Visualisation et quantification des tissus adipeux bruns et beiges chez la souris à l’aide de l’imagerie micro-PET/MR [18F]FDG

Résumé

Imagerie fonctionnelle et quantification des dépôts adipeux thermogéniques chez la souris à l’aide d’une approche basée sur l’imagerie micro-TEP/IRM.

Résumé

Les adipocytes bruns et beiges sont maintenant reconnus comme des cibles thérapeutiques potentielles pour l’obésité et les syndromes métaboliques. Les méthodes d’imagerie moléculaire non invasives sont essentielles pour fournir des informations essentielles sur ces dépôts adipeux thermogéniques. Ici, le protocole présente une méthode basée sur l’imagerie TEP/IRM pour évaluer l’activité des adipocytes bruns et beiges dans le tissu adipeux brun interscapulaire (iBAT) de souris et le tissu adipeux blanc sous-cutané inguinal (iWAT). La visualisation et la quantification des dépôts adipeux thermogéniques ont été réalisées en utilisant [^18F]FDG, l’analogue du glucose non métabolisable, comme radiotraceur, lorsqu’ils sont combinés avec les informations anatomiques précises fournies par imagerie par résonance magnétique. L’imagerie TEP/RM a été réalisée 7 jours après l’acclimatation au froid et la quantification du signal [^18F]FDG dans différents dépôts adipeux a été réalisée pour évaluer la mobilisation relative des tissus adipeux thermogéniques. L’élimination de l’iBAT a considérablement augmenté l’absorption de [^18F]FDG évoquée par le froid dans l’iWAT des souris.

Introduction

En réponse à l’évolution des besoins nutritionnels, le tissu adipeux sert de cache énergétique pour adopter soit le mode de stockage des lipides, soit le mode de mobilisation pour répondre aux besoins du ^corps1. De plus, le tissu adipeux joue également un rôle clé dans la thermorégulation, via un processus appelé thermogenèse non frissonnante, également appelée thermogenèse facultative. Ceci est généralement réalisé par le tissu adipeux brun (BAT), qui exprime un niveau abondant de protéine de découplage de la protéine membranaire mitochondriale 1 (UCP1). En tant que vecteur de protons, UCP1 génère de la chaleur en découplant le transport de protons et la production d’ATP2. Lors de la stimulation par le froid, la thermogenèse dans les MTD est déclenchée par l’activation du système nerveux sympathique (SNS), suivie de la libération de noradrénaline (NE). NE se lie aux récepteurs adrénergiques β3 et conduit à une élévation de l’AMP cyclique intracellulaire (AMPc). En conséquence, l’engagement dépendant de l’AMPc/PKA du CREB (cAMP response element-binding protein) stimule la transcription Ucp1 via une liaison directe sur les éléments de réponse CREB (CRE)². En plus des BAT, les adipocytes bruns se trouvent également dans le tissu adipeux blanc et sont donc appelés cellules beiges ou brite (brun-en-blanc)^1,3. En réponse à des stimuli spécifiques (tels que le froid), ces cellules beiges autrement quiescentes sont remodelées pour présenter de multiples caractéristiques brunes, y compris des gouttelettes lipidiques multiloculaires, des mitochondries densément emballées et une expression augmentée d’UCP13,4,5.

Des études animales ont démontré que les adipocytes bruns et beiges possèdent de multiples avantages métaboliques au-delà de son effet de réduction des graisses, y compris la sensibilisation à l’insuline, l’abaissement des lipides, l’anti-inflammation et l’anti-athérosclérose6,7. Chez l’homme, la quantité de graisse beige/brune est inversement corrélée à l’âge, à l’indice de résistance à l’insuline et aux troubles cardiométaboliques8. De plus, l’activation des adipocytes beiges/bruns chez l’homme par acclimatation au froid ou par agoniste des récepteurs adrénergiques β3 confère une protection contre une série de troubles métaboliques4,9,10. Ces éléments de preuve indiquent collectivement que l’induction du tissu adipeux brun et beige est une stratégie thérapeutique potentielle pour la prise en charge de l’obésité et de ses complications médicales ^connexes8.

