ma lasciare intatti i cuscinetti iBAT.
   4. Chiudere l'incisione utilizzando clip avvolte in acciaio inossidabile da 7 mm dopo che l'emorragia si è fermata.
   5. Dopo l'intervento chirurgico, somministrare meloxicam (5 mg / kg in acqua potabile) ai topi per 6 giorni e ospitarli in un'unità di terapia intensiva (ICU) per 14 giorni. Rimuovere le clip non appena la ferita è guarita (7-10 giorni).
2. Sfida fredda dei topi: ospita i topi a termoneutralità (30 ° C) per 14 giorni. Il giorno 13, pre-raffreddare le gabbie degli animali a freddo (6 ° C) durante la notte. Il giorno 14, metti i topi a 6 °C nella camera ambientale per 7 giorni. Metti due topi in ogni gabbia.

2. Calibrazioni Micro-PET/MR e configurazione del flusso di lavoro

NOTA: l'imaging micro-PET/MR viene eseguito utilizzando un sistema PET/MR sequenziale (vedere Tabella dei materiali). Ogni mouse è posizionato sul letto di imaging; prima scansione con la MR per un riferimento anatomico (vista scout) prima di avanzare al centro del campo visivo PET (FOV) per un'acquisizione PET statica [^18F]FDG, seguita da imaging MR per riferimento anatomico. Nel software operativo dello scanner viene creato un flusso di lavoro di imaging (vedere Tabella dei materiali) per consentire scansioni PET/MR automatizzate e sequenziali prima della sessione di imaging.

1. Crea un flusso di lavoro di imaging nel software operativo che includa l'acquisizione PET statica, le acquisizioni MRI per la correzione dell'attenuazione e il riferimento anatomico utilizzando rispettivamente l'imaging 3D con peso T1 e l'imaging 2D ponderato T2.
2. Per acquisire PET, impostare la discriminazione del livello di 400-600 keV, l'isotopo di studio F-18, la modalità di coincidenza 1-5 e le scansioni di 20 minuti.
3. Per acquisire MR ponderato T1 (per la correzione dell'attenuazione), impostare Gradient Echo-3D (TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, FOV = 90 x 60 mm, numero di eccitazioni (NEX) = 3, 28 fette con spessore 0,9 mm, dimensione voxel = 0,375 x 0,375 x 0,9 mm).
4. Per acquisire MR (riferimento anatomico) ponderato T2, impostare Fast-spin Echo 2D (TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 x 60 mm, NEX = 5, 32 fette con spessore 0,9 mm, dimensione voxel = 0,265 x 0,268 x 0,9 ^mm3).
5. Per ricostruire il PET, utilizzare l'algoritmo Tera-Tomo 3D (TT3D) (8 iterazioni, 6 sottoinsiemi) con la modalità di coincidenza 1-3 e con correzioni di decadimento, tempo morto, casualità, attenuazione e dispersione per creare immagini con una dimensione complessiva di ^{0,3 mm3} voxel.
6. Eseguire un pet activity test dello scanner micro-PET/MR un giorno prima dell'inizio dello studio di imaging per verificare l'accuratezza della quantificazione PET.
   1. Preparare una siringa da 5 ml riempita con [^18F]FDG come raccomandato dalle linee guida del produttore (140-220 μCi/5-8 MBq in acqua o soluzione salina).
   2. Registrare l'attività della siringa utilizzando un calibratore di dose (vedere Tabella dei materiali) e annotare il tempo di misurazione.
   3. Selezionare ROI ellisse interpolata per disegnare un volume di interesse (VOI) sull'immagine ricostruita per confrontare l'attività recuperata con il valore misurato come descritto sopra. L'attività recuperata per uno scanner ben calibrato è accurata entro ±5%.

3. Iniezione di [^18F]FDG

1. Ordinare una dose clinica di [^18F]FDG (10 mCi/370 MBq) dal fornitore per il suo arrivo al laboratorio di imaging circa 30 minuti prima della prima iniezione programmata. Assicurarsi di indossare adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI), come un camice da laboratorio, guanti, dosimetro di radiazioni personali, ad esempio dita, tutto il corpo quando si riceve la confezione contenente materiali radioattivi. Cambiare regolarmente i guanti per evitare la contaminazione incrociata della radioattività e aumentare il più possibile la distanza dalla sorgente radioattiva.
2. Utilizzare la pinza per trasferire con attenzione il flaconcino [^18F]FDG dietro uno scudo da tavolo con blocco a L.
3. Erogare un'aliquota di [^18F]FDG e diluire con soluzione salina sterilizzata per dare una concentrazione di attività totale a 200-250 μCi/7-9 MBq) in 100-150 μL.
4. Aspirare la soluzione [^18F]FDG in una siringa da 1 mL con ago (vedere Tabella dei materiali), misurare la radioattività utilizzando un calibratore di dose impostato su F-18 e registrare il tempo di misurazione.
5. Registrare il peso del mouse prima dell'iniezione. Iniettare la soluzione di [^18F]FDG preparata attraverso la vena della coda. Prendere nota del tempo di iniezione e del residuo della radioattività della siringa per consentire la correzione del decadimento.
6. Rimetti il mouse nella gabbia e lascia che [^18F] FDG prenda per 60 minuti prima delle scansioni PET.
7. Calcolare l'attività [^18F]FDG iniettata utilizzando la seguente ^formula11:
   Attività iniettata (μCi/MBq)
   = Attività nella siringa prima dell'iniezione
   - attività nella siringa dopo l'iniezione

4. Acquisizione di micro-PET/MR

1. Accendere il riscaldatore d'aria sul letto del mouse per consentire all'aria calda di attraversarlo.
2. Anestetizzare il mouse utilizzando il 5% di isoflurano (1 L/min di _O2 medico). Una volta indotto, trasferire il mouse nel letto caldo del topo e mantenere l'anestesia al 2% -3% di isoflurano tramite un cono maschera nasale. Posizionare la testa del mouse prona sulla barra del morso e assicurarsi che il mouse non sporga al di fuori del diametro del letto. Applicare lubrificante per gli occhi per evitare l'essiccazione e la formazione di ulcere corneali.
3. Monitorare la temperatura corporea e la frequenza respiratoria rispettivamente con una sonda termica e un cuscinetto respiratorio. Mantenere la temperatura corporea a 36-37 °C e la frequenza respiratoria a 70-80 respiri al minuto (bpm) regolando il livello di isoflurano.
4. Eseguire una vista scout per determinare la posizione del mouse. Regolare la posizione del letto del mouse per includere l'intero corpo del mouse e per assicurarsi che il FOV centrale di MR sia al centro del corpo del mouse.
5. Nella finestra Acquisizione PET nell'elenco degli studi, selezionare Intervallo di scansione su acquisizione precedente per utilizzare la posizione di visualizzazione scout come descritto sopra. Fare clic su Prepara per spostare il letto animale da MR a PET. Selezionare OK per avviare la scansione PET. Registrare la dose di iniezione e il tempo misurato prima e dopo la somministrazione di [^18F]FDG nell'editor radiofarmaceutico. Immettere il peso del mouse nel menu Informazioni soggetto .
6. Una volta completata la scansione PET, selezionare Prepara per passare alla RM e completare tutte le acquisizioni MR nella finestra dell'elenco degli studi. Selezionare OK per avviare le scansioni MR.
7. Una volta completato l'intero flusso di lavoro, valutare brevemente la qualità delle immagini MR acquisite utilizzando il software di post-elaborazione (vedere Tabella dei materiali). Fare clic sul pulsante Home per spostare il letto del mouse da MR alla posizione originale.
8. Rimuovere con attenzione il mouse dallo scanner e riportarlo in una gabbia pulita con un pad riscaldato sotto per consentire il recupero in ambienti caldi. Fornire al mouse cibo e acqua. Il sistema è ora pronto per il prossimo mouse in coda.
9. Per ricostruire i dati, selezionare Acquisizione PET nel menu Scansione raw per caricare la scansione PET completata. Selezionare Acquisizione MR ponderata T1 per la creazione di mappe dei materiali. Ricostruire i dati come descritto sopra (vedere il passaggio 2.5).
10. Seguire le normative locali e di istituto relative alla cura e alla gestione del topo di imaging post-PET. Considerare tutte le siringhe / aghi usati, guanti, biancheria da letto e materia fecale come rifiuti radioattivi che richiedono una manipolazione / smaltimento speciale in conformità con le normative locali.

5. Analisi post-imaging

1. Aprire il software di analisi delle immagini (vedere Tabella dei materiali) e fare clic su Carica dati DICOM per recuperare le immagini MR e PET corrispondenti.
2. Eseguire la co-registrazione dell'immagine MR e PET trascinando queste immagini nella finestra di visualizzazione. Fare clic sulla funzione Registrazione automatica .
   1. Selezionare Trasformazione rigida nel menu a discesa Impostazione registrazione . Selezionate Maiusc e Rotazione (Rotation) nel menu Rigido/Affine (Rigid/Affine ).
   2. Selezionare l'acquisizione MR ponderata T1 come riferimento e l'acquisizione PET come Reslice nel menu Selezione ruolo globale .
   3. Ispezionare la registrazione in tutte e tre le dimensioni per assicurarsi un perfetto allineamento tra le immagini MR e PET. Per regolarlo manualmente, fare clic su Registrazione manuale.
3. Usa il ROI dell'ellisse interpolata per disegnare VOI sul tessuto di interesse, cioè iBAT e tessuto adiposo bianco inguinale (iWAT) usando l'immagine MR come riferimento. Utilizzare lo strumento pennello e lo strumento gomma per definire il bordo VOI; quindi, l'anatomia dei tessuti. Assicurarsi che non vi sia alcun assorbimento di sovrapposizioni utilizzando l'immagine PET per evitare ricadute dagli organi vicini. Ripetere il processo slide-by-slide fino a delineare l'intero VOI. Se necessario, modificare i VOI per mantenere volumi VOI coerenti tra ciascun mouse.
4. Utilizzare Ellipsoid VOI per disegnare un VOI di ^{3 mm3} sul polmone come organo di riferimento. Evitare qualsiasi spillover dal cuore e dal muscolo vicini.
5. Al termine, fare clic su Mostra tabella ROI per rinominare ogni VOI. Registrare la radioattività media con il VOI e il volume del tessuto in un foglio di calcolo. Archiviare i disegni VOI e i dati di imaging in un dispositivo di archiviazione dati.
6. Calcolare il valore di assorbimento standardizzato (SUV) per tutti i VOI utilizzando la seguente ^equazione11:
   _SUVmean = radioattività VOI in kBq / (Decadimento - dose iniettata corretta in kBq / peso corporeo del topo in kg), assumendo una densità tissutale di 1 g / mL.

Risultati

Tre gruppi di topi (n = 3 per gruppo) sono stati sottoposti a micro-PET/MR imaging in questo studio, dove sono stati alloggiati a termoneutralità (30 °C) o a freddo (6 °C) per 7 giorni. Un gruppo di topi (n = 3) ha avuto il loro iBAT rimosso (iBATx) prima del trattamento a freddo (Figura 1A). Questo metodo ha portato ad un'alterazione dell'attività del tessuto adiposo bianco in tutti e tre i topi. In particolare, un notevole aumento dell'assorbimento di [^18F]FDG è stato osser...

Discussione

In questo studio, è stata descritta un'imaging e una quantificazione basati su PET / MR del tessuto adiposo marrone e beige funzionale in piccoli animali. Questo metodo utilizza l'analogo del glucosio non metabolizzabile [^18F]FDG come biomarcatore di imaging in modo da identificare i tessuti adiposi con elevata domanda di glucosio in modo non invasivo. La RM offre un buon contrasto tra i tessuti molli e può differenziare meglio i tessuti adiposi dai tessuti molli e dai muscoli vicini. Se combinato con la PET...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sterile saline	BBraun		0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
Dose Calibrator	Biodex		Atomlab 500
Eye lubricant	Alcon Duratears		Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle
InterView Fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Isoflurane	Chanelle Pharma		Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
Metacam	Boehringer Ingelheim		5 mg/mL Meloxicam solution for injection for dogs and cats, 10 mL
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso		3 Tesla MR
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Wound clips	Reflex 7	203-100	7mm Stainless steel wound clips, 20 clips
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL