Cultivos de cortes organotípicos como modelos preclínicos del microambiente tumoral en cáncer de páncreas primario y metástasis

Resumen

Este protocolo describe la preparación de cultivos organotípicos de cortes (OTSC). Esta técnica facilita el cultivo ex vivo de tejido multicelular intacto. Las OTSC se pueden utilizar inmediatamente para probar su respectiva respuesta a los fármacos en un entorno multicelular.

Resumen

Se necesitan urgentemente modelos preclínicos realistas de cáncer de páncreas primario y metástasis para probar la respuesta terapéutica ex vivo y facilitar el tratamiento personalizado del paciente. Sin embargo, la ausencia de microambiente específico del tumor en los modelos utilizados actualmente, por ejemplo, las líneas celulares derivadas del paciente y los xenoinjertos, solo permite obtener información predictiva limitada. Los cultivos de cortes organotípicos (OTSC) comprenden tejido multicelular intacto, que se puede utilizar rápidamente para las pruebas de respuesta a fármacos resueltas espacialmente.

Este protocolo describe la generación y el cultivo de cortes tumorales viables de cáncer de páncreas y su metástasis. Brevemente, el tejido se funde en agarosa de bajo punto de fusión y se almacena en tampón isotónico frío. A continuación, se generan cortes de tejido de 300 μm de grosor con un vibrátomo. Después de la preparación, las rodajas se cultivan en una interfaz aire-líquido utilizando insertos de cultivo celular y un medio de cultivo adecuado. Durante el cultivo, se pueden controlar los cambios en la diferenciación celular y la viabilidad. Además, esta técnica permite la aplicación del tratamiento a tejido tumoral humano viable ex vivo y análisis posteriores, como el perfil del transcriptoma y el proteoma.

Las OTSC brindan una oportunidad única para probar la respuesta individual al tratamiento ex vivo e identificar perfiles transcriptómicos y proteómicos individuales asociados con la respuesta respectiva de distintos cortes de un tumor. Las OTSC se pueden explorar más a fondo para identificar estrategias terapéuticas que permitan personalizar el tratamiento del cáncer de páncreas primario y la metástasis.

Introducción

Los modelos preclínicos existentes de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) y sus respectivas metástasis son malos predictores de la respuesta al tratamiento en los pacientes, lo que supone un inconveniente importante en el desarrollo de fármacos y en la identificación de biomarcadores predictivos¹. Aunque modelos como los organoides derivados de pacientes y los xenoinjertos derivados de pacientes son prometedores, su uso sigue siendo limitado². Las principales limitaciones de estos modelos in vitro son la falta de microambiente tumoral y el xenoinjerto en especies inmunocomprometidas no humanas. Especialmente en PDAC y sus metástasis, el microambiente tumoral ha ganado considerablemente interés en los últimos años debido a sus funciones cruciales en la biología tumoral. Comprende componentes celulares y acelulares, como (mio)fibroblastos, células estrelladas pancreáticas, células inmunitarias, vasos sanguíneos, matriz extracelular, citocinas y factores de crecimiento³. Este microambiente no es un componente tumoral no funcional, sino que induce progresión tumoral y metástasis, y parece contribuir sustancialmente a la resistencia a la radiación y a la quimioterapia⁴. El microambiente PDAC no solo compromete mecánicamente la administración de fármacos, sino que también posee actividad inmunitaria y de eliminación de fármacos ^5,6,7. Por lo tanto, se necesitan urgentemente modelos preclínicos que reflejen la compleja interacción de las células tumorales y el microambiente tumoral para probar adecuadamente la respuesta al tratamiento ex vivo de los pacientes y guiar el tratamiento clínico individualizado.

Los cultivos ex vivo de muestras tumorales frescas representan una aproximación cercana del tumor in situ. Recientemente se han desarrollado y estudiado cultivos de cortes organotípicos (OTSC) para varios tumores, como los cánceres de cabeza, cuello, mama, próstata, pulmón, colon y páncreas 8,9,10,11,12. Se ha demostrado que las OTSC mantienen su morfología basal, actividad proliferativa y microambiente durante el cultivo durante un período definido y dependiente del tejido 11,12,13. Las OTSC de PDACs mantuvieron su viabilidad, morfología y la mayoría de los componentes de su microambiente tumoral durante 4-9 días en varios estudios in vitro ^5,12,14. Desde el punto de vista perspectiva, esta técnica permite una aplicación inmediata del tratamiento al tejido tumoral humano viable ex vivo y a los análisis posteriores, como el perfil del transcriptoma y el proteoma.

El establecimiento de OTSC ofrece una oportunidad única para probar la respuesta al tratamiento ex vivo inmediatamente después de la cirugía. De este modo, las OTSC permitirán identificar de forma prospectiva estrategias terapéuticas para personalizar el tratamiento de la enfermedad metastásica. Este protocolo describe la generación y el cultivo de OTSC viables para el cáncer de páncreas.

Protocolo

Las muestras de tejido fueron recolectadas y procesadas después de la aprobación del comité de ética local de la Universidad de Lübeck (# 16-281).

1. Recolección y manipulación de tejidos frescos

NOTA: Cada muestra de tejido humano no fijada debe manipularse con precaución para evitar el riesgo de infección por patógenos transmitidos por la sangre. Todos los pacientes deben ser examinados para dar negativo en las pruebas de VIH, VHB y VHC antes del procesamiento de los tejidos. Use una capa protectora y manipule las muestras de tejido humano con guantes.

1. Recoja muestras de tejido PDAC frescas, no fijadas y sin congelar con un tamaño mínimo de 0,4 x 0,4 cm inmediatamente después de la cirugía y transporte la muestra al laboratorio en una solución de almacenamiento de tejidos.
2. Cuando sea posible, procese el pañuelo fresco inmediatamente.
3. Alternativamente, almacene los pañuelos en una solución de almacenamiento de pañuelos sobre hielo húmedo a 4 °C durante la noche. Sin embargo, el almacenamiento de tejidos puede dar lugar a un deterioro de la viabilidad y, en general, debe evitarse.

2. Preparación

1. Preparación de agarosa de bajo punto de fusión
   1. Prepare 100 mL de agarosa de bajo punto de fusión (8%) disolviendo 8 g de agarosa en 100 mL de solución de Ringer precalentada y guárdela a 4 °C hasta que la necesite.
   2. Tras el anuncio de la resección del tumor, derrita la agarosa en un microondas.
   3. Colocar la agarosa en un baño de agua precalentado (37 °C) dejando que se enfríe a temperaturas fisiológicas antes de la preparación.
2. Configuración del vibratomo
   1. Coloque una hoja de afeitar en el soporte del vibratomo y realice un ajuste de ángulo automatizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, si corresponde.
   2. Enfríe la camisa de la cámara de corte con una unidad de enfriamiento o hielo húmedo.
   3. Llene la cámara de corte con aproximadamente 100 ml de una solución de corte fisiológica (por ejemplo, solución de Ringer).
   4. Coloque la hoja de afeitar montada en la solución de corte preenfriada, permitiendo que la hoja de afeitar se enfríe.

3. Inclusión de tejidos en agarosa de bajo punto de fusión

1. Lave la muestra de tejido con PBS enfriado (4 °C) y coloque el tejido en PBS en una placa de Petri grande (~14 cm) con hielo.
2. Elimine el exceso de tejido conectivo macroscópicamente visible en hielo con un bisturí, ya que podría impedir la eficiencia del corte.
3. Coloque el pañuelo en una placa de Petri pequeña (~3 cm).
4. Ajuste la orientación del tejido para que el tejido conectivo macroscópicamente visible restante tenga la misma orientación que el plano de la parte inferior de la placa de Petri. La parte inferior de la placa de Petri tiene la misma orientación que el plano de corte.
5. Vierta la agarosa de bajo punto de fusión preparada en la pequeña placa de Petri.
6. Vuelva a ajustar la orientación del tejido, si es necesario, con fórceps.
7. Coloque la placa de Petri sobre hielo húmedo para un endurecimiento más rápido de la agarosa.
8. Corta con cuidado el tejido con un bisturí, dejando al menos 5 mm de agarosa circundante a cada lado del tejido.
9. Transfiera con cuidado el tejido incrustado y péguelo en el portamuestras con superpegamento.
10. Después de unos segundos, coloque el portamuestras en la cámara de corte.
11. Ajusta la orientación del pañuelo hacia la hoja de afeitar, si es necesario.

4. Cortar el tejido incrustado en agarosa con un vibratomo

1. Defina los límites exteriores del rango de corte (eje y) de acuerdo con el tamaño de la muestra de tejido.
2. Ajuste la cuchilla hacia la parte superior del bloque de tejido.
3. Ajuste la velocidad de corte a 0,04 mm/s, la amplitud de corte a 1 mm y el grosor de la loncha a 300 μm.
4. Cortar con cuidado las primeras lonchas y transferirlas a un recipiente separado con una solución de corte preenfriada (4 °C) sobre hielo húmedo.

5. Cultivo de cultivos organotípicos en rodajas

1. Prepare una placa de 6 pocillos con 1 mL del medio de cultivo adecuado por pocillo.
   1. Medio A: DMEM/F12 avanzado, 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina.
   2. Medio B: RPMI 1640, 10% FBS, 1% Penicilina/estreptomicina, 4 μg/mL de insulina, 8 ng/mL de EGF, 0,3 μg/mL de hidrocortisona.
      NOTA: El medio para las condiciones óptimas de cultivo puede variar según el tejido y el paciente. Se compararon dos medios de cultivo de tejidos distintos, uno basado en DMEM/F12 (medio A) y el segundo basado en RPMI (medio B). No se detectaron diferencias sustanciales entre estos medios. Para todos los experimentos mostrados en este protocolo, se utilizó el medio A.
2. Coloque la placa de 6 pocillos con el medio en una incubadora, permitiendo que la temperatura y el pH se ajusten antes del cultivo.
3. Coloque las rodajas en insertos de cultivo celular (por ejemplo, insertos de PTFE hidrófilo con un tamaño de poro de 0,4 μm) utilizando un filtro de mirada.
4. Retire el exceso de solución de corte colocando el filtro cargado sobre un paño estéril.
5. Coloque el filtro cargado en la placa de 6 pocillos preparada. No agregue ningún medio adicional al inserto.
6. Coloque la placa de 6 pocillos en una incubadora (37 °C, 5% de CO₂).
7. Cambie el medio cada 2 días repitiendo los pasos 5.1, 5.2 y 5.5 con una nueva placa de 6 pocillos.
   NOTA: Los cultivos organotípicos en rodajas se pueden cultivar durante varios períodos dependiendo de la pregunta de investigación individual.

6. Ensayo de viabilidad de la resazurina

NOTA: El ensayo de viabilidad de la resazurina mide la actividad metabólica general de los cultivos de cortes organotípicos en función de la reducción de la resazurina azul no fluorescente a resorufina fluorescente roja en células vivas¹⁵. El ensayo no tiene efectos tóxicos en las células y se puede aplicar a los cultivos repetidamente dependiendo de la pregunta de investigación individual. La viabilidad se midió mediante el ensayo de resazurina cada 2-3 días.

1. Preparación de la solución madre de resazurina
   1. Apague la luz de la campana estéril, ya que la solución madre de resazurina es sensible a la luz.
   2. Prepare una solución madre con 10 mg/mL de sal sódica de resazurina en 1x PBS.
   3. Almacene la solución madre en alícuotas protegidas a la luz a 4 °C en el refrigerador hasta su uso.
2. Evaluación de la viabilidad global de las lonchas
   1. Apague la luz de la campana estéril, ya que la solución madre de resazurina es sensible a la luz.
   2. Diluir la solución madre de resazurina 1:250 con un medio adecuado.
      NOTA: El medio utilizado para la dilución debe ser el mismo que se utiliza para el cultivo (medio A o medio B).
   3. Prepare 1 mL de la solución final de resazurina por rebanada y agregue 1 mL adicional para el control en blanco, por ejemplo, para 6 rebanadas diluya 28 μL de solución madre de resazurina en 7 mL de medio.
   4. Dispensar la solución de resazurina en placas de 6 pocillos, con 1 mL de la solución de resazurina diluida por pocillo.
   5. Transfiera los filtros de cultivo con las rodajas a los pocillos con la solución de resazurina. Un pocillo con la solución de resazurina se mantiene vacío como control en blanco.
      NOTA: Para simplificar el procedimiento experimental, este paso puede combinarse con el cambio del medio (paso 5.7). Sin embargo, en caso de que se necesiten mediciones adicionales de viabilidad, el ensayo se puede realizar en cualquier momento durante el cultivo de los cultivos en rodajas.
   6. Coloque las rodajas de tejido en una incubadora durante 1 h a 37 °C y 5% de CO₂.
   7. Prepare nuevas placas de 6 pocillos con el medio de cultivo si se continúa con el cultivo en rodajas (consulte los pasos 5.1 y 5.2).
   8. Retire los filtros de cultivo con las rodajas de la solución de resazurina y elimine el exceso de solución colocando el filtro cargado sobre un paño estéril.
   9. Transfiera los filtros de cultivo con las rodajas a la placa de cultivo previamente preparada.
   10. De cada 6 pocillos, tome 100 μL de solución de resazurina y transfiérala a una placa de 96 pocillos. A partir del control en blanco, coloque tres muestras (3 x 100 μL) en pocillos separados de la placa de 96 pocillos.
   11. Cuantifique la extinción con un fotómetro de placa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La longitud de onda de excitación se establece en 545 nm y la longitud de onda de emisión se establece en 600 nm.

7. Fijación en formol e inclusión en parafina de OTSC

1. Transfiera con cuidado las rodajas de tejido cultivado a un casete de plástico para incrustar. Para ello, siga los pasos que se indican a continuación.
   1. Coloque el filtro de cultivo con la rebanada montada en una placa de Petri.
   2. Con un bisturí, corte con cuidado la membrana del filtro con la rebanada de tejido montada.
   3. Transfiera con cuidado la membrana del filtro con el corte montado a una bolsa de nailon de biopsia y colóquela en un casete de inclusión.
   4. A continuación, transfiera los casetes de plástico a un recipiente con formalina preenfriada (4 °C) al 4,5%. Las rodajas pueden conservarse en una solución de formol a 4 °C hasta su uso posterior, pero deben incubarse durante al menos 24 horas.
      NOTA: Los OTSC deben transferirse con mucha precaución, ya que se rompen fácilmente.
2. Enjuague cuidadosamente el cultivo en rodajas fijadas en formalina con agua corriente del grifo durante 1,5 h.
3. Deshidratar el corte de tejido fijado en formol mediante incubación en etanol al 70% (2x durante 3 h), etanol al 95% (1x durante la noche, 1x durante 3 h), seguido de etanol absoluto (1x durante 3 h, 1x durante la noche).
4. Limpie el corte de tejido fijado en formalina mediante una incubación de 3 h en xileno dos veces.
5. Sumerja el tejido con parafina a 60 °C (1 vez durante la noche, 1 vez durante 2 h). Incruste el tejido en un bloque de parafina en un molde de inclusión de tejido.
6. Seccionar el bloque de tejido embebido en parafina a 4 μm de espesor con un micrótomo y flotar en un baño de agua a 40 °C que contenga agua destilada. Transfiera las secciones a portaobjetos de vidrio.
7. Incubar secciones de parafina durante 1 h a 60 °C para unir el tejido al vaso. Incubar los portaobjetos durante la noche a 37 °C.

8. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)

1. Desparafinar las secciones del paso 7.7 mediante incubación en xileno (3 veces durante 5 min).
2. Rehidratarse por incubación en alcohol absoluto (2 veces durante 5 minutos), 95% de alcohol (2 veces durante 5 minutos) y 70% de alcohol (1 vez durante 5 minutos). Enjuague brevemente con agua destilada.
3. Tinción en solución de hematoxilina Mayer durante 5 min. Enjuague con agua corriente del grifo durante 10 minutos.
4. Contratinción en solución de eosina al 0,5% durante 40 s. Enjuague con agua destilada.
5. Deshidratar por incubación en alcohol al 70% (máximo 1 min), etanol al 95% (2x durante 3 min) y alcohol absoluto (2x durante 3 min), respectivamente.
6. Transparente en tres cambios de xileno (unos segundos cada uno). Coloque una gota de medio de montaje y cubra los portaobjetos con un cubreobjetos.

9. Inmunohistoquímica de las OTSC

1. Desparafinar las secciones mediante incubación en xileno 2x durante 10 min, seguido de etanol/xilol 1:1 durante 10 min.
2. Transfiera los portaobjetos a etanol al 100 % (2 veces durante 3 minutos), etanol al 96 % (2 veces durante 3 minutos), etanol al 70 % (1 vez durante 3 minutos) y luego a etanol al 50 % (1 vez durante 3 minutos).
3. Realice la recuperación de antígenos para desenmascarar el epítopo antigénico. Caliente los portaobjetos en un microondas en tampón de citrato durante 5 minutos a 900 W, seguido de 2 veces durante 8 minutos a 600 W. Deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente durante 20 minutos.
4. Lavar en PBS 3x durante 3 minutos en una coctelera.
5. Realizar la permeabilización de las membranas celulares por incubación en Triton X-100 al 0,1% en PBS (200 μL por portaobjetos) en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante 10 min.
6. Lave en PBS durante tres cambios, 3 minutos cada uno en la coctelera.
7. Incubar secciones con una solución de H₂O₂ al 3% en metanol (200 μL por portaobjetos) en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante 10 min para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena.
8. Lavar en PBS 3x durante 3 minutos en una coctelera.
9. Añadir 200 μL de tampón bloqueante (suero de caballo 1:50 en PBS) e incubar en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante 25 min.
10. Drene el tampón de bloqueo de los portaobjetos inclinando el portaobjetos sobre un pañuelo de papel.
11. Aplique 200 μL de anticuerpo primario adecuadamente diluido en diluyente de anticuerpos en los portaobjetos e incube en una cámara humidificada a 4 °C durante la noche. Como control negativo, utilice la isoforma apropiada de inmunoglobulinas de ratón en la misma dilución que el anticuerpo primario.
12. Lavar 3 veces durante 3 minutos en PBS en una coctelera.
13. Aplicar 200 μL de anticuerpo secundario biotinilado (solución 1:50 en PBS) sobre los portaobjetos e incubar en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante 30 min.
14. Lavar 3 veces durante 3 minutos en PBS en una coctelera.
15. Prepare el complejo de peroxidasa a base de avidina/biotina de acuerdo con las instrucciones del fabricante antes de la aplicación. Aplicar 200 μL de complejo avidina-biotina-peroxidasa en los portaobjetos e incubar en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante 30 min.
16. Lavar 3 veces durante 3 minutos en PBS en una coctelera.
17. Aplicar 200 μL de solución de sustrato DAB (recién hecha directamente antes de usar: 1 gota de DAB en 1 mL de sustrato), 200 μL por portaobjetos. Deje que el desarrollo del color sea de 1 a 3 minutos hasta que se alcance la intensidad de color deseada.
18. Enjuague con agua corriente del grifo durante 10 minutos.
19. Contratiñe los portaobjetos sumergiendo los lados en hematoxilina durante 5 min.
20. Enjuague con agua corriente del grifo durante 10 minutos.
21. Cubra los portaobjetos con un medio de montaje acuoso y cubreobjetos. Las guías montadas se pueden almacenar a temperatura ambiente de forma permanente.

Resultados

En la Figura 1 se proporciona una descripción general del flujo de trabajo para cultivar OTSC a partir de tejido tumoral fresco y no congelado. Los especímenes de PDAC primarios y metástasis se recolectaron directamente después de la resección quirúrgica y se almacenaron durante la noche en hielo húmedo a 4 °C en la solución de almacenamiento de tejido. Los especímenes se procesaron y las rodajas se cultivaron como se describe en el protocolo. La morfología macroscópica de cada O...

Discusión

Las OTSC de muestras tumorales frescas son una aproximación cercana del tumor in situ. Mantienen su morfología basal, actividad proliferativa y microambiente durante el cultivo durante un período definido y dependiente del tejido 11,12,13. Esta técnica permite la aplicación inmediata del tratamiento al tejido tumoral humano viable ex vivo y los análisis posteriores, como el perfil del transcriptoma y el p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F-12 Medium	Gibco	12634028
Agarose Low Melt	Roth	6351.2	8% in Ringer solution
Antibody Diluent, Background Reducing	Dako	S3022
AquaTex	Merck	108562
Bioethanol (99%, denatured)	CHEMSolute	2,21,19,010
Citric Acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signalling Technology	9664	1:400 dilution
Derby Extra Double Edge Safety Razor Blades	Derby Tokai
Embedding cassettes	Roth	H579.1
Eosin Y-solution 0,5% aqueous	Merck	10,98,44,100
Eukitt Quick hardening mounting medium	Sigma-Aldrich	3989
Fetal bovine serum	Gibco	10270106
Formaldehyde solution 4,5%, buffered	Büfa Chemikalien	B211101000
Hem alum solution acid acc. to Mayer	Roth	T865
Human EGF	Milteniy Biotec	130-097-794
Hydrocortisone	Sigma Aldrich (Merck)	H0888
Hydrogen peroxide 30%	Merck	1,08,59,71,000
Insulin human	Sigma Aldrich (Merck)	12643
Liquid DAB+ Substrate Chromogen System	Dako	K3468
MACS Tissue Storage Solution	Milteniy Biotech	130-100-008
Methanol	Merck	10.600.092.500
Microscope Slides Superfrost Plus	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	Millipore (Merck)	PICM0RG50
Monoclonal mouse anti-human  Cytokeratin 7 (Clone OV-TL 12/30)	Dako	M7018	1:200 dilution
Monoclonal mouse anti-human Ki67 Clone MIB-1	Dako	M7240	1:200 dilution
Monoclonal mouse Anti-vimentin (Clone V9)	Dako	M0725	1:200 dilution
Negative control Mouse IgG2a	Dako	X0943	1:200 dilution
Negative control Mouse IgG1	Dako	X093101-2	1:200 dilution
Paraffin (melting temperature 56°- 58°)	Merck	10,73,37,100
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140122
PBS pH 7,4 (1x) Flow Cytometry Grade	Gibco	A12860301
Resazurin sodium salt; 10 mg/ml in PBS	Sigma Aldrich	R7017	1:250 dilution
Ringer's solution	Fresenius Kabi	2610813
RPMI-1640 Medium	Sigma Aldrich (Merck)	R8758
Tissue culture testplate 6	TPP	92006
Triton X-100	Sigma Aldrich	9002-93-1
VECTASTAIN Elite ABC-Peroxidase Kit	Vector Laboratories	PK-6200
Xylene (extra pure)	J.T.Baker	8,11,85,000
Equipment
ClarioStar Microplate Reader	BMG Labtech
Paraffin Embedding Center E61110	Leica
Rotary Microtome Microm HM355S	Thermo Scientific
Section Transfer System Microm STS	Thermo Scientific
VT 1200S Vibratom	Leica