Fait intéressant, bien qu’ils partagent une fonction similaire, les adipocytes beiges et bruns classiques sont dérivés de précurseurs différents et activés par des mécanismes qui se chevauchent mais sont ^distincts1. Par conséquent, l’imagerie in vivo et la quantification des adipocytes bruns et beiges sont essentielles pour mieux comprendre le contrôle moléculaire de ces tissus adipeux. Actuellement, la tomographie par émission de positons (TEP) 18F-fluorodésoxyglucose ([^18F]FDG) combinée à la tomodensitométrie (TDM) reste la référence en matière de caractérisation des cellules thermogéniques brunes et beiges dans les études ^cliniques8. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) utilise de puissants champs magnétiques et des impulsions de radiofréquence pour produire des structures anatomiques détaillées. Par rapport à la tomodensitométrie, l’IRM génère des images d’organes et de tissus mous avec une résolution plus élevée. Voici un protocole de visualisation et de quantification des adiposes fonctionnelles brunes et beiges dans des modèles murins après acclimatation à l’exposition au froid, un moyen courant et le plus fiable d’induire un brunissement adipeux. Cette méthode peut être appliquée pour caractériser les dépôts adipeux thermogéniques dans des modèles de petits animaux avec une grande précision.

Protocole

Le protocole décrit ci-dessous suit les directives de soins aux animaux de l’Université de Hong Kong. Les animaux utilisés dans l’étude étaient des souris C57BL/6J âgées de 8 semaines.

1. Interventions chirurgicales chez les animaux et provocation au froid

1. Effectuer une dissection interscapulaire BAT (iBAT).
   1. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine (100 mg/kg de kétamine au poids corporel et 10 mg/kg de xylazine au poids corporel). Après l’anesthésie, rasez les poils de la souris du cou jusqu’à juste en dessous des omoplates.
   2. Placez les souris sur le coussin chauffant après la désinfection et faites une incision de 2 cm le long de la ligne médiane dorsale des souris.
   3. Retirez les tampons iBAT (bilatéraux). Dans le groupe opéré simulé, faites la même incision mais laissez les tampons iBAT intacts.
   4. Fermez l’incision à l’aide de clips en acier inoxydable de 7 mm après l’arrêt du saignement.
   5. Après la chirurgie, donnez du méloxicam (5 mg / kg dans l’eau potable) aux souris pendant 6 jours et hébergez-les dans une unité de soins intensifs (USI) pendant 14 jours. Retirez les clips dès que la plaie est guérie (7-10 jours).
2. Défi froid des souris: Hébergez les souris à la thermoneutralité (30 ° C) pendant 14 jours. Le jour 13, pré-refroidir les cages d’animaux dans le froid (6 ° C) pendant la nuit. Le jour 14, mettez les souris à 6 °C dans la chambre environnementale pendant 7 jours. Placez deux souris dans chaque cage.

2. Étalonnages micro-PET/MR et configuration du flux de travail

REMARQUE : L’imagerie micro-PET/MR est réalisée à l’aide d’un système PET/MR séquentiel (voir tableau des matériaux). Chaque souris est placée sur le lit d’imagerie; d’abord scanner avec l’IRM pour une référence anatomique (vue éclaireuse) avant d’avancer au centre du champ de vision PET (FOV) pour une acquisition statique [^18F]FDG PET, suivie de l’imagerie MR pour référence anatomique. Un flux de travail d’imagerie est créé dans le logiciel d’exploitation du scanner (voir Table des matériaux) pour permettre des scans PET/MR automatisés et séquentiels avant la session d’imagerie.

1. Créez un flux de travail d’imagerie dans le logiciel d’exploitation qui comprend l’acquisition TEP statique, les acquisitions IRM pour la correction de l’atténuation et la référence anatomique à l’aide de l’imagerie 3D t1 et de l’imagerie 2D pondérée T2, respectivement.
2. Pour acquérir le PET, définissez une discrimination de niveau de 400 à 600 keV, un isotope d’étude F-18, un mode de coïncidence de 1 à 5 et des balayages de 20 minutes.
3. Pour acquérir le MR pondéré T1 (pour la correction de l’atténuation), réglez Gradient Echo-3D (TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, FOV = 90 x 60 mm, nombre d’excitations (NEX) = 3, 28 tranches d’une épaisseur de 0,9 mm, taille du voxel = 0,375 x 0,375 x 0,9 mm).
4. Pour acquérir le MR pondéré T2 (référence anatomique), réglez Fast-spin Echo 2D (TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 x 60 mm, NEX = 5, 32 tranches de 0,9 mm d’épaisseur, taille du voxel = 0,265 x 0,268 x 0,9 ^mm3).
5. Pour reconstruire la TEP, utilisez l’algorithme Tera-Tomo 3D (TT3D) (8 itérations, 6 sous-ensembles) avec un mode coïncidence 1-3 et avec des corrections de désintégration, de temps mort, aléatoires, d’atténuation et de dispersion pour créer des images d’une taille globale de voxel de ^{0,3 mm3} .
6. Effectuer un test d’activité PET du scanner micro-PET/MR un jour avant le début de l’étude d’imagerie pour vérifier l’exactitude de la quantification PET.
   1. Préparer une seringue de 5 mL remplie de [^18F]FDG comme recommandé par les directives du fabricant (140-220 μCi/5-8 MBq dans de l’eau ou une solution saline).
   2. Enregistrez l’activité de la seringue à l’aide d’un calibrateur de dose (voir tableau des matériaux) et notez l’heure de la mesure.
   3. Sélectionnez Roi de l’ellipse interpolée pour dessiner un volume d’intérêt (VOI) sur l’image reconstruite afin de comparer l’activité récupérée à la valeur mesurée comme décrit ci-dessus. L’activité récupérée pour un scanner bien calibré est précise dans les ±5%.

3. Injection de [^18F]FDG

1. Commandez une dose clinique de [^18F]FDG (10 mCi/370 MBq) au fournisseur pour son arrivée au laboratoire d’imagerie environ 30 min avant la première injection prévue. Assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, tel qu’un blouse de laboratoire, des gants, un dosimètre de rayonnement personnel, par exemple les doigts, tout le corps lorsque vous recevez le colis contenant des matières radioactives. Changez régulièrement de gants pour éviter la contamination croisée de la radioactivité et augmenter autant que possible la distance par rapport à la source radioactive.
2. Utilisez les pinces pour transférer soigneusement le flacon de stock [^18F]FDG derrière un bouclier de table en L-block.
3. Distribuer une aliquote de [^18F]FDG et diluer avec une solution saline stérilisée pour obtenir une concentration d’activité totale à 200-250 μCi/7-9 MBq) dans 100-150 μL.
4. Prélever la solution de [^18F]FDG dans une seringue de 1 mL avec aiguille (voir tableau des matériaux), mesurer la radioactivité à l’aide d’un étalonneur de dose réglé sur F-18 et enregistrer le temps de mesure.
5. Enregistrez le poids de la souris avant l’injection. Injecter la solution [^18F]FDG préparée par la veine caudale. Prenez note du temps d’injection et des résidus de la radioactivité de la seringue pour permettre la correction de la carie.
6. Remettez la souris dans la cage et laissez l’absorption de [^18F]FDG pendant 60 minutes avant la TEP.
7. Calculez l’activité [^18F]FDG injectée à l’aide de la formule ¹¹ suivante :
   Activité injectée (μCi/MBq)
   = Activité dans la seringue avant l’injection
   - activité dans la seringue après injection

4. Acquisition de micro-PET/MR

1. Allumez le réchauffeur d’air sur le lit de la souris pour permettre à l’air chaud de le traverser.
2. Anesthésier la souris à l’aide de 5% d’isoflurane (1 L/min _d’O2 médical). Une fois induite, transférez la souris sur le lit chaud de la souris et maintenez l’anesthésie à 2% -3% d’isoflurane via un cône de masque nasal. Positionnez la tête de la souris sur la barre de morsure et assurez-vous que la souris ne dépasse pas du diamètre du lit. Appliquez du lubrifiant pour les yeux pour éviter le dessèchement et la formation d’ulcères cornéens.
3. Surveillez la température corporelle et la fréquence respiratoire à l’aide d’une sonde thermique et d’une serviette respiratoire, respectivement. Maintenez la température corporelle à 36-37 °C et la fréquence respiratoire à 70-80 respirations par minute (bpm) en ajustant le niveau d’isoflurane.
4. Effectuez une vue de repérage pour déterminer la position de la souris. Ajustez la position du lit de la souris pour inclure tout le corps de la souris et pour vous assurer que le champ de vision central de MR est au centre du corps de la souris.
5. Sous Acquisition PET dans la fenêtre de la liste d’études , sélectionnez Plage de balayage lors de l’acquisition précédente pour utiliser la position de vue de repérage décrite ci-dessus. Cliquez sur Préparer pour déplacer le lit d’animaux de MR à PET. Sélectionnez OK pour lancer l’analyse TEP. Enregistrer la dose d’injection et le temps mesurés avant et après l’administration de [^18F]FDG dans l’éditeur radiopharmaceutique. Entrez le poids de la souris dans le menu Informations sur l’objet .
6. Une fois la TEP terminée, sélectionnez Préparer le passage à la RM et terminer toutes les acquisitions de RM dans la fenêtre de la liste d’études. Sélectionnez OK pour démarrer les analyses MR.
7. Une fois l’ensemble du flux de travail terminé, évaluez brièvement la qualité des images MR acquises à l’aide du logiciel de post-traitement (voir Tableau des matériaux). Cliquez sur le bouton Accueil pour déplacer le lit de la souris de MR à la position d’origine.
8. Retirez soigneusement la souris du scanner et retournez-la dans une cage de logement propre avec un coussin chauffant en dessous pour permettre la récupération dans un environnement chaud. Fournissez à la souris de la nourriture et de l’eau. Le système est maintenant prêt pour la prochaine souris en file d’attente.
9. Pour reconstruire les données, sélectionnez Acquisition PET dans le menu Raw Scan pour charger l’analyse PET terminée. Sélectionnez Acquisition MR pondérée T1 pour la création d’une carte des matériaux. Reconstruisez les données comme décrit ci-dessus (voir étape 2.5).
10. Suivez les réglementations locales et de l’institut concernant les soins et la manipulation de la souris d’imagerie post-TEP. Considérez toutes les seringues/aiguilles, gants, literie et matières fécales usagés comme des déchets radioactifs qui nécessitent une manipulation ou une élimination spéciale conformément à la réglementation locale.

5. Analyse post-imagerie

1. Ouvrez le logiciel d’analyse d’images (voir Table des matériaux) et cliquez sur Charger les données DICOM pour récupérer les images MR et PET correspondantes.
2. Effectuez la co-enregistrement des images MR et PET en les faisant glisser vers la fenêtre d’affichage. Cliquez sur la fonction Enregistrement automatique .
   1. Sélectionnez Transformation rigide dans le menu déroulant Configuration de l’enregistrement . Cochez Maj et Rotation dans le menu Rigide/Affine .
   2. Sélectionnez Acquisition MR pondérée T1 comme référence et Acquisition PET comme retranchement dans le menu Sélection globale des rôles .
   3. Inspectez l’enregistrement dans les trois dimensions pour vous assurer d’un alignement parfait entre les images MR et PET. Pour l’ajuster manuellement, cliquez sur Enregistrement manuel.
3. Utilisez le retour sur investissement de l’ellipse interpolée pour dessiner la VOI sur le tissu d’intérêt, c’est-à-dire l’iBAT et le tissu adipeux blanc inguinal (iWAT) en utilisant l’image MR comme référence. Utilisez l’outil Pinceau et l’outil Gomme pour définir la bordure VOI ; d’où l’anatomie des tissus. Assurez-vous qu’il n’y a pas de chevauchement en utilisant l’image PET pour éviter les débordements des organes voisins. Répétez le processus diapositive par diapositive jusqu’à ce que l’ensemble de la VOI soit délimité. Si nécessaire, modifiez les VOIs pour maintenir des volumes VOI cohérents entre chaque souris.
4. Utilisez Ellipsoid VOI pour dessiner un VOI de ^{3 mm3} sur le poumon comme organe de référence. Évitez tout débordement du cœur et des muscles voisins.
5. Une fois terminé, cliquez sur Afficher la table des retours sur investissement pour renommer chaque VOI. Enregistrez la radioactivité moyenne avec l’VOI et le volume tissulaire dans une feuille de calcul. Archivez les dessins VOI et les données d’imagerie sur un périphérique de stockage de données.
6. Calculez la valeur d’absorption normalisée (SUV) pour tous les VOI à l’aide de l’équation ^suivante11 :
   _SUVmean = radioactivité VOI en kBq / (Désintégration - dose injectée corrigée en kBq / poids corporel de la souris en kg), en supposant une densité tissulaire de 1 g / mL.

Résultats

Trois groupes de souris (n = 3 par groupe) ont subi une imagerie micro-TEP/IRM dans cette étude, où elles ont été logées à la thermoneutralité (30 °C) ou au froid (6 °C) pendant 7 jours. Un groupe de souris (n = 3) a vu son iBAT retiré (iBATx) avant le traitement par le froid (Figure 1A). Cette méthode a conduit à une altération de l’activité du tissu adipeux blanc chez les trois souris. En particulier, une augmentation remarquable de l’absorption de [^18F]FDG a ?...

Discussion

Dans cette étude, une imagerie et une quantification basées sur la TEP/IRM du tissu adipeux brun et beige fonctionnel chez un petit animal ont été décrites. Cette méthode utilise l’analogue du glucose non métabolisable [^18F]FDG comme biomarqueur d’imagerie afin d’identifier les tissus adipeux à forte demande en glucose de manière non invasive. L’IRM offre un bon contraste des tissus mous et peut mieux différencier les tissus adipeux des tissus mous et des muscles voisins. Lorsqu’il est comb...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sterile saline	BBraun		0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
Dose Calibrator	Biodex		Atomlab 500
Eye lubricant	Alcon Duratears		Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle
InterView Fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Isoflurane	Chanelle Pharma		Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
Metacam	Boehringer Ingelheim		5 mg/mL Meloxicam solution for injection for dogs and cats, 10 mL
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso		3 Tesla MR
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Wound clips	Reflex 7	203-100	7mm Stainless steel wound clips, 20 clips
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL