Органотипические культуры срезов в качестве доклинических моделей микроокружения опухоли при первичном раке поджелудочной железы и метастазировании

Резюме

В этом протоколе описывается приготовление органотипических культур срезов (OTSC). Этот метод облегчает культивирование ex vivo интактной многоклеточной ткани. OTSC могут быть немедленно использованы для проверки их соответствующей реакции на лекарства в многоклеточной среде.

Аннотация

Крайне необходимы реалистичные доклинические модели первичного рака поджелудочной железы и метастазов для проверки реакции на терапию ex vivo и содействия персонализированному лечению пациентов. Тем не менее, отсутствие опухолеспецифичного микроокружения в используемых в настоящее время моделях, например, в клеточных линиях, полученных от пациентов, и ксенотрансплантатах, позволяет получить лишь ограниченные прогностические данные. Органотипические культуры срезов (OTSC) включают в себя интактную многоклеточную ткань, которая может быть быстро использована для тестирования пространственно разрешенного лекарственного ответа.

Этот протокол описывает создание и культивирование жизнеспособных опухолевых срезов рака поджелудочной железы и его метастазирования. Вкратце, ткань отливают в агарозу с низким расплавлением и хранят в холодном изотоническом буфере. Затем с помощью вибратома генерируются срезы ткани толщиной 300 мкм. После получения срезы культивируют на границе воздух-жидкость с использованием вставок для клеточных культур и соответствующей среды для культивирования. Во время культивирования можно контролировать изменения в дифференцировке и жизнеспособности клеток. Кроме того, этот метод позволяет применять лечение к жизнеспособной опухолевой ткани человека ex vivo и последующим анализам, таким как профилирование транскриптома и протеома.

OTSC предоставляют уникальную возможность проверить индивидуальную реакцию на лечение ex vivo и идентифицировать индивидуальные транскриптомные и протеомные профили, связанные с соответствующей реакцией отдельных срезов опухоли. OTSC могут быть дополнительно изучены для определения терапевтических стратегий для персонализации лечения первичного рака поджелудочной железы и метастазов.

Введение

Существующие доклинические модели протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC) и соответствующих метастазов являются плохими предикторами ответа на лечение у пациентов, что является серьезным недостатком при разработке лекарственных препаратов и идентификации прогностических биомаркеров¹. Хотя такие модели, как органоиды, полученные от пациента, и ксенотрансплантаты, полученные от пациента, являются многообещающими, их использование остается ограниченным². Основными ограничениями этих моделей in vitro являются отсутствие микроокружения опухоли и ксенотрансплантат у нечеловеческих видов с ослабленным иммунитетом. Особенно в отношении PDAC и его метастазов, микроокружение опухоли в последние годы значительно возросло из-за его важнейших функций в биологии опухолей. Он включает в себя клеточные и бесклеточные компоненты, такие как (мио-)фибробласты, звездчатые клетки поджелудочной железы, иммунные клетки, кровеносные сосуды, внеклеточный матрикс, цитокины и факторы роста³. Это микроокружение не является нефункциональным компонентом опухоли, но индуцирует прогрессирование опухоли и метастазирование и, по-видимому, вносит существенный вклад^{в устойчивость к} радио- и химиотерапии. Микроокружение PDAC не только механически препятствует доставке лекарств, но и обладает иммунной и поглотительной активностью ^5,6,7. Таким образом, доклинические модели, отражающие сложное взаимодействие опухолевых клеток и опухолевого микроокружения, крайне необходимы для адекватной проверки реакции пациентов на лечение ex vivo и руководства индивидуализированным клиническим лечением.

Культуры ex vivo свежих образцов опухоли представляют собой близкое приближение опухоли in situ. Недавно были разработаны и изучены органотипические культуры срезов (OTSC) для лечения нескольких опухолей, таких как рак головы, шеи, молочной железы, предстательной железы, легких, толстой кишки и поджелудочной железы 8,9,10,11,12. Было показано, что OTSC сохраняют свою исходную морфологию, пролиферативную активность и микроокружение во время культивирования в течение определенного, тканезависимого периода 11,12,13. OTSC PDAC сохраняли свою жизнеспособность, морфологию и большинство компонентов опухолевого микроокружения в течение 4-9 дней в нескольких исследованиях in vitro ^5,12,14. С точки зрения перспективы, этот метод позволяет немедленно применить лечение к жизнеспособной опухолевой ткани человека ex vivo и последующим анализам, таким как профилирование транскриптома и протеома.

Создание OTSC дает уникальную возможность проверить реакцию на лечение ex vivo сразу после операции. Таким образом, OTSC в перспективе позволят определить терапевтические стратегии для персонализации лечения метастатического заболевания. Этот протокол описывает создание и культивирование жизнеспособных OTSC рака поджелудочной железы.

протокол

Образцы тканей были собраны и обработаны после одобрения местным комитетом по этике Университета Любека (# 16-281).

1. Сбор и обработка свежих тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: С каждым незафиксированным образцом ткани человека следует обращаться с осторожностью, чтобы предотвратить риск заражения патогенами, передающимися через кровь. Все пациенты должны быть протестированы на отрицательный результат теста на ВИЧ, ВГВ и ВГС до обработки тканей. Наденьте защитное пальто и обрабатывайте образцы тканей человека в перчатках.

1. Соберите свежий, незафиксированный и незамороженный образец ткани PDAC с минимальным размером 0,4 x 0,4 см сразу после операции и транспортируйте образец в лабораторию в растворе для хранения тканей.
2. По возможности немедленно обработайте свежую ткань.
3. В качестве альтернативы можно хранить салфетки в растворе для хранения тканей на влажном льду при температуре 4 °C в течение ночи. Тем не менее, хранение тканей может привести к нарушению жизнеспособности, и его следует избегать.

2. Подготовка

1. Легкоплавкий агарозный препарат
   1. Приготовьте 100 мл легкоплавкой агарозы (8%), растворив 8 г агарозы в 100 мл предварительно подогретого раствора Рингера, и храните при температуре 4 °C до тех пор, пока не понадобится.
   2. После объявления о резекции опухоли растопите агарозу в микроволновой печи.
   3. Поместите агарозу на предварительно нагретую водяную баню (37 °C), дав ей остыть до физиологической температуры перед приготовлением.
2. Настройка вибратома
   1. Поместите лезвие бритвы в держатель вибратома и выполните автоматическую регулировку угла наклона в соответствии с инструкциями производителя, если это применимо.
   2. Охладите рубашку режущей камеры с помощью охлаждающего агрегата или влажного льда.
   3. Заполните режущую камеру примерно 100 мл физиологического раствора для резки (например, раствора Рингера).
   4. Поместите установленное лезвие бритвы в предварительно охлажденный режущий раствор, дав лезвию бритвы остыть.

3. Заделка тканей в легкоплавкую агарозу

1. Промойте образец ткани охлажденным (4 °C) PBS и поместите ткань в PBS на большую (~14 см) чашку Петри на льду.
2. Удалите макроскопически видимые излишки соединительной ткани на льду с помощью скальпеля, так как это может помешать эффективности разреза.
3. Поместите салфетку в маленькую чашку Петри (~3 см).
4. Отрегулируйте ориентацию тканей таким образом, чтобы оставшаяся макроскопически видимая соединительная ткань имела ту же ориентацию, что и плоскость дна чашки Петри. Дно чашки Петри имеет ту же ориентацию, что и режущая плоскость.
5. Подготовленную малоплавкую агарозу вылить в маленькую чашку Петри.
6. При необходимости отрегулируйте ориентацию ткани с помощью щипцов.
7. Поставьте чашку Петри на влажный лед для более быстрого застывания агарозы.
8. Аккуратно разрежьте ткань с помощью скальпеля, оставив не менее 5 мм окружающей агарозы с каждой стороны ткани.
9. Аккуратно перенесите залитую ткань и приклейте ее на держатель образца с помощью суперклея.
10. Через несколько секунд поместите держатель образца в режущую камеру.
11. При необходимости отрегулируйте ориентацию салфетки по отношению к лезвию бритвы.

4. Срез залитой агарозой ткани с помощью вибратома

1. Определите внешние границы диапазона разреза (ось y) в соответствии с размером образца ткани.
2. Отрегулируйте лезвие по направлению к верхней части тканевого блока.
3. Установите скорость резки 0,04 мм/с, амплитуду реза 1 мм и толщину среза 300 мкм.
4. Аккуратно нарежьте первые ломтики и переложите срезы в отдельную емкость с предварительно охлажденным (4 °C) раствором для резки на влажном льду.

5. Культура органотипических срезовых культур

1. Приготовьте планшет на 6 лунок с 1 мл соответствующей среды для выращивания на лунку.
   1. Среда А: продвинутый DMEM/F12, 10% FBS, 1% пенициллин/стрептомицин.
   2. Среда В: RPMI 1640, 10% FBS, 1% пенициллин/стрептомицин, 4 мкг/мл инсулина, 8 нг/мл EGF, 0,3 мкг/мл гидрокортизона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда для оптимальных условий культивирования может варьироваться в зависимости от ткани и пациента. Сравнивали две различные среды для культивирования тканей, одну на основе DMEM/F12 (среда A), вторую на основе RPMI (среда B). Существенных различий между этими средами выявлено не было. Для всех экспериментов, показанных в этом протоколе, использовалась среда А.
2. Поместите 6-луночный планшет со средой в инкубатор, позволив отрегулировать температуру и pH перед выращиванием.
3. Поместите срезы на вставки для клеточных культур (например, гидрофильные вставки из ПТФЭ с размером пор 0,4 мкм) с помощью фильтра взгляда.
4. Удалите излишки режущего раствора, поместив загруженный фильтр на стерильную ткань.
5. Поместите загруженный фильтр в подготовленную 6-луночную пластину. Не добавляйте во вставку никаких дополнительных носителей.
6. Поместите 6-луночный планшет в инкубатор (37 °C, 5%_CO2).
7. Меняйте среду каждые 2 дня, повторяя шаги 5.1, 5.2 и 5.5 с новым 6-луночным планшетом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Органотипические культуры срезов могут культивироваться в течение различных периодов в зависимости от конкретного исследовательского вопроса.

6. Анализ жизнеспособности резазурина

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ жизнеспособности резазурина измеряет общую метаболическую активность органотипических культур срезов на основе восстановления нефлуоресцентного синего резазурина до красного флуоресцентного резоруфина в живых клетках¹⁵. Анализ не оказывает токсического воздействия на клетки и может быть применен к культурам повторно в зависимости от индивидуального исследовательского вопроса. Жизнеспособность измеряли с помощью анализа на резазурин каждые 2-3 дня.

1. Приготовление стокового раствора резазурина
   1. Выключите свет стерильной вытяжки, так как стоковый раствор резазурина светочувствительный.
   2. Приготовьте стоковый раствор с 10 мг/мл натриевой соли резазурина в 1x PBS.
   3. Храните стоковый раствор в защищенных от света аликвотах при температуре 4 °C в холодильнике до использования.
2. Оценка общей жизнеспособности среза
   1. Выключите свет стерильной вытяжки, так как стоковый раствор резазурина светочувствительный.
   2. Разбавьте стоковый раствор резазурина 1:250 соответствующей средой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда, используемая для разбавления, должна быть такой же, как и используемая для выращивания (среда А или среда В).
   3. Приготовьте 1 мл конечного раствора резазурина на каждый ломтик и добавьте еще 1 мл для контроля бланка, например, на 6 ломтиков разведите 28 мкл исходного раствора резазурина в 7 мл среды.
   4. Дозируйте раствор резазурина в 6-луночных планшетах, по 1 мл разбавленного раствора резазурина на лунку.
   5. Переложите фильтры для культивации с срезами в лунки с раствором резазурина. Одна лунка с раствором резазурина остается пустой в качестве контрольной заготовки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для упрощения экспериментальной процедуры этот шаг можно совместить со сменой среды (шаг 5.7). Тем не менее, в случае, если необходимы дополнительные измерения жизнеспособности, анализ может быть проведен в любое время во время выращивания срезовых культур.
   6. Поместите срезы ткани в инкубатор на 1 час при температуре 37 °C и 5%_CO2.
   7. Приготовьте новые 6-луночные планшеты с питательной средой, если культивирование срезов продолжается (см. шаги 5.1 и 5.2).
   8. Снимите культивационные фильтры со срезами из раствора резазурина и удалите излишки раствора, поместив загруженный фильтр на стерильную ткань.
   9. Переложите фильтры для культивации со срезами на заранее подготовленную тарелку для культуры.
   10. Из каждой 6-лунки возьмите 100 μл раствора резазурина и переложите его на 96-луночный планшет. Из пустого контроля поместите три образца (3 x 100 μL) в отдельные лунки 96-луночного планшета.
   11. Количественно оцените затухание с помощью пластинчатого фотометра в соответствии с инструкциями производителя. Длина волны возбуждения установлена на 545 нм, а длина волны излучения установлена на 600 нм.

7. Фиксация формалином и встраивание парафина в OTSC

1. Осторожно переложите срезы культивированной ткани в пластиковую закладную кассету. Для этого выполните следующие действия.
   1. Поместите фильтр для выращивания с установленным ломтиком на чашку Петри.
   2. Скальпелем аккуратно вырезаем фильтрующую мембрану с вмонтированным срезом ткани.
   3. Осторожно перенесите фильтрующую мембрану с установленным срезом в нейлоновый мешок для биопсии и поместите его в встраиваемую кассету.
   4. Впоследствии переложите пластиковые закладные кассеты в контейнер с предварительно охлажденным (4 °C) 4,5% формалином. Ломтики можно выдерживать в растворе формалина при температуре 4 °C до дальнейшего использования, но инкубировать следует не менее 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: OTSC нужно переносить с большой осторожностью, так как они легко разрываются.
2. Осторожно промойте культуру срезов, закрепленную формалином, проточной водой из-под крана в течение 1,5 ч.
3. Обезвоживайте фиксированный формалином срез ткани путем инкубации в 70% этаноле (2 раза в течение 3 часов), 95% этаноле (1 раз на ночь, 1 раз на 3 часа), а затем в абсолютном этаноле (1 раз на 3 часа, 1 раз на ночь).
4. Очистите фиксированный формалином срез ткани путем 3-часовой инкубации в ксилоле дважды.
5. Погрузите салфетку в парафин при температуре 60 °C (1x на ночь, 1x на 2 часа). Заложите ткань в парафиновый блок в форму для заделки ткани.
6. Разрежьте микротомом залитый парафином тканевый блок толщиной 4 мкм и поплавайте в водяной бане с температурой 40 °C, содержащей дистиллированную воду. Перенесите срезы на стеклянные предметные стекла.
7. Инкубируйте срезы парафина в течение 1 часа при 60 °C, чтобы ткань прилипла к стеклу. Инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре 37 °C.

8. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

1. Депарафинизируйте срезы с шага 7.7 путем инкубации в ксилоле (3 раза в течение 5 минут).
2. Повторно увлажните путем инкубации в абсолютном спирте (2 раза в течение 5 минут), 95% спирте (2 раза в течение 5 минут) и 70% спирте (1 раз в течение 5 минут). Коротко смойте дистиллированной водой.
3. Окрашивать в раствор гематоксилина по Майеру в течение 5 мин. Смыть проточной водой из-под крана в течение 10 минут.
4. Противокрасить в 0,5% растворе Эозина в течение 40 с. Смойте дистиллированной водой.
5. Обезвоживайте путем инкубации в 70% спирте (максимум 1 мин), 95% этаноле (2 раза в течение 3 мин) и абсолютном спирте (2 раза в течение 3 мин) соответственно.
6. Очистите в трех сменах ксилол (по несколько секунд каждое). Поместите каплю монтажного носителя и накройте слайды покровным стеклом.

9. Иммуногистохимия OTSC

1. Депарафинизируйте срезы путем инкубации в ксилоле 2 раза в течение 10 минут, а затем в соотношении 1:1 этанол/ксилол в течение 10 минут.
2. Переведите слайды на 100% этанол (2 раза на 3 минуты), 96% этанол (2 раза на 3 минуты), 70% этанол (1 раз на 3 минуты), а затем на 50% этанол (1 раз на 3 минуты).
3. Выполните забор антигена, чтобы демаскировать антигенный эпитоп. Нагрейте предметные стекла в микроволновой печи в цитратном буфере в течение 5 минут при 900 Вт, а затем 2 раза в течение 8 минут при 600 Вт. Дайте предметным стеклам остыть до комнатной температуры в течение 20 минут.
4. Стирать в PBS 3x в течение 3 минут на шейкере.
5. Пермеабилизацию клеточных мембран проводят путем инкубации в 0,1% Triton X-100 в PBS (200 мкл на предметное стекло) в увлажненной камере при комнатной температуре в течение 10 мин.
6. Стирать в PBS в течение трех смен, по 3 мин каждая на шейкере.
7. Секции инкубируют с 3% раствором_Н2О₂ в метаноле (200 мкл на предметное стекло) в увлажненной камере при комнатной температуре в течение 10 мин для блокирования активности эндогенной пероксидазы.
8. Стирать в PBS 3x в течение 3 минут на шейкере.
9. Добавьте 200 мкл блокирующего буфера (1:50 лошадиной сыворотки в PBS) и инкубируйте во увлажненной камере при комнатной температуре в течение 25 минут.
10. Слейте блокирующий буфер со стекол, наклонив предметное стекло на бумажной салфетке.
11. Нанесите на предметные стекла 200 мкл надлежащим образом разведенного первичного антитела в разбавителе антител и инкубируйте в увлажненной камере при 4 °C в течение ночи. В качестве отрицательного контроля используйте соответствующую изоформу мышиных иммуноглобулинов в том же разведении, что и первичное антитело.
12. Стирать 3 раза в течение 3 минут в PBS на шейкере.
13. Нанесите 200 мкл биотинилированного вторичного антитела (1:50 раствор в PBS) на предметные стекла и инкубируйте во увлажненной камере при комнатной температуре в течение 30 минут.
14. Стирать 3 раза в течение 3 минут в PBS на шейкере.
15. Перед применением приготовьте комплекс пероксидазы на основе авидина/биотина в соответствии с инструкциями производителя. Нанести 200 мкл авидин-биотин-пероксидазного комплекса на предметные стекла и инкубировать во увлажненной камере при комнатной температуре в течение 30 мин.
16. Стирать 3 раза в течение 3 минут в PBS на шейкере.
17. Нанесите 200 μL раствора DAB (свежеприготовленного непосредственно перед использованием: 1 капля DAB на 1 мл подложки), 200 μL на предметное стекло. Дайте проявиться цвету 1-3 минуты, пока не будет достигнута желаемая интенсивность цвета.
18. Смыть проточной водой из-под крана в течение 10 минут.
19. Защитите предметные стекла, погрузив бортики в гематоксилин на 5 минут.
20. Смыть проточной водой из-под крана в течение 10 минут.
21. Закройте слайды с помощью водного монтажного носителя и покровных стекол. Смонтированные горки можно постоянно хранить при комнатной температуре.

Результаты

На рисунке 1 представлен обзор рабочего процесса культивирования OTSC из свежей, незамороженной опухолевой ткани. Образцы первичных PDAC и метастазов собирали сразу после хирургической резекции и хранили в течение ночи на влажном льду при температуре 4 °C в тканевом раство?...

Обсуждение

OTSC свежих образцов опухоли представляют собой близкое приближение опухоли in situ. Они сохраняют свою исходную морфологию, пролиферативную активность и микроокружение во время культивирования в течение определенного, тканезависимого периода 11,12,13.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F-12 Medium	Gibco	12634028
Agarose Low Melt	Roth	6351.2	8% in Ringer solution
Antibody Diluent, Background Reducing	Dako	S3022
AquaTex	Merck	108562
Bioethanol (99%, denatured)	CHEMSolute	2,21,19,010
Citric Acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signalling Technology	9664	1:400 dilution
Derby Extra Double Edge Safety Razor Blades	Derby Tokai
Embedding cassettes	Roth	H579.1
Eosin Y-solution 0,5% aqueous	Merck	10,98,44,100
Eukitt Quick hardening mounting medium	Sigma-Aldrich	3989
Fetal bovine serum	Gibco	10270106
Formaldehyde solution 4,5%, buffered	Büfa Chemikalien	B211101000
Hem alum solution acid acc. to Mayer	Roth	T865
Human EGF	Milteniy Biotec	130-097-794
Hydrocortisone	Sigma Aldrich (Merck)	H0888
Hydrogen peroxide 30%	Merck	1,08,59,71,000
Insulin human	Sigma Aldrich (Merck)	12643
Liquid DAB+ Substrate Chromogen System	Dako	K3468
MACS Tissue Storage Solution	Milteniy Biotech	130-100-008
Methanol	Merck	10.600.092.500
Microscope Slides Superfrost Plus	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	Millipore (Merck)	PICM0RG50
Monoclonal mouse anti-human  Cytokeratin 7 (Clone OV-TL 12/30)	Dako	M7018	1:200 dilution
Monoclonal mouse anti-human Ki67 Clone MIB-1	Dako	M7240	1:200 dilution
Monoclonal mouse Anti-vimentin (Clone V9)	Dako	M0725	1:200 dilution
Negative control Mouse IgG2a	Dako	X0943	1:200 dilution
Negative control Mouse IgG1	Dako	X093101-2	1:200 dilution
Paraffin (melting temperature 56°- 58°)	Merck	10,73,37,100
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140122
PBS pH 7,4 (1x) Flow Cytometry Grade	Gibco	A12860301
Resazurin sodium salt; 10 mg/ml in PBS	Sigma Aldrich	R7017	1:250 dilution
Ringer's solution	Fresenius Kabi	2610813
RPMI-1640 Medium	Sigma Aldrich (Merck)	R8758
Tissue culture testplate 6	TPP	92006
Triton X-100	Sigma Aldrich	9002-93-1
VECTASTAIN Elite ABC-Peroxidase Kit	Vector Laboratories	PK-6200
Xylene (extra pure)	J.T.Baker	8,11,85,000
Equipment
ClarioStar Microplate Reader	BMG Labtech
Paraffin Embedding Center E61110	Leica
Rotary Microtome Microm HM355S	Thermo Scientific
Section Transfer System Microm STS	Thermo Scientific
VT 1200S Vibratom	Leica